Les activités exclues

Os testes para análise antimicrobiana das membranas de nanofibras de Acetato de celulose, Alginato e Quitosana com metronidazol (10 e 20%) foram realizados no Laboratório de Microbiologia do Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic (Campinas, São Paulo), com o qual mantemos colaboração.

As amostras foram esterilizadas com óxido de etileno na empresa Acecil (Campinas, São Paulo), e deixadas em repouso por 15 dias antes do início dos testes.

Para as nanofibras com o fármaco Metronidazol, a atividade antimicrobiana foi avaliada através da utilização das bactérias anaeróbias Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Gram negativa, A.actinomycetemcomitans, ATCC 33384, sorotipo c), isoladas e mantidas no laboratório de Microbiologia do Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic (Campinas-SP).

Estas cepas foram mantidas congeladas, para posterior ativação em meio de cultura caldo BHI (Brain Heart Infusion, Himedia, India), sendo mantidas em estufa bacteriológica, em condições de anaerobiose estrita para A. actinomycetemcomitans usando Anaerogen Compact (Oxoid, Milão, Itália), ambas mantidas por 24h a 37ºC.

Foram obtidos caldos contendo uma densidade final de 15x108 células/ml, correspondendo ao fator n.5 da escala de McFarland (Nefelobac, Escala Nefelométrica de McFarland, Brasil), e plaqueadas uniformemente com auxílio de alça Drigalski em Agar MH (Mueller Hinton). Após isto, as membranas com concentrações de 10 e 20% de Metronidazol, bem como membranas sem fármaco (teste branco) com aproximadamente 13 mm de diâmetro, foram colocadas com o auxílio de uma pinça estéril em pontos equidistantes. As placas foram incubadas em estufa de anaerobiose a 37°C por 48 horas para posterior interpretação e leitura dos resultados.

A avaliação foi realizada, verificando-se a presença ou ausência dos halos de inibição ao redor dos discos, contra um fundo preto. O diâmetro do halo foi medido com um paquímetro em mm, para posterior avaliação dos resultados. Os testes foram realizados em triplicata. Para controle negativo foi utilizado membranas de

cada polímero sema incorporação do fármaco e como controle positivo discos de papel filtro embebidos em uma solução aquosa de metronidazol.

2.2.11. Análise Citotóxicológica - Ensaio de Viabilidade Celular

2.2.11.1. Linhagens celulares

As linhagens celulares de fibroblastos humanos foram obtidas do Banco de células do Laboratório de Cultivo de Células do "Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic", Campinas. Essas células foram isoladas previamente através do cultivo primário de gengivas humanas, removidas de três diferentes pacientes, por meio da técnica de explant (MARTINEZ et al., 2004; FRESHNEY, 2005), Figura 2.6. Estas foram utilizadas para todos os experimentos descritos a seguir, realizados em triplicata.

Figura 2.6. Fotomicrografia de fase de linhagem de fibroblastos gengivais humanos.

Aumento original de 100x.

2.2.11.2. Cultivo celular

Os fibroblastos foram cultivados em meio essencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), composto de uma mistura de sais enriquecidos com aminoácidos e outros componentes essenciais para o crescimento celular. (Nutricell®, Campinas, SP, Brasil), suplementados com 10% de soro fetal Bovino

(Cultilab®, Campinas, SP, Brasil) e 1% de solução antibiótica-antimicótica (penicilina- estreptomicina) (Sigma, St. Louis, Missouri, EUA).

Todos os procedimentos foram realizados em capela de fluxo laminar para manutenção da esterilidade dos materiais e das substâncias utilizadas para o cultivo celular.

As células de fibroblastos humanos foram mantidas em estufa a 37ºC, em atmosfera úmida, contendo 95% de ar atmosférico e 5% de dióxido de carbono (CO2). O meio de cultura foi trocado a cada 2-3 dias e a progressão da cultura foi avaliada por microscopia de fase, em culturas crescidas sobre poliestireno, que serviu como controle.

2.2.11.3. Ensaio de viabilidade celular

Para a avaliação de viabilidade celular, foi utilizado o método de exclusão vital por azul de Trypan em 1, 2 e 3 dias, das culturas celulares plaqueadas sobre as matrizes reabsorvíveis.

O ensaio avalia a integridade da membrana celular com base no princípio de que as células vivas, viáveis, possuem membranas celulares íntegras que bloqueiam a entrada do corante Tripan Blue, ficando com aspecto translúcido. O contrário ocorre com as células mortas, não viáveis, que por apresentarem danos em sua membrana permitem a incorporação deste corante e adquirem uma coloração púrpura.

As suspensões celulares foram obtidas através da tripsinização dos poços, com tripsina 0,25% contendo EDTA 0,2g/L (Nutricell, Campinas, SP, Brasil), e posteriormente inativadas com o próprio meio de cultura.

Após atingirem a subconfluência (efeito de recobrimento de células na garrafa em torno de 70 %), as células foram enzimaticamente removidas das placas e, o precipitado de células resultante da centrifugação foi ressuspenso em 1 mL de meio. Foram retirados 10 µL da suspensão de células e a estes se juntou 10 µL de azul de Trypan, sendo que 1 µL desta solução foi colocado em um hemocitômetro (câmara de Neubauer-Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) e levado ao

microscópio de fase invertida (Nikon, Eclipse TS100) para a contagem e observação das células.

