Analyse ciblée de gènes nucléaires

3.5.3.1. Analyse de gènes impliqués dans la digestion

Dans ce même article (Axelsson et al., 2013), il apparaissait qu’il y avait eu une sélection spécifique de gènes impliqués dans la digestion de l’amidon lors de la domestication du loup.

Nous nous sommes focalisés sur deux gènes : MGAM qui catalyse l’hydrolyse du maltose en glucose et SLC5A1 qui code pour le co-transporteur sodium/glucose 1. Les

0 2 4 6 8 10 12 Développement du système immunitaire

développement embryonnaire Régulation de l'expression des gènes Biosynthèse des acides gras Métabolisme des acides gras Reproduction Communication cellulaire Morphogenèse Processus du système nerveux Métabolisme des acides aminés, des nucleobases, des …

Régulation de la transcription Mort programmée Régulation de l'activité de transcription Régulation positive des processus biologiques Régulation négative des processus biologiques Développement des organes Développement du système nerveux

lectures des 3 banques ont été alignées sur le génome nucléaire du chien (CanFam2) grâce au logiciel IGVTools. Trois mutations ont été analysées pour le gène MGAM (SNP 7 125 201, SNP 7 156 695 et SNP 7 164 842) et une pour le gène SLC5A1 (SNP 24 934 536). Pour chaque mutation d’intérêt, l’analyse globale a été complétée par des réactions de PCR ciblant les régions des gènes concernés afin de confirmer nos informations. Les fréquences des haplotypes de chiens et de loups actuels ont été comparées aux informations trouvées pour le canidé de Chauvet ; le chacal est utilisé comme groupe externe. Les données pour les chiens et loups ont été recueillies à partir de l’article d’Axelsson et al. (2013) et les données pour le chacal à partir de l’article de Freedman et al. (2014).

Figure 48. Fréquence des génotypes pour les 3 mutations de MGAM et celle de SCL5A1 (MGAM 1 : SNP

16:7 125 201 ; MGAM 2 : SNP 16:7 156 695 ; MGAM 3 : SNP 16:7 164 842 et SLC5A1 : SNP 26:24 934 536) pour le chien, le loup, le chacal et le canidé de Chauvet.

Chien Loup CCH3 Chacal 1.0 0.6 0.4 0.8 0.2 0.0 1.0 0.6 0.4 0.8 0.2 0.0 1.0 0.6 0.4 0.8 0.2 0.0 1.0 0.6 0.4 0.8 0.2 0.0 Δ TG TG CA MGAM 1 SCL5A1 G A A A G A A A G A A A A G MGAM 2 MGAM 3

Pour les 4 SNPs étudiés, le canidé de Chauvet présente le même allèle, la version ancestrale, que le chacal. Dans deux cas, les chiens ont un allèle dérivé qui leur est propre et qui a dû être sélectionné durant la domestication (le SNP 7 125 201 et le SNP 7 156 695) selon l’article d’Axelsson. Il est à noter qu’une partie des loups possèdent le même allèle que les chiens pour le SNP 7 156 695, même s’il n’est pas majoritaire. Cette observation pourrait être due à des hybridations postérieures à l’apparition de la mutation chez les chiens. Pour le SNP 7 164 842, les loups présentent un taux d’allèle dérivé élevé alors que les chiens et le canidé de Chauvet portent la version ancestrale du gène. Enfin, pour le gène SCL5A1 (SNP 24 934 536), la séquence du spécimen de Chauvet présente un allèle identique à celui des loups et du chacal, ce qui pourrait être corrélé à une alimentation carnivore plutôt qu'omnivore.

Nous nous sommes également intéressés au gène AMY2B qui code l'amylase et dont un nombre élevé de copies correspondrait, pour certains auteurs, à une alimentation omnivore. Pour connaître le nombre de copies de ce gène chez notre spécimen, nous avons aligné les lectures des 3 banques sur la séquence du gène et calculé son taux de couverture. Celui-ci équivaut à 0,6 X, ce qui est identique à la couverture globale du génome nucléaire. Le canidé de Chauvet ne présente donc pas de multiples copies du gène de la synthèse de l’amylase.

