Analyse comparative des isoformes TRXo1 et TRXo2 d’ A. thaliana

Chez les organismes photosynthétiques, les TRXs forment une famille multigénique

d’environ 40 membres mais seules les isoformes TRXh2 et TRXo sont retrouvées dans les

mitochondries. En comparaison des TRXs chloroplastiques, les rôles moléculaires et

physiologiques des TRXs mitochondriales sont encore peu caractérisés, bien que de

nombreuses protéines mitochondriales soient supposées ou identifiées comme sensibles à des

modifications post-traductionnelles réversibles redox et qu’une centaine de partenaires

potentiels ont été identifiés pour l’isoforme TRXo1 d’A. thaliana (Yoshida et al., 2013).

Contrairement à la plupart des autres espèces végétales, en plus de TRXh2, A. thaliana possède

deux isoformes TRX de type o, TRXo1 et TRXo2, TRXo1 étant la principale isoforme (Yoshida

& Hisabori, 2016). D’autre part, bien que les simples et double mutants perte de fonction n’aient

pas de phénotype prononcé en conditions standard de croissance, une dérégulation de l'activité

des enzymes du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA), ou des enzymes associées, avait été

rapporté pour le mutant perte de fonction trxo1 d’A. thaliana (Daloso et al., 2015). Récemment

AtTRXh2et AtTRXo1 ont été reliées à la régulation redox de la photorespiration (Reinholdt et

al., 2019 ; Da Fonseca Pereira et al., 2020). En absence d’éléments pouvant expliquer leur

redondance ou leur spécificité, nous avons entrepris une étude structure-fonction des protéines

AtTRXo1 et AtTRXo2 (Zannini et al., 2018, P38).

Lorsqu'elles sont exprimées dans E. coli, ou après des expériences de reconstitution in

vitro, les deux protéines recombinantes existent sous une forme apo-monomérique et une forme

homodimérique liant un centre [4Fe-4S] (Figure 21). Cette observation était inattendue car ces

deux TRXs possèdent un site actif classique WCGPC préalablement connu pour être

défavorable à l’incorporation d’un centre Fe-S et que les travaux précédents réalisés avec

AtTRXo1 ne mentionnaient pas la présence de ce cofacteur (Yoshida et al., 2013). Ces protéines

ne possédant que deux résidus cystéine et l’absence de centre Fe-S dans les variants

monocystéiniques suggèrent que ce sont bien les deux cystéines du site actif qui sont les ligands

du centre Fe-S.

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Figure 21. Reconstitution in vitro du centre Fe-S des isoformes TRXo d’Arabidopsis

thaliana. Ces expériences ont été réalisées en utilisant la cystéine désulfurase IscS d’E. coli.

Les spectres UV–visible des isoformes TRXo2 (A) et TRXo1 (B) ont été analysés avant (ligne

rouge) et après (ligne bleue) reconstitution en condition anaérobie. L’état d’oligomérisation de

TRXo2 (C) et TRXo1 (D) ainsi reconstituées a été analysé par gel filtration après dépôt de 100

à 300 µg sur une colonne Superdex S200 10/300. La présence respective du polypeptide et du

centre Fe-S a été détectée en mesurant l’absorbance à 280 nm (ligne bleue) et à 420 nm (ligne

rouge). Le pic d’élution à 16 ml correspond à la forme dimérique et le pic d’élution observé à

17 ml représente la forme monomérique des protéines TRXo.

Malgré plusieurs tentatives, la résolution de la structure 3D de la forme homodimérique

des deux isoformes est restée infructueuse et n’a pas permis de confirmer et la nature des ligands

de façon certaine. La résolution de la structure de la forme apo-monomérique n’a pas mis en

évidence de différences fondamentales avec les autres TRXs pouvant expliquer la faculté de

lier un centre Fe-S. Par contre, la comparaison de la structure des deux isoformes AtTRXo1 et

AtTRXo2 a révélé des différences marquées dans la répartition des charges de surface,

notamment dans certains domaines impliqués dans les interactions protéine-protéine avec des

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protéines partenaires. Parmi les 101 partenaires présumés de TRXo1 identifiés lors d'une

analyse protéomique (Yoshida et al., 2013), les protéines NFU4 et NFU5 ont retenu notre

attention car elles étaient des protéines d’intérêt du projet de thèse de Jonathan

Przybyla-Toscano (section 1.1 page 53). Ce sont des protéines de transfert de centre Fe-S impliquées

dans les étapes tardives de la maturation des protéines Fe-S mitochondriales. Cette fonction est

notamment associée au motif conservé CxxC permettant la fixation transitoire d’un centre

Fe-S. Ainsi, ces protéines doivent être sous forme réduite afin de pouvoir recevoir ce cofacteur.

Sous apoforme, TRXo1 et o2 réduisent les protéines NFU4/5 in vitro contrairementà GRXS15

une autre réductase potentielle au sein des mitochondries (Figure 22).

Figure 22. Le pont disulfure intramoléculaire des isoformes NUF4/5 est réduit par les

TRXos mais pas par la GRXS15. La réduction des protéines NFU4 (A) et NFU5 (B) a été

évaluée après 15 min d’incubation en présence de différents systèmes réducteurs : NTR

(NADPH + NTR), TRXo1 (NADPH + NTR + TRXo1), TRXo2 (NADPH + NTR + TRXo2),

GR/GSH (NADPH + GR + GSH) et GRXS15 (NADPH + GR + GSH + GRXS15). Les

protéines ont ensuite été alkylées avec mPEG maleimide 2 kDa, puis séparées sur un gel

SDS-PAGE 15%. Les formes réduite (Red) et oxydée (Ox) des protéines ont été utilisées comme

contrôle. Les formes alkylées (*) et non alkylées (**) des différentes oxydoréductases utilisées

sont également visibles dans certains cas (Zannini et al., 2018, P38).

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De manière intéressante d’autres protéines (NFS1, ISCA4, ISU1) impliquées dans la

maturation des protéines Fe-S mitochondriales ont été identifiées comme partenaires potentiels

de TRXo1 (Yoshida et al., 2013). Ceci soulève la question de l’implication potentielle de

TRXo1 et o2 dans la réduction de ces protéines dans des conditions où celles-ci seraient

transitoirement oxydées. Cette observation n’est pas sans rapport avec l’étude précédente

d’AtGRXS16 dans laquelle nous avons montré que cette protéine reliée à la biogenèse des

centres Fe-S chloroplastique est réduite par le système FTR/TRX (Zannini et al., 2019, P39).

De manière intéressante, une analyse protéomique des partenaires des TRXs chloroplastiques

de Chlamydomonas reinhardtii a identifié plusieurs protéines (NFU1/2/3, SUFB/C/D, et SUFS)

appartenant à cette machnierie d’assemblage (Pérez-Pérez et al., 2017). Ainsi, le contrôle de

l'état redox des protéines impliquées dans la biogénèse des centres Fe-S par le système TRX

pourrait être un mécanisme général au sein des organites mais également au sein des

organismes.

3. Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans la mobilisation et le transfert

d’atomes de soufre chez les plantes

3.1 Analyse fonctionnelle des protéines impliquées dans la mobilisation et le