12A). Les contours de la racine sont facilement discernables sur cette vue transversale,

ainsi que les vaisseaux conducteurs (xylème et phloème). Il est à noter que les zones pour lesquelles aucun ion secondaire n’est détecté (noircies sur les images) correspondent à des zones arrachées (sans doute lors du polissage) constituées de vide (Figure III-12A et 13A).

Figure III-13. Cartes élémentaires acquises en NanoSIMS pour l’échantillon «enrichi» T14_2. (A) Une large zone est d'abord

balayée produisant des images de 90 X 90 µm. A partir de ces images rendant visible la racine entière (en vue transversale), certaines zones ont été zoomées pour donner des images à champ réduit de 25 X 25 µm (a et b).

A partir des hotspots localisés autour de la racine (Figure III-12), deux zones d’intérêt présentant un δ13C élevé ont été focalisées (Figure III-13). Un zoom est donc réalisé dans le but de se concentrer sur ces zones où le signal en 13C détecté est important et de localiser plus précisément les régions enrichies. Les zones balayées sur l’image ont été réduites pour donner des images de 25 x 25 µm. Sur les images des rapports isotopiques produites à partir des images des ions secondaires 12C- et 13C- les valeurs hautes de δ13C sont bien visibles et

56Fe16O -56Fe16O -12C14N -12C14N -12C- 13C -12C -12C- 13C -56Fe16O -A a b a b

localisées. Les images issues de la zone « a » vont être décrites (Figure III-14), les images acquises à partir de la zone « b » feront l’objet du chapitre suivant (IV).

Figure III-14. Images NanoSIMS et linescans obtenues après balayage de la zone a (Figure III-13a).

Les images obtenues par NanoSIMS après le scan de la zone a (Figure III-13) sont présentées dans la Figure III-14. Le long du segment tracé sur l’image composite (flèche

H R

12C- 13C- 12C14N

-blanche) les profils d’intensité pour les éléments 12C-, 13C-, 32S-, et 12C14N- sont observés. La distribution des éléments dans chaque cas est hétérogène, avec une zone notable localisée à 16-20 µm sur le segment. Une incorporation du 13C est remarquable par les « deux pics » (correspondant aux deux hotspots apparents sur l’image composite) où l’intensité de comptage du 13C- est élevée et corrélée avec des intensités élevées de l’ion 32S-. Les ions

12C14N- et 12C- sont toujours détectés à cet endroit, et le fait de les retrouver co-localisés montre qu’il s’agit de matériel biologique, mais le rapport 32S/12C14N diffère de la zone identifiant la racine (R).

Les cellules végétales (racine) ont été identifiées à l’aide des images élémentaires obtenues pour les ions secondaires 12C- et 12C14N- que l’on arrive clairement à co-localiser. L’image de l’ion secondaire 32S- est obtenue pour localiser la biomasse contenant des protéines (Kertesz and Mirleau, 2004; Li et al., 2008). Pour compléter l’identification de ces hotspots des ROIs ont été déterminées et subdivisées en 4 groupes de classe (§2.2.1) suivant leur ressemblance chimique (élémentaire et isotopique) (Figure III-15).

Figure III-15. ROIs et valeurs des rapports élémentaires associés pour chaque classe de ROIs déterminée : Hotspot, Racine,

Minéral et Résine.

L’identification de ces zones enrichies est complexe. Les images ne permettent pas à elles seules de les discriminer mais d’après la taille et la nature des éléments détectés ces deux

12C/12C14N 32S/12C14N 56Fe16O/12C Hotspot 0,65 ± 0,00 0,07 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Racine 0,33 ± 0,07 0,03 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Minéral 1,75 ± 0,39 0,42 ± 0,35 4,55 ± 3,93

hostpots pourraient correspondre à des bactéries. Des résultats similaires ont été obtenus pour la zone correspondant aux images de la Figure III-13b et sont discutés dans le Chapitre IV.

En effet, les bactéries adaptées à la pollution aux HAP sont capables de dégrader le polluant marqué et peuvent alors l’incorporer en partie dans leur métabolisme. Les microorganismes sont capables d'utiliser les HAP comme source de C via des voies métaboliques spécifiques et il a été montré que les bactéries peuvent transformer ou dégrader des HAP (Cerniglia, 1993; Pothuluri and Cerniglia, 1994) et notamment des HAP de 2 à 4 cycles (Kanaly and Harayama, 2000). De nombreux microorganismes sont capables de métaboliser des HAP à 3 cycles (Dean-ross et al., 2001) tel que le PHE.

