Les expériences d’adhésion cellulaire permettent d’évaluer les interactions entre 2 types cellulaires. Il est possible de réaliser ces études dans un environnement statique ou en faisant passer les cellules en suspension en flux contrôlé sur une monocouche de cellules adhérées. La première technique a l’avantage de tester un grand nombre de conditions en une seule expérience et la deuxième permet de se rapprocher des conditions in vivo de flux sanguin.
81 Dans notre étude, il s’agit de déterminer si les traitements imposés ont une influence sur les interactions cellulaires entre CEs et entre CEs et lymphoïdes (CEMT4).
a. Adhésion en conditions statiques
Les CEs sont ensemencées dans du milieu complet en plaques de 12 puits à raison de 1.104 cellules par cm². Après 48 heures de culture à 37°C sous atmosphère humide de 5% CO2/95% air, les cellules sont incubées en présence des traitements désirés (donneur de NO• ou hypoxie) pendant 24 à 48h, en comparaison d’un témoin non traité. Pour chaque condition, un puits supplémentaire est ensemencé qui servira à comptabiliser le nombre de cellules adhérentes, le jour de l’expérience.
Extemporanément, des lymphocytes CEMT4 ou des CEs sont marqués par le PKH-26 (Sigma, St. Louis, MO). Ce dérivé fluorescent de l’acridine orange substituée par une queue lipidique permettant à la molécule de s’insérer instantanément et irréversiblement dans la couche lipidique de la membrane des cellules. Le PKH-26 est un composé stable qui n’a aucun effet secondaire toxique sur les cellules lesquelles conservent leurs activités biologiques et prolifératives. Les cellules sont lavées par du milieu de culture sans sérum, puis le culot cellulaire est repris dans le tampon commercial « Diluent C » (Sigma), à raison de 2.107 cellules/mL. Cette suspension est transférée dans un tube de polypropylène contenant une solution de PKH-26 (7 µl + 1 ml de « Diluent C »/mL de la suspension cellulaire), puis rapidement incubée précisément 3min à 37°C sous agitation douce. Les cellules sont lavées en présence de SVF, puis reprises dans le tampon adéquat pour l’expérimentation suivante.
Les cellules préalablement marquées sont reprises dans du cPBS/0.1% BSA à une concentration telle que soient respectés les rapports de 5 cellules en suspension pour une cellule adhérente dans le cas des lymphocytes ou 6 cellules en suspension pour une cellule adhérente dans le cas des CEs. 600 µL de cette suspension cellulaire sont déposés sur la monocouche de CEs. Après 30 min d’incubation à 37°C, les cellules en suspension non adhérées aux CEs sont éliminées par trois lavages doux avec une solution de cPBS. Enfin, les cellules en monocouche et adhérées sont décollées par une solution de trypsine/0.02% EDTA et lavées par du cPBS. Après 5 minutes de centrifugation à 400 g, le culot cellulaire est remis en suspension dans le cPBS pour l’analyse au cytomètre de flux.
Le marquage des cellules en suspension par le PKH-26 (λ excitation: 551 nm, λ émission: 567 nm) permet de discriminer les CEs non fluorescentes de la monocouche et les cellules fluorescentes venant des cellules en suspension en utilisant le cytomètre en flux. Ainsi on peut évaluer le ratio entre les deux populations. Ceci correspond au taux d’adhésion, exprimé en nombre de cellules en suspension fixées par CE. Chaque condition est réalisée en triplicat et dans 2 expériences indépendantes.
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b. Adhésion en conditions de flux
Pour une meilleure adhésion au support, les CEs sont ensemencées sur des lames en plastique Permanox®. Il s’agit d’un polymère spécifique de la famille des polyoléfines ; les lames Permanox®
sont particulièrement adaptées à l’étude des cellules en flux car cette résine, traitée pour la culture cellulaire, répond aux besoins d’ancrage des cellules adhérentes.
Les CEs sont ensemencées dans du milieu complet sur plaques Permanox® à raison de 1.4.105 cellules/mL et incubées directement ou après 24h en présence des traitements désirés (donneur de NO• ou hypoxie) pendant 24 à 48h, pour que les CEs soient 48h en culture, au final.
Le jour de l’expérience, des lymphocytes CEMT4 ou des CEs sont marqués par le PKH-67, de la même manière que pour le PKH-26. Pour cette expérience, le PKH-67 (λ excitation: 490 nm, λ émission:502 nm) est préféré au PKH-26 (λ excitation: 551 nm, λ émission: 567 nm), car les paramètres de fluorescence du microscope étaient plus adaptés à sa visualisation au début de la série d’expériences. Ce marqueur cellulaire fluorescent vert se fixe instantanément et irréversiblement dans la couche lipidique des cellules. Les cellules sont ensuite reprises dans du milieu de culture à une concentration de 1 million/mL.
Pour générer le flux, la chambre de flux est positionnée sur la lame de CEs, maintenue en faisant le vide dans le joint autour de la zone de cellules. L’ensemble est connecté au système pompe-seringue et au réservoir contenant la suspension de CEs ou lymphoïdes, le flux est alors généré par activation de la pompe-seringue (figure 26). Le passage des cellules en suspension sur la monocouche endothéliale peut être observé sous microscope inversé à fluorescence Axiovert 200M (Zeiss). Le débit du flux est contrôlé afin de ne pas endommager la monocouche de CEs de la lame : les cellules en suspension sont injectées dans la chambre de flux à la vitesse de 50 µl/min pendant 5 min, puis la monocouche est lavée par du milieu pendant 10min à la vitesse de 150 µl/min, afin d’éliminer les cellules non adhérées spécifiquement.
Le marquage des cellules en suspension par le PKH-67 (λ excitation: 490 nm, λ émission:502 nm) permet de discriminer les cellules de la monocouche et en suspension par leur fluorescence et ainsi de dénombrer les deux populations. Ainsi, il est possible de calculer le taux d’adhésion, exprimé en nombre de cellules en suspension fixées par CE. Chaque condition est réalisée en duplicat et dans 2 expériences indépendantes. Au minimum 10 photos par lame sont prises en visible et en fluorescence sur la zone d’adhésion (une photo présente approximativement 600 CEs adhérées), en utilisant le logiciel d’acquisition d’image Axiovision (Zeiss).
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