Bien que la présence d’accepteurs d’électrons autres que les PCB inhibe la déchloration réductive, les souches responsables de cette transformation appartiennent parfois aux groupes fonctionnels des sulfatoréducteurs ou nitrate-réducteurs. Ainsi, l’addition de SO42- ou de NO3- stimule la croissance des bactéries responsables de la
déchloration des PCB. Par exemple, le FeSO4 permet de fournir du sulfate pendant que le Fe2+ neutralise la
production de sulfites toxiques par la formation d’un complexe insoluble FeS (Borja et al., 2005).
IV.3 Traitement séquentiel anaérobie/aérobie
Le traitement séquentiel est aujourd’hui la voie privilégiée pour le traitement des PCB les plus récalcitrants à la biodégradation. On cumule ainsi les avantages des deux traitements. Le traitement anaérobie permet d’abaisser le taux de chlore des PCB ce qui permet d’augmenter leur accessibilité pour la dégradation aérobie. Ainsi, une étude a pu montrer la dégradation de 66% en concentration de l’Aroclor 1260 (concentration initiale : 58,7 ppm) grâce au traitement séquentiel. Le traitement aérobie seul ne permettrait de dégrader que 10 % de l’Aroclor 1260 (Master et al., 2002).
28
V
MICROORGANISMES
V.1 Organismes cultivés
V.1.1 BBuurrkkhhoollddeerriiaaxxeennoovvoorraannss
V.1.1.1 Classification
Burkholderia xenovorans a longtemps été classée comme une espèce de Pseudomonas. La souche LB400 a été rattachée à la famille des Burkholderiaceae en 2001 par Fain et Haddock (Fain et Haddock, 2001). C’est une bactérie Gram-négative, mobile, en forme de bâtonnets long de 1 à 2 µm et large de 0,5 µm. Elle est mésophile (pas de croissance à 42°C). Elle a été isolée à partir d’un sol contaminé par des PCB sur un site d’enfouissement à Moreau (New York, USA) en 1986 (Goris et al., 2004). Sa classification actuelle est présentée dans le Tableau 5.
Tableau 5 : Classification de Burkholderia xenovorans
Règne procaryote Embranchement Protéobacteries Classe Bétaprotéobactéries Ordre Burkholderiales Famille Burkholderiaceae Genre Burkholderia Espèce xenovorans Souche LB 400 .
V.1.1.2 Propriétés physico-chimiques
Burkholderia xenovorans est la plus connue des bactéries ayant la capacité de dégrader des xénobiotiques récalcitrants à la biodégradation. Elle est capable de dégrader du 2,3-dichlorobiphényle, du 2,2’-dichlorobiphényle 2,4’-dichlorobiphényle, du 2,4,4’-trichlorobiphényle, du 2,5,4’-trichlorobiphényle, du 2,3,2’,3’- tetrachlorobiphényle, du 2,5,2’-trichlorobiphényle, du 2,3,2’,5’-tetrachlorobiphényle, du 2,4,2’4’- tetrachlorobiphényle, du 2,5,3’,4’-tetrachlorobiphényle, du 2,5,2’,5’-tetrachlorobiphényle, 2,3,4,2’,5’- pentachlorobiphényle et du 2,4,5,2’5’-pentachlorobiphényle avec des rendements de dégradation allant de 80 % à 100 % (Mhiri et de Marsac, 1997). Il existe d’autres PCB dégradés par ce microorganisme. Comme tous les microorganismes capables de métaboliser des PCB, Burkholderia xenovorans présente une enzyme de type 2,3- dioxygénase capable d’opérer une dioxydation sur un site 2,3 libre du noyau biphényle. On produit alors un PCB dihydroxylé, étape préalable à la scission du noyau biphényle. Les métabolites finals sont l’acide chlorobenzoïque correspondant et un acide organique, tous deux facilement dégradables.
29 Figure 11 : Voie métabolique de la biphényle dioxygénase (Borja et al., 2005).
Une des originalités de Burkholderia xenovorans, par rapport au reste des bactéries est sa capacité à utiliser un site 3,4 libre en lieu et place du site 2,3. Ainsi, elle augmente son spectre d’action en dégradant certains PCB ortho- substitués pourtant très récalcitrants via une médiation classique en 2,3. Ce phénomène est probablement lié à la spécificité des substrats de la 2,3-dioxygénase de Burkholderia xenovorans et non à la présence d’une seconde enzyme disctincte.
Cette enzyme, la 2,3-dioxygénase, est aussi capable de s’attaquer à du dibenzofurane et dibenzodioxine ouvrant la perspective d’une biodégradation des dioxines et furanes polychlorés.
Les capacités enzymatiques de Burkholderia xenovorans sont si intéressantes que son matériel génétique est utilisé en bioingéniérie afin de conférer à d’autres microorganismes la capacité de synthétiser la 2,3-dioxygénase (L’Abbée
et al., 2004). De plus, des essais ont été menés pour insérer le gène permettant la synthèse de l’enzyme capable de métaboliser l’acide chlor(A)benzoique afin que Burkholderia xenovorans puisse compléter la minéralisation des PCB (Jorge et al., 2006). Ces techniques bien que présentant des résultats intéressants se heurtent, en Europe, à la législation sur l’usage dispersif de microorganismes OGM.
