Amplificación de una genoteca de la población de Maipú de Drosophila

Para la primera parte del presente estudio, se me suministró una genoteca de ADN genómico de la población argentina de Maipú (García Guerreiro et al., 2008), de la cual se aislaron clones mediante la hibridación con sondas específicas de los elementos gypsy y bilbo, siguiendo los pasos descritos a continuación. Estos clones fueron posteriormente localizados mediante hibridación in situ en la cepa de referencia ch-cu, con el fin de seleccionar aquellos que correspondieran a posiciones únicas eucromáticas no detectadas previamente en esta cepa. A continuación, cada clon fue secuenciado y amplificado mediante PCR en diferentes poblaciones naturales.

2.5.1. Titulación de la genoteca

Se realizó una titulación de la genoteca amplificada realizando diluciones de 10^-2 -10^-9 con el fin de comprobar la concentración óptima de crecimiento de los fagos.

La concentración optima fue 10^-4; de esta dilución se tomaron 80 µl y se mezclaron con 600 µl de células XL1-Blue MRA (P2), después de la incubación se sirvieron en placas de medio NZYM Broth (medio enriquecido con NZ amino A, NaCl, extracto de levadura y MgSO4). Las placas se incubaron de 6 a 8 horas o hasta que se observaron calvas en el medio. Se guardaron las placas a 4ºC dos horas mínimo antes de fijar las colonias a los filtros.

2.5.2. Marcaje de sondas

Se usaron dos tipos de sondas de los elementos: una para rastrear la genoteca y otra para la hibridación in-situ. Las sondas de los elemento gypsy (2.8 Kb) y bilbo (2.6 kb) se obtuvieron mediante PCR, y fueron usadas para el rastreo de la genoteca y como sonda control en las hibridaciones in-situ.

Los cebadores utilizados para la obtención de estas sondas amplifican la zona de la reverso transcriptasa de cada uno de los elementos canónicos (García Guerreiro et al., 2008). Los cebadores usados fueron:

Cebadores para gypsy

DIRECTO: 5’GCTAAGAACCATAACGCCG3’

REVERSO: 5’GATGTTGTCTTGCTGTGC3´

Cebadores para bilbo

DIRECTO: 5’CTCGATTTGAGGCGATGTG3’

REVERSO: 5’ACGGATTGCTGCCATTTCTG3’

Las demás sondas marcadas para la hibridación in- situ se obtenían del ADN resultante de la lisis de fagos de los clones positivos. Las sondas usadas para la hibridación in-situ no fueron predigeridas ya que los brazos del fago no presentan homología con el genoma de Drosophila.

El marcaje de todas las sondas fue no radiactivo, basado en la incorporación de nucleótidos marcados con digoxigenina (Labrador, 1994). El procedimiento de marcaje se hace a través de random primer labelling (Feinberg y Vogelstein, 1983).

Para comprobar que la sonda quedó debidamente marcada, se realizó un Dot Blot en donde se comparan comparar las distintas intensidades de coloración del DNA problema con un control marcado de concentración conocida.

2.5.3. Transferencia de ADN a filtros de nylon

Una vez se observaron las calvas en las placas de medio NZYM Broth, después de la incubación toda la noche a 37ºC y luego de estar dos horas a 4ºC, se transfirieren las colonias de fagos a una membrana de nylon durante 2’. Esta membrana fue tratada con una solución de desnaturalización (1.5 M de NaCl, 0,5 M y 0.5 M NaOH) durante 2’ y posteriormente con una solución de neutralización (1.5 M de NaCl, y 0.5 Tris - HCl pH = 8) durante 5’. A continuación se realiza un segundo lavado durante 30’’con una solución de 0.2 M Tris – HCl (pH = 7.5) y 2xSSC.

Posteriormente, se dejan secar los filtros al aire sobre papel whatman (3mm), y

una vez secos se exponen a la radiación ultravioleta durante 5’ para fijar el ADN a la membrana.