Ces différentes observations permettent de penser que le spécimen de la Grotte Chauvet-Pont d’Arc était plus adapté à un régime carné qu’à une alimentation omnivore. L’analyse de son bol alimentaire lors d'analyses ultérieures nous l’a d’ailleurs confirmé.

3.5.3.2. Analyse des gènes déterminant la couleur du pelage

Après les gènes impliqués dans la digestion de l’amidon, nous avons analysé les gènes jouant un rôle dans la couleur du pelage (Candille et al., 2007). Cette dernière est principalement définie par 3 gènes : MC1R qui code le récepteur de la mélano-cortine de type 1, CBD103 qui code la -défensine103 et ASIP qui code la protéine Agouti. Les mutations analysées sont : celle de MC1R où le codon 306 code une arginine (allèle sauvage) ou comporte un stop (allèle muté), celle de CBD103 où le codon 23 détermine une glycine (allèle sauvage) ou bien est absent (G23, muté), et celle de ASIP où pour l’acide aminé 96 une arginine (sauvage) est remplacée par une cystéine (muté). L'allèle portant la mutation G23est dominant et celle-ci augmente l’affinité de la -défensine103 pour le récepteur

MC1R ce qui entraîne la production d’eumélanine et donc un pelage noir. L'allèle muté pour ASIP est responsable aussi d'un pelage noir mais cette mutation est récessive. La mutation de l'allèle de MC1R n’apporte aucun changement de couleur de pelage.

Dans un premier temps, les lectures des 3 banques ont été alignées sur des séquences chimères, où les allèles mutés et non mutés des trois gènes ont été fusionnés. Pour les mutations respectives G23 et AAC96R des gènes CBD103 et ASIP, une lecture unique a été trouvée en faveur des versions sauvages dans les deux cas. Aucune lecture ne s’est alignée pour la mutation du gène MC1R, que ce soit sur l'allèle sauvage ou l'allèle muté.

Afin de compléter ces données, des amorces spécifiques, encadrant les mutations d’intérêt de ces 3 gènes, ont donc été sélectionnées et des amplifications d’ADN ont été réalisées. Dans les trois cas les amplifications ont été réalisées avec succès, ce qui est remarquable pour de l’ADN ancien compte tenu qu’il s’agit de gènes présents à raison de deux copies seulement par cellule, et confirme la bonne préservation de l’ADN dans le coprolithe. Les PCR ont permis de confirmer les génotypes vus par alignement de lectures ; ce sont bien les versions sauvages des allèles. La mutation ΔG23 du gène CBD103 étant dominante, nous avons réalisé une centaine de réactions PCR – avec à chaque fois, le séquençage de 8 clones minimum - afin de nous assurer que nous avions bien uniquement des allèles de version sauvage, et non pas une version mutée et une version sauvage. Les réactions de PCR ont également permis d’obtenir des informations pour l’allèle du gène MC1R : c’est la version sauvage que l'on trouve chez le canidé de Chauvet (Figure 49).

Figure 49. Récapitulatif des haplotypes pour les mutations touchant l’acide aminé 306 du gène MC1R, le triplet

n°23 du gène CBD103 et l’acide aminé 96 du gène ASIP.

Le fait que le canidé de Chauvet possède les versions sauvages des allèles pour ces 3 gènes - MC1R, ASIP et CBD103 - permet de conclure que son pelage était de couleur claire, probablement grise. Cette observation est en accord avec une étude montrant que la mutation

MC1R CBD103 ASIP Allèle sauvage Allèle dérivé Chauvet G23 ΔG23 G23

AA96R AA96C AA96R AA306R codon stop AA306R

pour le pelage noir est apparue ultérieurement (Ollivier et al., 2013), tout d'abord chez les chiens domestiques avant de se transmettre au loup par hybridation.