CHAPITRE II : DIFFERENCES D'ACTIVATION DES ISOFORMES CXCR3-A ET
D. Activation du CXCR3-B par CXCL4 et CXCL4L1
Aucune fixation entre le CXCL4 et le CXCR3-A n'a pu être mise en évidence ni par vidéomicroscopie, ni par SPR, et n'entraine pas de stimulation des voies de signalisation de cette isoforme. Cette chimiokine ayant été caractérisée pour fixer le CXCR3-B, nous avons fait des expériences de stimulation de l'isoforme CXCR3-B pour vérifier l'activité du CXCL4. L'isoforme CXCR3-B induisant des signaux
Figure 53: Impact du changement d'oligomérisation du CXCL4 sur l'activation de CXCR3-A. Stimulation de 5 minutes pour chaque condition.
167 apoptotiques et anti-prolifératifs (Datta et al., 2010; Petrai et al., 2008), le clonage de cette isoforme n'a pas encore aboutit au laboratoire dans la lignée U87. Nous avons donc réalisé les expériences de stimulation par le CXCL4 sur les lignées HEK- CXCR3B. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression de CXCR3-B entrainait une stimulation constitutive de la voie pro-apoptotique MAPK/P38 (Figure 54). Nous avons montré que la stimulation au CXCL4 active la phosphorylation de P38 (Figure 54). Ceci est en accord avec des études montrant que l'effet angiostatique de CXCR3-B est liée à l'activation de la voie MAPK/P38 (Petrai et al., 2008). De manière intéressante, la stimulation de ces cellules par le CXCL4L1 n'a pas aboutit à l'activation de la voie P38. Nos expériences suggèrent donc que le CXCL4 serait un activateur spécifique du CXCR3-B, alors que CXCL4L1 serait un activateur spécifique du CXCR3-A.
Suite à ces résultats suggérant des intéractions préférentielles entres le CXCL4 et son variant CXCL4L1 avec les deux isoformes CXCR3-A et CXCR3-B, nous avons étudié l'impact de ces différents mutants de CXCL4 sur le CXCR3-B (Figure 55). Les premiers résultats suggèrent que les mutants activent moins efficacement le CXCR3-B, notamment pour certains mutants monomériques du CXCL4.
Figure 54: Impact de la stimulation par différentes chimiokines sur les lignées surexprimant ou non le CXCR3-B. Stimulation de 5 minutes pour chaque condition
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V. Conclusions et perspectives
Les différentes collaborations mises en place dans notre groupe nous ont permis de mieux caractériser les propriétés biophysiques et les différences d'activations des isoformes CXCR3-A et CXCR3-B. Nous avons montré que les agonistes de CXCR3 pouvaient se fixer avec des affinités différentes sur les récepteurs. Notamment l'agoniste commercial de CXCR3, le PS573434, se fixe préférentiellement sur le CXCR3-A, mais aussi sur le CXCR3-B avec une affinité 10 fois inférieure. La mise en place du PWR sur extraits membranaires nous a permis d'étudier spécifiquement les changements de conformation des deux isoformes. De manière extrêmement intéressante, en plus des différences d'affinités, le PS573434 n'induit pas les mêmes changements conformationnels selon les isoformes du CXCR3, ces changements se trouvent même être opposés dans les spectres PWR. De tels changements dans les réponses des isoformes traduisent des différences déjà reconnues dans la réponse des isoformes après fixation du ligand. Ceci peut notamment expliquer le recrutement differentiel de protéines G entre CXCR3-A et CXCR3-B, et ainsi l'activation de voies de signalisation opposées.
De manière générale, le CXCR3 fixe les chimiokines ELR- que sont CXCL4, CXCL4L1, CXCL9, CXCL10 et CXCL11. L'étude est complexe du fait de la présence des isoformes d'épissage CXCR3-A et CXCR3-B possédant des voies de
Figure 55: Impact du changement d'oligomérisation du CXCL4 sur l'activation de CXCR3-A. Stimulation de 5 minutes pour chaque condition
169 signalisation opposées. Nos résultats PWR mettent en évidence que les mêmes ligands vont agir avec des affinités différentes sur les isoformes, et surtout que la réponse du ligand sera différente selon l'isoforme présente dans la cellule. L'agoniste PS573434 stimule le CXCR3-A et ainsi active les voies pro-tumorales et pro- prolifératives, via le recrutement des protéines Gα-i/o ou Gα-q. Nous savons désormais que l’agoniste peut aussi stimuler le CXCR3-B et ainsi activer ces voies de signalisation anti-tumorales et anti-angiogeniques, via le recrutement des protéines Gα-s. Il serait important de tester tous les ligands de CXCR3 en PWR pour déterminer leurs Kd avec chaque isoforme de CXCR3, et d'étudier les différences de conformation et d’activation de ces isoformes.
Contrairement au CXCL4, l'isoforme de CXCR3 activée lors d'une stimulation au CXCL4L1 est peu caractérisée. Les expériences de vidéomicroscopie et de SPR réalisées à Taiwan nous ont permis de conclure que le CXCL4L1 interagit avec CXCR3-A. Une interaction suivie d'une internalisation du complexe ligand/récepteur a pu être visualisée par vidéomicroscopie. De manière logique, nous avons montré que CXCL4L1 stimule des voies de signalisation du CXCR3-A associées aux MAPK/ERK. Au contraire, CXCL4 ne se fixe pas et n’active pas CXCR3-A. Nous avons pu vérifier que le CXCL4 entrainait une stimulation des voies liées au CXCR3- B comme la voie MAPK/P38. L'oligomérisation des chimiokines étant un processus essentiel pour leur activité, des mutants du CXCL4 présentant des défauts dans leur tétramérisation ont été réalisés nous permettant d’obtenir du CXCL4 sous forme de dimère ou de monomère en solution. Lors des stimulations des isoformes de CXCR3, nous avons observé que certains des mutants sous forme de monomère de CXCL4 entrainaient une stimulation des voies de signalisation MAPK/ERK du CXCR3-A, se comportant ainsi comme le CXCL4L1. En vérifiant l'activation de la voie MAPK/P38, les premiers résultats montrent que les mutants stimulent cette voie via le CXCR3-B par rapport aux conditions contrôles, mais de manière moins importante que par rapport au CXCL4 tétramérique. Le changement d'oligomérisation du CXCL4 permettrait donc de changer les affinités de fixation de cette chimiokine sur les isoformes CXCR3-A ou CXCR3-B. Des mutations du CXCL4L1 sont actuellement en cours de préparation et de caractérisation. Il sera très intéressant de voir si les changements d'oligomérisation du CXCL4L1 entrainent des modifications dans la
170 fixation et les affinités avec les deux isoformes de CXCR3. De plus, des expériences de SPR, voir même de PWR avec les différentes chimiokines et mutants nous permettraient de déterminer précisément leurs constantes d'affinités avec le CXCR3- A ou CXCR3-B.
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