O número total de células presentes em cada poço em diferentes tempos de análise foi obtido através da seguinte equação matemática, Eq 2.3:

Nº total de células = (Nº de células contadas X Vol. inicial X Diluição X 104) Eq 2.3 Nº de quadrados usados para contagem

2.2.12. Teste de permeação do Metronidazol em mucosa bucal suina

2.2.12.1. Quantificação Metronidazol

O metronidazol foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiencia (Detector de luz UV/VIS Thermo Electron Surveyor UV/VIS Plus Detector - San Jose, CA, USA, acoplado a um amostrador automático Thermo Fischer Scientific Model Surveyor Autosampler Plus Lite – San Jose, CA, USA), seguindo metodologia da "The United States Pharmacopeia" - USP 37-NF 32 (2014). A quantificação foi realizada por HPLC nesta análise devido a maior sensibilidade do método na deteação do MTZ.

O metronidazol foi separado numa coluna C18 de fase inversa (5 μm, 150 x 4,60 mm, Phenomenex). A fase móvel consistia em metanol e solução de potássio di-hidrogênio fosfato (1,36 g/l) na proporção de 30:70, bombeado a 1 mL / min e um volume de injecção de 10 μl. A detecção do metronidazol foi monitorizada em 315 nm. Uma curva de calibração foi construída a partir de uma solução padrão, preparada por dissolução de metronidazol em fase móvel, seguido por diluição em três soluções de trabalho, (de 5, 50 e 100 μg / mL). Para cada concentração injetou- se 5 amostras em três dias diferentes, a fim de se obter curvas de calibração, esses resultados foram analisados por análise de regressão linear da área de pico em função da concentração (r2=0,9999). O limite de detecção foi de 1,66 μg / ml, e o limite de quantificação foi de 5,52 μg / mL. A coleta de dados foi realizada utilizando software ChromQuest 5.0 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA).

O método foi validado em termos de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação. A especificidade do método analítico foi avaliado, com o objetivo de confirmar que nenhum componente da mucosa oral suína iria interferir nas análises de metronidazol.

2.2.12.2. Preparação do tecido para estudo permeação

As cabeças de porco foram obtidas a partir de um matadouro local e transportadas para o laboratório em tampão fosfato isotônico a pH 7,4. A preparação de tecido foi adaptada a partir de uma metodologia descrita anteriormente (FRANZ- MONTAN et al., 2015). Dentro de 2 h de abate, as amostras da mucosa oral suina (a partir da região da bochecha) foram separadas da cabeça utilizando-se um bisturi e lavadas com solução salina, Fig. 2.7a e b. Mucosas com qualquer dano visual na superfície foram descartadas. Mucosas intactas foram imersas em solução salina a 65°C durante 60 s, e o epitélio foi cuidadosamente separado do tecido conjuntivo, Figura 2.7 c e d. Foi relatado anteriormente que este procedimento não influencia a integridade do epitélio da mucosa oral (DIAZ DEL CONSUELO et al., 2005). Para todos os experimentos foram utilizados somente epitélios frescos do mesmo animal. Além disso, todas os experimentos foram conduzidas com a mucosa de pelo menos três animais diferentes. As mucosas foram submetidas a teste de medida de resistividade para garantir sua integridade antes da utilização, as mucosas eram consideradas utilizadas somente se a resistividade em solução tampão fosfato 0,1 M pH7,4 fosse superior a 3 KgΩ.cm2

.

Figura 2.7. Sequencia do procedimento para preparação da mucosa oral suína para teste

de permeação.

2.2.12.3. Experimento de permeação

Estudos de permeação foram conduzidos em células de difusão de Franz (Sistema Transdérmico mamual, Hanson Research Corporation), com 1,77 cm2 de área de permeação e um compartimento receptor de 7,0 ml de volume. A mucosa foi colocada sobre um filtro de celulose de 0,45 mm (tecido conjuntivo com o lado voltado para o filtro de membrana), devido à sua fragilidade, evitando quaisquer danos que poderiam alterar parâmetros de permeação, sem alterar o transporte de metronidazol, Figura 2.8. As membranas de SA/PEO, QUIT/PEO e de CA revestidas com SA/PEO e QUIT/PEO incorporadas com o fármaco foram colocadas em cima da mucosa no compartimento doador. As câmaras do receptor foram preenchidas com solução de saliva artificial degaseificada e agitadas magneticamente 400 rpm, a 37°C. Os experimentos de permeação foram realizados em condições não oclusivas, durante 5 h. Amostras de 300 μL foram periodicamente retiradas da fase receptora e analisadas por HPLC, sendo substituídas com solução receptora fresca, em volumes iguais. O fluxo de fármaco foi calculado a partir da inclinação da parte linear da curva (quantidades cumulativas de metronidazol transportadas através da mucosa, por unidade de Área x Tempo). O time lag (intervalo de tempo) foi obtido a partir da intercepção com o eixo do tempo.

Figura 2.8. Célula de Franz utilizada no teste de permeação (a), compartimento receptor (b)

e (c).área de permeação com mucosa e membrana