Accrochage et d´ ecrochage contrˆ ol´ e de prot´ eines

3.3.1 Contexte et exp´ eriences pr´ eliminaires

3.3.1.1 Rappel du contexte et des objectifs

Pr´eparation d’´echantillons. J’ai rappel´e au chapitre 1 les enjeux de la pr´eparation d’´echantillons pour les laboratoires sur puces [37]. La transition r´eversible hydrophile – hydrophobe du pnipam le rend particuli`erement int´eressant pour des applications d’accrochage et d´ecrochage contrˆol´e de mol´ecules biologiques, telles que des cellules.Huberet al.rapportent en 2003 des r´esultats notables dans le domaine particulier de l’accrochage de prot´eines (Fig. 3.14) : ils observent le d´ecrochage de prot´eines fluorescentes adsorb´ees sur du pnipam; cette exp´erience a lieu sur un substrat plan, sur lequel sont int´egr´ees des ´electrodes chauffantes en or [184]. Notre objectif est de d´eterminer dans quelle mesure ce type de manipulation peut ˆetre int´egr´e dans un laboratoire sur puce, dans la vision plus g´en´erale de la pr´eparation d’´echantillons. Nous utilisons comme support des microbilles dont la surface est fonctionnalis´ee avec du pnipam [75] ; nous ´etudions les billes dans deux types de canaux : tout d’abord, dans des capillaires en silice fondue, qui sont des supports mod`eles de caract´erisation microfluidique, puis dans les puces en pdms pr´esent´ees au chapitre 2. Une partie des travaux pr´esent´es dans cette section a ´et´e r´ealis´ee avec Deka Moussa Ragueh dans le cadre de son stage de fin d’´etude.

Fig. 3.14 – Sch´ema d’interaction entre le pnipam et des mol´ecules biologiques telles que des prot´eines. Pour T > LCST, le pnipam est repli´e et hydrophobe (en vert) : les prot´eines s’y ad-sorbent (en orange). `A T < LCST, le pnipam se d´eplie (en mauve), devient hydrophile et lib`ere les prot´eines qu’il a pi´eg´ees.

3.3.1.2 M´ethode de caract´erisation

Microscopie `a fluorescence. De nombreuses mol´ecules biologiques peuvent ˆetre conjugu´ees avec un fluorophore, une mol´ecule capable d’absorber de l’´energie lumineuse `a une certaine longueur d’onde et de la restituer rapidement (<10 ns) sous forme de lumi`ere fluorescente, `a une longueur d’onde plus grande. Cette conjugaison, dans notre cas prot´eine – fluorophore, permet de visualiser la pr´esence et les dynamiques des prot´eines par fluorescence. Le d´eplacement de Stokes du spectre d’´emission vers des longueurs d’onde plus ´elev´ees permet d’utiliser la fluorescence comme moyen de d´etection ; un miroir dichro¨ıque s´epare l’excitation lumineuse et le signal sp´ecifique ´emis par le fluorophore. Notre groupe est ´equip´e d’un microscope optique `a ´epifluorescence Olympus BX 51, pourvu de plusieurs jeux de filtres correspondant aux fluorophores les plus utilis´es. Une lampe `a

3.3. ACCROCHAGE ET D ´ECROCHAGE CONTR ˆOL ´E DE PROT ´EINES 83 vapeur de mercure produit le faisceau lumineux. Chaque jeu de filtres contient un filtre d’excita-tion, un miroir dichro¨ıque et un filtre d’´emission. Les images sont transmises `a une cam´era haute sensibilit´e Andor. Il est ´egalement possible d’observer des ´echantillons de fa¸con classique en lumi`ere blanche. Le montage complet est montr´e sur laFig. 3.15.

Fig. 3.15 – Vue du montage complet de caract´erisation par microscopie `a fluorescence, incluant : (`a gauche) le g´en´erateur de la lampe `a vapeur de mercure, (en haut) la cam´era haute sensibilit´e, (au centre) le microscope `a fluorescence, sur la platine duquel est fix´e le montage Peltier.

R´egulation de la temp´erature. Les premi`eres ´etapes de validation sont r´ealis´ees en capillaire de verre et sur dispositifpdmssimple ; l’objectif est de dissocier les ´eventuels probl`emes thermiques, li´es `a un chauffage localis´e, des caract´eristiques d’adsorption – d´esorption intrins`eques aupnipam.

Nous utilisons deux types de sources thermiques : l’un est un ´el´ement Peltier, capable de chauffer et refroidir dans la gamme 5−100˚C ; adapt´e pour les puces, il l’est moins pour les capillaires, en raison de la surface limit´ee d’´echange de chaleur ; les transitions thermiques sont par ailleurs assez lentes. La seconde source thermique utilis´ee est un souffleur d’air chaud, qui permet de passer tr`es rapidement de la temp´erature ambiante `a plusieurs centaines de degr´es ; il ne dispose pas de syst`eme de refroidissement. Quelle que soit la source thermique, le dispositif (capillaire ou puce) est g´en´eralement chauff´e autour de 50˚C, un bon compromis entre la temp´erature de transition du pnipam(∼32˚C) et une temp´erature mod´er´ee visant `a ´eviter la d´enaturation des prot´eines.

