Amplification spécifique de la séquence de MST1

d’association sont situées dans cette région dupliquée et que les amorces conçues pour amplifier la séquence de MST1 peuvent aussi amplifier la séquence des duplications sur le chromosome 1 il est clair que cette situation explique la faible qualité du génotypage que nous avons obtenu dans cette région. Plus précisément, lors de l’amplification et du génotypage des variantes dans la région, l’amplification en parallèle des séquences du chromosome 1 avec celle du chromosome 3 cause une sur-représentation de certains "allèles" retrouvés sur le chromosome 1 et un déplacement des groupes dans les graphiques d’agrégation rendant difficile la détermination des génotypes par les logiciels de la plate-forme de génotypage. De plus, plusieurs variantes publiées dans les bases des donnés publiques de SNP pour le gène MST1 semblent en fait n’être que des différences nucléotidiques entre la séquence de MST1 sur le chromosome 3 et celles des duplications

sur le chromosome 1. À l’aide de l’alignement des séquences, ces différences entre les chromosomes ont pu être discernées des véritables SNP de MST1. Ainsi, des 36 SNP de

MST1 disponibles dans la banque de données dbSNP (construction NCBI36) au moment

de cette expérience, 6 étaient clairement des différences entre les duplications, et 21 étaient des différences entre le chromosome 1 et le chromosome 3. Aussi, 13 des variantes génotypées dans nos premiers essais étaient en fait des différences entre le chromosome 3 de référence et les duplications, tandis que 7 des 30 des variantes génotypés étaient en fait des variantes retrouvées sur seulement une des 2 duplications, donc des différences entre les duplications et la séquence du chromosome 3. Il a donc fallu concevoir des amorces spécifiques à la séquence de MST1 sur le chromosome 3 afin de permettre le génotypage des SNP dans cette région. En prenant avantage des divergences entre les séquences dupliquées et d’origine, nous avons conçu 3 paires d’amorces spécifiques couvrant les régions contenant la plus grande densité de variantes de MST1 à tester. Chacune des trois paires d’amorces spécifiques au chromosome 3 a été validée par PCR sur différents échantillons contrôle, soit de l’ADN génomique humain, soit de l’ADN provenant de génome hybride de rongeur et contenant soit le chromosome 1 ou 3 humain. De plus, des amorces spécifique à des séquences du chromosome 1 et 3 mais à l’extérieur des régions concernées par les duplications ont été utilisées comme contrôles positifs pour évaluer les amplifications spécifiques. Afin d’identifier la température d’hybridation qui permet une hybridation optimale de ces amorces à la séquence de 3p21 et qui limite l’hybridation sur les séquences dupliquées, chaque réaction a été évaluée dans une série de températures d’hybridation différentes lors du PCR (fig. 7). Les trois paires d’amorces du chromosome 3 semblent offrir une amplification spécifique à des températures entre 55-60ºC puisque qu’on voit y voit une forte amplification en présence du chromosome 3 et qu’on ne voit que de faibles produits d’amplification non-spécifiques à des températures d’hybridation <55ºC en présence du chromosome 1. De plus, aux mêmes températures d’hybridation, les amorces contrôles qui sont spécifiques aux chromosomes 1 et 3 semblent donner un seul produit d’amplification dans les lignées hybride contenant le chromosome 1 et 3 respectivement.

Puisque ces amorces semblent amplifier de façon spécifique les séquences du chromosome 3, elles ont été utilisées dans une expérience de génotypage comparative à petite échelle sur une sélection de variantes de MST1.

1 2 3 Chr 1 Chr 3 50 55 60 65 °C 50 55 60 65 50 55 60 65 50 55 60 65

H

O

Génome hy

bride

rongeur-ch

r3

hum

ain

Génome

hum

ain

Génome hy

bride

rongeur-ch

r1

hum

ain

Figure 7: Électrophorèse de produits d’amplification de génomes humains ou hybrides rongeur-humain chr1 ou chr3.

Les génomes ont été amplifiés à l’aide de paires d’amorces contrôles s’hybridant à l’extérieur des séquences dupliquées, ou avec les paires d’amorces conçues pour être spécifiques au chromosome 3. Les amplifications ont été faites à des températures d’hybridation de 50, 55, 60 ou 65°C.

Afin d’évaluer la spécificité de l’amplification de la région entourant MST1 lors des génotypages sur la plateforme Sequenom, des variantes étant clairement des différences nucléotidiques entre les séquences dupliquées ont été génotypées chez 19 individus de la cohorte de témoins sains de la collection CEPH (annexe A) avec soit les amorces spécifiques à la région de MST1, soit des amorces conçues de façon classique avec le logiciel Assay Design. D’autres variantes ont également été testées sur ces mêmes échantillons avec ces amorces afin de déterminer si elles étaient véritablement des variantes de MST1. Les graphiques d’agrégation de génotypes, présenté en annexe D, montre les résultats du génotypage pour chacune des 14 variantes testées chez les individus CEPH.

Le SNP contrôle rs9875617, située à l’extérieur des séquences dupliquées, montre que la réaction d’amplification et le génotypage avec les amorces standards ont bien fonctionnés pour cette région. Les variantes qui représentent des différences nucléotidiques entre les séquences dupliquée; 3p49700308, 3p49699143, rs6777426, 3p49697003 et rs1057319, montrent une tendance à être plus monomorphiques avec les amorces spécifiques qu’avec les amorces classiques, puisqu’en amplifiant plus spécifiquement la séquence d’intérêt, ces amorces permettent d’éliminer la sur-représentation de certains allèles causée par l’amplification des séquences des duplications. Pour les SNP reconnus, comme rs13085791 et rs3197999, on peut voir une nette amélioration de la détermination des génotypes avec les amorces spécifiques aux chromosomes 3 comparativement aux amorces classiques. Enfin, des 6 variantes dont le type restait à déterminer, 3 (3p49696626, 3p49699201 et 3p49696610) semblent monomorphiques chez nos 19 individus CEPH, alors que pour les 3 dernières (rs41291698, 3p49701074 et rs2446543), la mauvaise qualité de l’amplification n’a pas permis de déterminer leur génotype.

Puisque ces amorces permettent dans certains cas d’améliorer le génotypage des SNP situés dans la région dupliquée, elles ont été utilisées dans une expérience subséquente de génotypage de variantes de MST1 dans une cohorte de taille plus importante.