Amélioration de la précision sur les mesures d’IRE

Dans le cadre des expériences biologiques présentées ici, les lamelles utilisées sont des lamelles commerciales qui ne sont pas conçues ni adaptées pour la réfractométrie des liquides. La faible profondeur des rainures (environ 220 nm) entraine une faible précision sur l’indice de réfraction : 0.003 en mesure absolue et 0.0003 pour une différence d’indice de réfraction. Cependant, l’utilisation de lamelles rainurées personnalisées a été présentée au chapitre 3, et des performances nettement supérieures ont été démontrées, soit une précision de l’ordre de 0.0003 en valeur absolue et de 0.00007 sur une différence d’indice de réfraction. L’utilisation de ces lamelles rainurées plus performantes permettrait de s’assurer de pouvoir mesurer en permanence des valeurs absolues adéquates d’IRE, utiles dans un contexte de découplage à deux liquides, mais également pour la caractérisation routinière des SQP mesurés, dont la nature quantitative et la comparabilité ne peuvent être assurées que si l’IRE est connu avec une précision suffisante.

3.3 Conclusion

Dans le cadre de ce chapitre, nous avons abordé l’utilisation de la méthode de réfractométrie des liquides développée au chapitre 3 dans un contexte d’expériences biologiques, pour la mesure in situ de l’IRE. Nous avons évalué l’efficacité de cette mesure dans le cadre de procédures de découplage à deux liquides. Malgré l’utilisation de lamelles rainurées nettement moins performantes que celles utilisées au chapitre 3, nous avons démontré des mesures absolues d’épaisseur et de changement d’indice de réfraction des cellules qui sont aussi précises que celles obtenues avec un réfractomètre commercial. Nous avons également montré la pertinence de la nature in situ de la mesure, qui permet de corriger pour des variations locales et imprévisibles de l’indice de réfraction. Dans le cadre des procédures de découplage, cette correction permet d’augmenter la répétabilité entre des mesures successives de l’épaisseur et de l’indice de réfraction des cellules. Ainsi, la pertinence de cette approche de réfractométrie des liquides in situ pour l’imagerie cellulaire au MHN, en particulier si des lamelles rainurées plus performantes sont utilisées, est démontrée.

Conclusion

Les cellules souches pluripotentes induites sont très prometteuses pour l’étude des grandes maladies psychiatriques, tant au niveau de l’identification de trajectoires développementales de risque infantile notamment avec l’appui de biomarqueurs de risque que de la mise en place de méthodes d’interventions précoces et de l’amélioration de notre compréhension de ces grandes psychoses. Comme ces neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites sont couteux et complexes à obtenir, il est essentiel de les imager avec des outils efficaces et adaptés pour en tirer un maximum d’information. Une des approches d’imagerie privilégiée est la microscopie de phase quantitative, plus précisément la microscopie holographique numérique, car elle permet d’étudier quantitativement les cellules, sans marquage et avec une puissance d’illumination très faible. Elle est donc strictement non invasive et par conséquent appropriée pour l’imagerie à long terme des neurones dérivés de patients et l’étude de leur maturation. Comme le signal mesuré est quantitatif, celui-ci peut être étudié et comparé dans le temps et d’une culture à l’autre.

Le signal quantitatif de phase est très riche et permet d’aller chercher beaucoup d’informations sur les cellules étudiées, mais est également complexe à analyser. Notamment, il dépend de l’indice de réfraction du milieu extracellulaire, qui doit donc être précisément mesuré pour chaque solution utilisée pour s’assurer d’interpréter correctement le signal quantitatif de phase obtenu. La mesure ex situ de cet indice de réfraction est possible, mais en plus de nécessiter des manipulations supplémentaires, ce qui la rend inapplicable pour des approches utilisant beaucoup de liquides différents comme le criblage à haut débit, elle ne permet pas de rendre compte des variations locales de l’indice de réfraction : changement de température, évaporation, etc. Ainsi, une mesure simple et précise de l’indice de réfraction extracellulaire ne peut se faire qu’in situ, directement sous le microscope holographique numérique.

Dans ce mémoire, la capacité du microscope holographique numérique à caractériser un indice de réfraction, ainsi que la pertinence de cette mesure pour les applications cellulaires, est évaluée. Ses performances pour la réfractométrie des solides ont été caractérisées, et des changements d’indice de réfraction très fins ont pu être mesurés. Ensuite, une approche de réfractométrie des liquides basée sur des lamelles rainurées a été présentée, laquelle permet d’obtenir une précision similaire à celle des réfractomètres commerciaux. En particulier, la capacité de cette nouvelle approche de réfractométrie à mesurer un changement d’indice de réfraction de façon précise a été démontrée. Enfin, cette approche de réfractométrie des liquides a été appliquée à l’étude de cellules sous le microscope holographique numérique, et sa pertinence démontrée dans ce contexte. L’utilisation de ces lamelles rainurées comme substrat pour l’imagerie cellulaire au microscope holographique numérique permet d’obtenir l’indice de réfraction in situ localement et résolu temporellement sans nécessiter de manipulations supplémentaires. Cette mesure assure la nature quantitative et la comparabilité

des signaux de phase mesurés pour les cellules, même sur le long terme, en plus de faciliter grandement différentes approches expérimentales plus complexes, tels le découplage à deux liquides et le criblage à haut débit. Les avantages de cette méthode de réfractométrie sont particulièrement cruciaux pour l’imagerie des modèles in vitro des grandes maladies psychiatriques développés grâce aux cellules souches pluripotentes induites et l’utilisation de ces lamelles facilitera l’étude de ces grandes maladies, l’identification des trajectoires de risque et le développement de traitements primaires pour celles-ci, soit les objectifs poursuivis par le laboratoire de recherche en neurophotonique et psychiatrie.

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