Analyse de la MO par fluorimétrie 3D et pyrolyse GC-MS

Fluorimétrie 3D :

Cette étude est réalisée à l’aide d’un fluorimètre Fluorimax-2 sur des échantillons d’eau préalablement filtrée sur 0,22 µm (matière organique dissoute). Une matrice de fluorescence Emission-Excitation est obtenue après 51 scans (Figure 24).

Figure 24 : Matrice de fluorescence type d’une eau douce filtrée sur 0,22 µm obtenue à l’aide du logiciel Sigma plot.

L’intensité de fluorescence est mesurée pour des longueurs d’ondes d’excitation variant de 200 à 450 nm et des longueurs d’ondes d’émission variant de 300 à 600 nm. Pour s’affranchir des interférences liées à l’eau, il est nécessaire de soustraire le spectre de l’échantillon avec le spectre obtenu avec de l’eau ultrapure. Globalement, sur des eaux naturelles filtrées, 2 fluorophores apparaissent (Figure 24) : le pic A et le pic C correspondant

à des matières humiques d’origines terrestres. Les pics B (type tyrosine) et T (type tryptophane) correspondent à des sous produits microbiens et sont considérés plus généralement comme des marqueurs de l’activité biologique.

Pyrolyse GC-MS :

La méthode de pyrolyse est réalisée en laboratoire selon la méthode décrite par Bruchet en 1985. L’unité de pyrolyse est connectée à un chromatographe à phase gaz G1800A GCD System (Hewlett-Packard) couplé à un spectromètre de masse. Cette méthode consiste à placer quelques milligrammes d’extraits de matière lyophilisée dans un tube en quartz et à pyrolyser à 650°C pendant 20 secondes avec une montée en température de 20°C/ms obtenue grâce à un appareil pyroprobe 2000 (Chemical Data Systems, Oxford, Pa). La séparation des sous-produits de pyrolyse s’effectue dans une colonne capillaire SGE ID- BP 20 polaire de dimension 30 × 0,25 mm et un débit de gaz vecteur, Hélium 6 Messer, de 1 mL/min. La programmation de température varie de 50°C à 250°C, à une vitesse de 3°C par minute. La détection s’effectue par ionisation d’électrons détectant des masses allant de 40 à 425 m/z. Les spectres sont traités à l’aide du logiciel GCD Software et d’une base de données de spectre de masse. Sur les pyrochromatogrammes issus de l’analyse des MOD et des biofilms sont représentés les sous-produits de pyrolyse sous forme de pics, que l’on peut attribuer à une famille (sucres, protéines, lipides). Pour l’étude des biofilms, l’interprétation semi-quantitative des chromatogrammes est obtenue par la détermination des aires des principaux pics identifiés sur l’aire totale de tous ces pics.

II.5.7/ Fractionnement de la MO sur résine XAD-4 et XAD-8

Les matières organiques dissoutes sont fractionnées par passage sur des résines XAD- 8 (ester acrylique) et XAD-4 (styrène divinylbenzène) comme le montre la Figure 25.

Figure 25 : Protocole d’extraction de la matière organique dissoute à l’aide des résines XAD 8 et XAD 4

Dans un premier temps les eaux sont filtrées sur 0,22 µm afin d’enlever le carbone particulaire puis acidifiée avec quelques gouttes de HCl à 12 M jusqu’à l’obtention d’un pH proche de 2. Ensuite, un passage sur résine XAD-8 (25 mL de résine) du filtrat permet de retenir les fractions hydrophobes suivi d’un passage sur résine XAD-4 (25 mL de résine) afin de séparer les fractions transphiliques des fractions hydrophiles. Ainsi, des mesures de COD sont réalisées sur les eaux de sortie de chaque colonne. Ce protocole est appliqué sur les eaux d’alimentation (150 ml) et sur les eaux de récupération c’est à dire après passage au sein du bioréacteur (150 ml) après 10 jours de colonisation. Le débit est fixé à 1 mL/min au niveau de chaque colonne. Le fractionnement des eaux est alors appliqué en parallèle dans les mêmes conditions opératoires pour les eaux d’alimentation et de récupération afin de mettre en évidence des différences notables au niveau de la composition en carbone des eaux filtrées non fractionnées, des eaux sans la fraction hydrophobe (transphilique + hydrophile) et des fractions HPI seules. Les analyses suivantes sont réalisées sur les eaux fractionnées : le COD, l’azote dissous et la fluorimétrie 3D. Les résines sont régénérées par passage au goutte à goutte d’une solution de HCl à 0,1 N dans les colonnes (environ 2 L) suivi d’une solution de NaOH à 0,1 N (environ 2 L). A l’issu de la régénération des résines, une mesure de COD en sortie de colonnes est réalisée afin de vérifier si ces dernières ont été bien régénérées.

Résine XAD 8 Résine XAD 4 Eau filtrée Sur 0,22 µm Fraction hydrophobe Fraction transphilique Fraction hydrophile Fraction hydrophile Fraction hydrophobe Fraction transphilique

Entrée

_{Récupération}

Flitration sur 300 mL de résines XAD-8 et XAD-4 pour l’analyse de la MOD par pyrolyse CG-SM.

Dans un premier temps, il est nécessaire de filtrer sur une cartouche Polygard CR (membrane Millipore en polypropylène, seuil de coupure 10 µm) environ 40 L d’eau pour éliminer les grosses molécules, puis sur une cartouche Milligard (membrane Millipore en ester de cellulose (seuil de coupure 0,45 µm) afin de ne conserver que la partie dissoute. Ce protocole est appliqué sur l’eau prélevée au niveau de la station AV qui sert à alimenter le bioréacteur, et aussi sur les 2 derniers réservoirs de récupération (après passage dans le bioréacteur) contenant environ 20 L d’eau chacun. Les eaux sont acidifiées avec de l’acide chlorydrique concentré (12 M) afin d’obtenir un pH proche de 2. A pH acide, la matière organique a plus d’affinité avec la résine. Le protocole de fractionnement est similaire que précédemment avec un débit de 30 ml/min. Durant l’étape de filtration sur les résines, le COD est vérifié en sortie de chaque colonne. En fin d’expériences, un protocole d’extraction de la matière organique absorbée sur les résines est mis en œuvre. Dans un premier temps, le rinçage des résines a été effectué avec un volume d’acide formique à pH 2 (force éluante plus faible que l’eau ultrapure) correspondant à 4 fois le volume mort de la résine. Cette étape a pour objectif d’éliminer les minéraux retenus dans les colonnes. Les matières organiques sont alors éluées avec un mélange d’acétonitrile/eau (75 %/25 %). Une étape d’évaporation sous vide permet d’éliminer l’acétonitrile puis les échantillons sont congelés à – 20°C avant d’être lyophilisés.