Dans une précédente étude, Corgié et al. (2003) ont montré l’existence d’un gradient de densité bactérienne en fonction de la distance aux racines, avec un nombre plus important de bactéries, dont des bactéries dégradantes, au plus proche des racines. Cependant, la probabilité de les observer en utilisant la NanoSIMS est faible. En effet, les zones de balayage imposées par l’appareil sont limitées. De plus, la fréquence d’éventuelles bactéries enrichies au 13C est faible, il y a donc peu de chance de les observer. Pour confirmer la présence de bactéries dégradantes enrichies en 13C, il faudrait procéder à l’analyse de la totalité de la surface échantillonnée.

4. Conclusion

L’objectif de ces analyses à microéchelle a été de localiser précisément le carbone 13 issu du PHE dans les microenvironnements du sol et de la rhizosphère. Au cours de cette étude, un enrichissement a été observé mais n’a pas été visible partout, c’est le cas pour les agrégats de sol. Pour les racines, au contraire, les images 13C/12C indiquent la présence de points chauds fortement enrichis en 13C entourant les racines (et même dans l’épiderme ou rhizoderme). Plusieurs hotspots ont été identifiés après 14 jours d’expérimentation mais ne sont pas observables après 7 jours. Malgré tout, en regard des mesures de carbone isotopique dans les racines obtenues par IRMS ou par NanoSIMS, des différences sont perceptibles. Les résultats obtenus par IRMS montrent un enrichissement en carbone 13 (E13C) d’environ 0,05 % (R13C/12C ~ 0,0115) dans les tissus racinaires après 7 jours d’expérimentation et de 0,14 % (R13C/12C ~ 0,0125) approximativement après 14 jours. L’excès en 13C est moins marqué après 7 jours d’expérimentation, toutefois il est bien présent dans les racines. Le 13C-PHE ou

les 13C-métabolites ont pu être adsorbés sur la racine ou absorbés pour se retrouver dans les tissus.

L’analyse par NanoSIMS ne permet pas d’être exhaustif, puisque seulement une fraction du matériel biologique est analysée. Les résultats obtenus après analyses par NanoSIMS n’ont pas montré d’enrichissement significatif à 7 jours, néanmoins il est observé après 14 jours par cette technique (Figure III-12 à 15). A partir du traitement de ces images, il a été observé qu’au niveau des régions enrichies, les valeurs élevées en 13C ont été à chaque fois co-localisées avec le 12C14N- mais aussi avec le 32S-. Le rapport de ces deux éléments

32S/12C14Naugmente au niveau des hotspots, par rapport aux autres classes identifiées sur l’image comme la racine qui présente un rapport 32S/12C14Nmoins élevé (Figure III-15). La distribution de protéines peut être observée par les images indiquant l’intensité des ions

12C14N- (indicateur de biomasse en co-localisation avec l’ion 12C-) et l’espèce d’ion 32S-. Les différentes informations tirées de ces résultats suggèrent que les hotspots peuvent correspondre à des bactéries, cependant cette hypothèse sera discutée de manière plus approfondie dans le chapitre suivant (IV).

Cependant, les analyses NanoSIMS n’ont pas permis d’observer de points chauds dans les agrégats de sol, ce qui pourrait être inhérent à la préparation des échantillons de sol.

Pour aller plus loin et identifier les différentes caractéristiques ultra-structurales du matériel biologique présent et le compartiment dans lequel est retrouvé le composé marqué, d’autres techniques pourraient être utilisées en complément de la NanoSIMS comme la microscopie électronique à transmission (MET) (Carpenter et al., 2013). Des techniques complémentaires sont couramment utilisées pour appuyer et confirmer les résultats souvent insuffisants obtenus par NanoSIMS. Dans notre cas, il n’a pas été possible de combiner MET et NanoSIMS puisque les échantillons produits n’étaient pas adaptés à des observations nécessitant des lames fines.

Pour les agrégats de sol, des méthodes comme la technique de fractionnement par densimétrie pourraient être utilisées dans ce genre d’étude. En effet, elle permet de désagréger le sol et d’obtenir différentes fractions qui pourraient être observées individuellement en NanoSIMS (Hatton et al., 2015). La préparation serait moins laborieuse, le carbone marqué moins dilué et pourrait être localisé plus précisément dans les différents complexes organo-minéraux extraits.

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Chapitre IV. Dynamique des