2.5.4. Hibridación del ADN fijado al filtro

La hibridación y posterior revelado de los filtros se realizó siguiendo el Manual Lambda DASH II/BamH I de la casa comercial Stratagene, con modificaciones hechas por el Grupo de Biología Evolutiva. Los filtros previamente fijados se lavaron con una solución de 6 x SSC durante 2’. Posteriormente fueron prehibridados a 42 ºC toda la noche con la solución de hibridación (SSC x 5, formamida 50 %, N-lauroilsacosina 0.1 %, SDS 0.02 % y agente bloqueante 2.5 %).

La hibridación se hizo incubando toda la noche el filtro prehibridado con la sonda previamente desnaturalizada a 95 ºC. Después de la hibridación fue necesario lavar los filtros 2 veces durante 5’, cada vez, con soluciones de 2 x SSC + 0,1 % SDS.

Posteriormente se deben realizar 2 baños de astringencia durante 15’, cada vez, a 68 ºC con 0,1 x SSC + 0.1 % de SDS. Los filtros se pueden usar de inmediato para la detección del ADN hibridado o bien se pueden secar al aire sobre papel whatman (3mmm) y guardarse para una detección posterior.

2.5.5. Detección del ADN marcado

El revelado de los filtros se realizó para detectar las colonias que contenían clones con los elementos problema. Para ello los filtros se sometieron a diferentes lavados: 2 veces durante 3’ con la solución 1 (Tris 100mM + NaCl 150mM, con pH 7,5), 1 vez durantes 30’ con la solución 2 (Agente bloqueante 0.5 % en solución 1), y 2 veces por 5’ con la solución 3 (Tris 100mM + NaCl 100mM + MgCl2 50mM, a pH 9,5). Los filtros se incubaron con un anticuerpo (Anti-Digoxigenin – Ap 1:5000 anticuerpo-solución 1) durante 30 minutos. Finalmente se dejaron revelando en ausencia de luz, con una solución tinción (nitro blue tetrazoluim chloride (NBT) + 5-bromo–4–chloro–3–indolyl–phosphate (X-fosfato)). Una vez se observaron puntos color morado en el filtro, estos fueron lavados con agua destilada y secados al aire libre. La presencia de los puntos coloreados hace referencia a calvas que han hibridado con la sonda marcada (clones positivos).

2.5.6. Aislamiento y repurificación de clones de la genoteca

Las calvas que se tipificaron como clones positivos se enumeraron en el filtro revelado. Con este patrón cada calva escogida fue picada y guardada a 4ºC en tubos eppendorf con 250 µl de medio SM. Posteriormente se procedió a la repurificación que es un paso indispensable en el aislamiento de los clones, ya que permitió amplificar la calva y descartar falsos positivos. Se hicieron siembras de células P2 con diluciones de 10^-1, 10^-2 y 10^-3 de las calvas individuales recuperadas (picadas), mezclados con Top Agar NZYM y servidas en placas de NZYM Broth. Las placas se incubaron a 37 ºC toda la noche.

Dado que cada placa resultante de la repurificación contenía copias de un único clon, se recuperaron 4 calvas individuales con pipetas Pasteur en 500 µl de solución SM en tubos eppendorf y se dejaron en agitación suave toda la noche a 4ºC

2.5.7. Lisis del vector (Fago Lambda)

Se agrega 1 ml de células competentes TAP90 con 100 µl de calvas repurificadas, previamente incubadas durante 20 minutos en hielo, a un Erlenmeyer de 250 ml que contienen 30 ml de medio LB y 150 µl de CaCl2. La mezcla se incubó, agitando vigorosamente (280rpm), a 39ºC. La lisis de los fagos se hizo posible al cabo de 6-8 horas de incubación, durante las cuales fue necesario cada dos horas agregar la misma cantidad de LB y CaCl2 adicionada al inicio del proceso de lisis. La finalización del proceso de lisis se detecta por la presencia de pequeños hilos que corresponden a restos celulares fácilmente reconocibles y que el medio se torna transparente o menos opaco. Al terminar la lisis se agregan 100 µl de cloroformo y se deja en agitación durante 10’ para desproteinizar el ADN resultante.