V.1.2 PPhhaanneerroocchhaaeetteecchhrryyssoossppoorriiuumm
V.1.2.1 Classification
Phanerochaete chrysosporium est un basiodiomycète décrit en 1974 par Harold H. Burdsall, Jr (Burdsall, 1974). Ce champignon se développe sur les tissus ligneux de végétaux. Ses fructifications se présentent en fin basidiocarpes d’environ 250 µm formant une fine croûte blanche et ocre. Les hyphes de diamètre compris entre 3 et 9 µm sont faiblement ramifiés. Le mycélium présente classiquement des chlamydospores terminaux ou intercalaires de 50 à 60 µm de diamètre (Burdsall, 1985). La classification de ce microorganisme est présentée dans le Tableau 6.
30 Tableau 6 : Classification de Phanerochaete chrysosporium
Règne Fungi Division Basidiomycètes Classe Homobasidiomycètes Ordre Polyporales Famille Phanerochaetaceae Genre Phanerochaete Espèce chrysosporium Souche LCP: 51 995
V.1.2.2 Propriétés physico-chimiques
Phanerochaete chrysosporium est un organisme capable de dégrader la lignine via un cortège d’enzymes de type péroxydase. Deux enzymes ont été identifiées en particulier, la lignine péroxydase (LiP) et la manganèse péroxydase (MnP) (Valli et Gold, 1991). Depuis la fin des années 90, les capacités de Phanerochaete chrysosporium
à dégrader plusieurs contaminants organiques récalcitrants à la biodégradation ont été mises en évidence. En effet,
Phanerochaete chrysosporium est capable de dégrader plusieurs polychlorophénols. Pour des temps d’exposition de l’ordre du mois (entre 24 et 32 jours), on reporte des rendements de dégradation de 50% pour le 2,4-dichlorophénol (Valli et Gold, 1991) et de 61% pour le 2,4,5-trichlorophénol (Joshi et Gold, 1993). Des travaux ont montré que ce champignon pouvait également biotransformer du 2,7-dichloro-bibenzo-dioxine et du Dinitrotoluène (Valli et al., 1992).
Les PCB ont également été testés. Dietrich et al., montre que Phanerochaete chrysosporium est capable de dégrader des dichlorobiphényles dans des proportions modestes, 11,6 % en 28 jours (Dietrich et al., 1995). Plus récemment, des essais ont été menés sur des PCB extraits de sols contaminés. Des rendements de dégradation allant de 34 % à 73 % ont été obtenus pour des concentrations allant de 600 mg.L-1 à 3000 mg.L-1 (Ruiz-Aguilar et al., 2002).
D’autres études ont permis d’observer des rendements de dégradation de 89 % (De et al., 2006a) et 50 % (Kamei et al., 2006) pour du PCB 153 hexachloré.
Certaines de ces études mettent en évidence le rôle des péroxydases en condition lignolytique, i.e., en carence d’azote, notamment la LiP. Une voie métabolique a été proposée pour le 4,4’-dichlorobiphényle. Le premier
31 métabolite serait le PCB monohydroxylé. Ce métabolite peut, par la suite, subir une méthoxylation. Le PCB ainsi transformé subit la casse du noyau biphényle pour former des acides chlorobenzoïques (Kamei et al., 2006).
Cependant, Phanerochaete chrysosporium aurait également la capacité d’opérer une biotransformation de PCB en condition non-lignolytique en faisant intervenir d’autres enzymes, notamment la nitrate réductase. L’originalité de cette voie métabolique est la possibilité pour Phanerochaete chrysosporium d’opérer une déchloration réductive en condition aérobie (De et al., 2006a).
V.2 Identification des microorganismes non-cultivés
Afin de comprendre plus précisément les systèmes biologiques capables de bio transformer les PCB, il est nécessaire de connaître la composition de ces systèmes. Les techniques permettant d’identifier des bactéries ont évolué avec l’apparition et le développement de la génétique. L’arrivée de ces méthodes a bouleversé les classifications classiques. L’un des grands apports des techniques récentes est la possibilité d’étudier les bactéries non cultivables. Une grande majorité des bactéries n’a jamais été cultivée. Ceci est d’autant plus vrai pour les bactéries de l’Environnement présentes dans les sols et sédiments. Leur habitat est difficile à recréer en conditions artificielles. Ce paragraphe présente les différentes options permettant d’identifier des microorganismes dans un milieu complexe.
V.2.1 NNoottiioonnssdd’’ééccoollooggiieemmiiccrroobbiieennnnee
V.2.1.1 Généralités
Les bactéries sont des organismes procaryotes généralement classés selon une nomenclature de type « COFGER » i.e. Classe, Ordre, Famille, Genre, Espèce, Race. Pour les bactéries, la notion de Race est remplacée par celle de Souche. La notion d’espèce en microbiologie est différente de celle définie pour les Eucaryotes. La reproduction des bactéries étant asexuée, le critère d’interfécondité n’est pas applicable. La notion d’espèce pour les bactéries est historiquement basée sur une différenciation basée sur des critères morphologiques et biochimiques. Il n’est pas rare de voir des espèces changer de classification, notamment avec l’arrivée de la génétique. Une bactérie se nomme par convention en italique par son genre puis son espèce.
32
Tableau 7 : Exemple d’une classification évolutive : Burkholderia xenovorans.
Année Auteurs Classification
1986 (Bopp, 1986) Pseudomonas sp. LB400
1989 (Bopp, 1989) Pseudomonas putida LB400
1998 (Kumamaru et al., 1998) Burkholderia cepacia
1999 (Bartels et al., 1999) Burkholderia sp LB400
2004 (Goris et al., 2004) Burkholderia xenovorans