84 CHAPITRE 3. APPLICATIONS Mol´ecules et r´eactifs. Trois esp`eces sont n´ecessaires aux exp´eriences : des mol´ecules biologiques capables de s’adsorber sur lepnipam, un fluorophore permettant la visualisation et des microbilles pouvant ˆetre fonctionnalis´ees avec du pnipam. L’albumine de s´erum est la plus abondante des prot´eines sanguines chez les humains et les autres mammif`eres ; l’albumine de s´erum bovin (bovine serum albumine, bsa, CAS : 9048-46-8), en particulier, est souvent utilis´ee comme prot´eine mod`ele en biologie. Stable, de taille moyenne (∼66 kDa), elle est produite `a grande ´echelle, donc `a bas coˆut, par purification de sang bovin d´eriv´e de l’industrie animale. Nous avons donc choisi de travailler principalement avec des solutions de conjugu´es albumine – fluoresc´eine, disponible commerciale-ment aupr`es de Sigma Aldrich (A 9771). La fluoresc´eine (CAS : 2321-07-5) est un fluorophore tr`es r´epandu, excit´e autour de 495 nm et ´emettant vers 521 nm ; son d´eriv´e isothiocyanate (fluores-cein isothiocyanate, fitc, CAS : 27072-45-3), particuli`erement r´eactif avec les groupes amine des prot´eines, est utilis´e pour r´ealiser des conjugaisons de mol´ecules biologiques. Les microbilles uti-lis´ees sont des billes de silice de 5µm de diam`etre, obtenues aupr`es de Restek. Les exp´eriences sont g´en´eralement r´ealis´ees avec une concentration finale de 50 mg/mL en billes et en albumine – fluoresc´eine. Nous avons test´e des variations de ce rapport selon les besoins de la visualisation, tout en restant dans les mˆemes ordres de grandeur. Les prot´eines et les billes sont en solution de tampon phosphate dilu´e.

Traitement des donn´ees. Les dynamiques d’adsorption et d´esorption sont enregistr´ees par la cam´era sous forme de vid´eos ; les images sont ensuite ajust´ees et analys´ees avec l’outil ImageJ. Les op´erations les plus courantes sont la correction de la luminosit´e, du contraste et de l’alignement des images ; la fonction de suivi des particules permet de mesurer l’intensit´e lumineuse sur un jeu de billes. Le bruit de fond de fluorescence est soustrait `a l’intensit´e lumineuse de chaque bille ; celle-ci est ensuite normalis´ee par rapport `a l’intensit´e lumineuse de tout le canal `a chaque instant, afin de s’afranchir, par exemple, de l’effet d’´epuisement de fluorescence (photobleaching). Enfin, l’´evolution de la fluorescence au cours du temps est normalis´ee par rapport au maximum d’intensit´e de l’exp´erience, afin de faciliter la comparaison des diff´erents cas.

Manipulation. Le dispositif exp´erimental rend difficile la connexion des capillaires avec un sys-t`eme fluidique `a plusieurs circuits. Les exp´eriences en capillaires sont donc r´ealis´ees en fluidique statique : une solution mixte de prot´eines fluorescentes et de microbilles fonctionnalis´ees avec du pnipam est introduite dans le capillaire. Celui-ci est immobilis´e sur le support du microscope et align´e sous l’objectif (Fig. 3.16). Nous proc´edons de fa¸con identique pour les puces en pdms sur verre, `a cause de l’encombrement st´erique de l’objectif du microscope (Fig. 3.17). Dans les deux cas, la visualisation du canal en lumi`ere blanche permet de v´erifier la pr´esence des billes (Fig.3.19

& Fig. 3.20). La fluorescence diffuse de la solution dans le canal assure la pr´esence des prot´eines fluorescentes.

3.3.1.3 Comportement des billes dans les microcanaux

Capillaires. L’utilisation de capillaires en microfluidique est principalement h´erit´ee des tech-niques d’analyse telle que l’´electrophor`ese. Lors du d´eveloppement de syst`emes microfluidiques d’analyse, le capillaire reste souvent le support t´emoin auquel on compare le dispositif miniatu-ris´e [107]. Les capillaires sont des canaux simples, r´eguliers, sans connectique complexe et facilement fonctionnalisables. Nous utilisons des capillaires en silice fondue, de 75µm de diam`etre interne. La gaine protectrice est ˆot´ee par endroits afin d’obtenir des fenˆetres de visualisation ; nous limitons le nombre de fenˆetres, car elles fragilisent le capillaire. LaFig. 3.18 montre un exemple du principal probl`eme de l’utilisation de billes dans les capillaires : leur tendance `a s’adsorber sur la surface