Analyse microbiologiques :

L’intérêt de l’analyse microbiologique des eaux est de protéger l’environnement et surtout la santé humaine. Son objectif est d’effectuer un inventaire des germes présents mais surtout de rechercher celle qui sont susceptibles d’être pathogènes, qui sont en plus grand nombre souvent présentes dans l’intestin des mammifères et qui sont, par leur présence, indicatrices d’une contamination d’origine fécale comme les coliformes fécaux principalement les E.

colis. Par contre on peut noter que l’absence de contamination fécale ne laisse en rien présager l’absence de germes potentiellement pathogènes.

Ainsi, tout débute par l’acte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes propres à assurer l’absence de contamination de l’échantillon et la survie bactérienne (conditions de conservation). Nous avons ensuite le choix des techniques à appliquées et le choix de la recherche des bactéries indicatrices de pollution.

Réalisé et présenté par GOUNOU Boush-ra UAC/EPAC/GEn 17 Les différentes étapes de la recherche des bactéries en microbiologie sont :

 La préparation du milieu de culture à utiliser ;

 La préparation des boites de pétri;

 Le choix de la méthode d’ensemencement à utiliser.

Deux techniques de mise en culture ont été utilisées au laboratoire de microbiologie des eaux :

 La technique d’incorporation ;

 La technique de filtration sur membrane.

Techniques d’ensemencements

- Méthode par incorporation dans une gélose

La méthode d’incorporation est la seule utilisée pour la numération des germes banals. Elle est aussi la plus, fréquemment utilisée pour le contrôle microbiologique des eaux brutes et des sources non aménagées ou non protégées. Elle se fait sur l’échantillon en l’état ou après dilution selon la charge de l’échantillon.

Principe : avec cette méthode, les bactéries sont maintenues dispersées dans un milieu solide.

Elles donnent naissance dans des conditions favorable, à des colonies isolées les unes des autres. Connaissant le volume d’échantillon ensemencé, il est possible d’exprimer le résultat final du dénombrement en fonction d’un volume d’eau pris comme unité. Par exemple, x colonies pour 1 ml ou y colonies pour 100 ml.

Mode opératoire de l’incorporation dans la gélose Identifier une boite de 90 ou de 100 mm de diamètre ; Mettre aseptique 1 ml, 2 ml ou 5 ml d’eau à analyser ;

Ajouter environ 15 ml de milieu gélosé, fondu et ramener à une température de 47°C environ ;

Mélanger aussitôt en décrivant plusieurs fois sur la paillasse le chiffre 8 avec la boîte de pétri tout en évitant de faire monter le contenu dans le couvercle ;

Laisser solidifier à la température adéquate et pour la durée recommandée.

Quand la culture est ainsi faite, les colonies isolées les unes des autres peuvent être directement comptées.

Méthode par filtration sur membrane filtrante

La méthode de filtration sur membrane cellulosique stérile, de porosité 0,45 micron est recommandée par la norme béninoise pour détecter tous les germes sauf les germes banals

Réalisé et présenté par GOUNOU Boush-ra UAC/EPAC/GEn 18 dans l’eau de consommation. Cette porosité permet à la membrane de retenir les bactéries et de laisser passer les molécules d’eau. Cette technique est recommandée pour la microbiologie des eaux traitées. L’ensemble du matériel, qui permet cette opération est appelé : rampe de filtration.

Principe : la technique consiste à faire passer un plus grand volume d’eau à analyser à travers la membrane que l’on récupère aseptiquement à l’aide d’une pince flambée et que l’on dépose sur la gélose identifiée et solidifiée en plaque. Les bactéries retenues à la surface de la membrane sont nourries à travers les pores de cette dernière.

Mode opératoire de la filtration sur membrane

Flamber la face supérieure (plaque poreuse) de l’appareil et laisser refroidir ; Fermer le robinet du support ;

Prélever une membrane stérile en la laissant par son bord extérieur, à l’aide d’une pince flambée et refroidir la déposer sur la plaque poreuse ;

L’entonnoir- réservoir flambée et refroidi est placé au-dessus de la membrane et fixer ;

Homogénéiser l’échantillon en agitant soigneusement le flacon ou le sachet plastique et verser l’eau, aseptiquement dans le réservoir jusqu’au repère voulu 50 ou 100 ml ;

Mettre en marche la pompe à vide ;

Ouvrir le robinet du support suffisamment pour laisser l’eau s’écouler lentement sous l’action du vide ;

Dès que la membrane parait sèche, fermer en la saisissant par son extrême bord, et la déposer sur le milieu de culture choisi.

On la déposera sur la gélose rapide E. coli pour la recherche de coliformes et des Escherichia colis ou sur un tampon imbibé de bouillon lauryl pour la recherche des coliformes uniquement.

L’incubation

Elle consiste à faire la culture des germes ensemencés à une température donnée et à l’obscurité pendant un temps défini. L’appareil utilisé est l’incubateur.

Lecture des colonies

Au bout du temps d’ensemencement, les colonies obtenues si l’eau en contient prennent des colorations qui dépendent du milieu de culture utilisé. Parfois, la confirmation est utile pour s’assurer de la présence de certains germes.

Réalisé et présenté par GOUNOU Boush-ra UAC/EPAC/GEn 19 Description de quelques recherches courant faites au laboratoire

Le dénombrement de la flore totale ou germes banaux dans l’eau de consommation La flore aérobie totale est l’indicateur de l’état hygiénique de l’eau. La dégradation de la qualité de l’eau potable commence par la croissance de cette flore microbienne.

En réalité, il est onéreux de mettre en évidence la présence des germes indésirables bien spécifiques dans l’eau. C’est pourquoi les recherches commencent par la recherche des germes banals. Ces germes banals sont aussi appelés germes témoins ou germes-tests de contamination microbienne.

Mode opératoire

En général, nous procédons à un dénombrement direct par numération des colonies après un ensemencement sur (ou dans) la gélose plate count agar (PCA).

La méthode consiste à mélanger dans une boite de pétri de 90 à 100 mm de diamètre, 1 ml d’échantillon et 15 ml environ de milieu PCA, fondu et ramené à une température de 47.5°C environ. Le nombre maximum de colonies acceptable pour éviter les phénomènes de compétition entre les bactéries est généralement estimé à 300. Pour avoir une plus grande précision, il conviendra donc de procéder à des dilutions avec de l’eau distillée stérile. Les colonies sont dénombrées après 24 ou 48 heures d’incubation à 37°C. Le nombre de germes par volume d’échantillon est alors égal au nombre compté puis multiplié par le facteur de dilution si nécessaire.

Dénombrement des coliformes fécaux et des Escherichia coli dans l’eau de consommation.

Les coliformes appartiennent à la famille des entérobactéries. Ils comprennent les germes : Escherichia, nitrobacter, yersinias, klebsiella.

o Le terme de « coliformes fécaux »ou de « coliformes thermo tolérants » correspond à des coliformes présentant les mêmes propriétés après incubation de 24 h à 44°C sur le milieu rapide E. coli.

Réalisé et présenté par GOUNOU Boush-ra UAC/EPAC/GEn 20 Le tableau suivant montre les milieux de culture et germe correspondant ainsi que la température et la période d’incubation.

Tableau I : Milieux de culture et germe correspondant

1.3 Résultats d’analyses et discussion