O sistema MMR em humanos, começou a ser caracterizado somente a partir de 1993, quando Kolodner e colaboradores clonaram, usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), o primeiro gene MMR humano, o hMSH2 (NUNN et al., 2003). Hales (2005) afirmou que esses mecanismos de reparo são essenciais para manter a integridade genética celular diante dos constantes ataques realizados por radicais livres e fatores exógenos capazes de alterar a estrutura cromossômica normal da célula.
O MMR é o sistema responsável por reparar bases nitrogenadas mal pareadas durante a síntese de DNA. Essas bases mal pareadas ocorrem em regiões que apresentam sequências repetidas de nucleotídeos no DNA, conhecidas como regiões microssatélites (PONTES et al., 2005; FERNANDES et al., 2008). Esse sistema realiza excisão e ressíntese de porções mal pareadas do DNA recém-sintetizado. Para realizar sua função, o MMR rastreia o DNA e quando encontra erros promove o reparo e imediatamente a DNA polimerase é convocada para repetir a síntese. Isso funciona porque a taxa de erro da DNA polimerase é baixa, logo quando o MMR corrige o erro ocorrido na primeira síntese do DNA ele permite que a DNA polimerase sintetise novamente aquela região, sendo improvável um novo erro na mesma região. As principais proteínas envolvidas no processo são a MutS e a MutL (KOLODNER; MARSISCHKY, 1999; JASCUR; BOLAND, 2006; JUN; KIN; BAN, 2006).
Os genes do MMR em humanos são homólogos aos encontrados na bactéria Escherichia coli e na levedura Saccharomyces cerevisiae (JIRICNY, 2006; SEIFERT; REICHRATH, 2006). O sistema MMR humano é composto por quatro heterodímeros: MutSα, MutSβ, MutLα e MutLβ. O heterodímero MutSα é formado pelas proteínas hMSH2 e hMSH6; O heterodímero MutSβ é constituído pelas proteínas hMSH2 e hMSH3; o heterodímero MutLα é formado pelas proteínas hMLH1 e hPMS2 e o heterodímero MutLβ pelas proteínas hMLH1 e hMLH3 (KOLODNER; MARSISCHKY, 1999; SEIFERT; REICHRATH, 2006). O processo de reparo de DNA é conduzido por um grupo de genes específicos, citando-se: hMLH1, hMSH2, hMSH3, hPMS1, hPMS2, hMSH6 e hMLH3
(PEDRONI et al., 2007). Vale ressaltar que outros genes foram descritos na literatura (JUN; KIM; BAM, 2006) sem, contudo, apresentarem funções específicas.
Saito et al. (2003) consideraram que os genes hMLH1e hMSH2 são os de maior importância, já que o processo de reparo depende diretamente da atuação eficiente das proteínas produzidas pelos mesmos, além de que defeitos no sistema de reparo de DNA são mais comumente associados com sua perda funcional, o que resulta na mudança fenotípica, originando uma MSI. O gene hMLH1 está localizado no cromossomo 3p21, sendo composto por 19 exóns e codifica a proteína hMLH1 de 756 aminoácidos e peso molecular 84,6kDa. O gene hMSH2 está localizado no cromossomo 2p16, é composto por 16 exóns e codifica a proteína hMSH2 de 934 aminoácidos e peso molecular 104,7kDa (NUNN et al., 2003; STOJIC; BRUN; JIRICNY, 2004; JASCUR; BOLAND, 2006; JIRICNY, 2006; JUN; KIN; BAN, 2006; O´BRIEN; BROWN, 2006).
Relata-se que as proteínas de reparo do MMR são responsáveis por diversas funções, agindo tanto de forma direta como na interação com outras proteínas. A principal função do sistema é reparar erros gerados durante a replicação do DNA, aumentando a fidelidade deste processo. Uma outra função é a diversificação de anticorpos que são formados por mutações em genes da imunoglobulina (JIRICNY, 2006; JUN; KIN; BAN, 2006; KUNZ; SAITO; SCHÄR, 2009).
A detecção de danos no DNA pelo sistema MMR pode induzir a ativação dos checkpoints durante o ciclo celular. Tem sido sugerido também que as proteínas MMR exercem um papel direto na via de sinalização da apoptose. Neste cenário, o reconhecimento de danos ao DNA pelo MMR, seria suficiente para desencadear a parada do ciclo celular e apoptose. Apesar da principal e mais conhecida função do MMR ser o reparo do DNA, existem evidências que as proteínas MMR participam dos eventos de recombinação durante a meiose. Um dos grandes desafios da pesquisa molecular em câncer na atualidade é entender como o MMR participa ao mesmo tempo de processos ligados à estabilidade genômica e contribui para a morte celular (JIRICNY, 2006; SEIFERT; REICHARTH, 2006).
De forma geral, o sistema MMR é um sistema de excisão e ressíntese, processo esse que pode ser didaticamente dividido em 4 etapas: I. Reconhecimento do erro por proteínas MutS; II. Recrutamento de enzimas de reparo; III. Excisão da sequência incorreta; IV. Ressíntese pela DNA polimerase (Figura 2) (STOJIC; BRUN; JIRICNY, 2004; JASCUR; BOLAND, 2006; JIRICNY, 2006; JUN; KIN; BAN, 2006; O´BRIEN; BROWN, 2006; TOBÓN-ARROYAVE et al., 2009; MARTIN et al., 2010).
As regiões com pareamentos errados, principalmente do tipo G-T, são reconhecidas, em humanos, por homólogos de MutS, denominados hMSH, que ainda não possuem uma estrutura bem definida. Os heterodímeros MutSα, representados por uma molécula de hMSH2 e uma molécula de hMSH6, reconhecem incompatibilidades do tipo base/base e curtos loops de inserção/deleção; MutSβ consiste na combinação entre hMSH2 e hMSH3 e reconhecem loops mais longos. Proteínas hMSH possuem um sítio de ligação de adenosina trifosfato (ATP) por molécula, cuja ocupação determina as propriedades de ligação do complexo MutS: na presença de adenosina difosfato (ADP) MutS reconhece e liga-se fortemente as incompatibilidades ou erros, enquanto que na presença de ATP o complexo se fecha, agindo como uma braçadeira deslizante que se liga à fita dupla de DNA nas regiões mal pareadas (STOJIC; BRUN; JIRICNY, 2004; PONTES et al. 2005; JASCUR; BOLAND, 2006; JIRICNY, 2006; JUN; KIN; BAN, 2006; O´BRIEN; BROWN, 2006; SEIFERT; REICHRATH, 2006; TOBÓN-ARROYAVE et al., 2009; MARTIN et al., 2010).
A ligação DNA/MutS/ATP, via hMSH2, recruta o complexo MutLα (hMLH1 e hPMS2), homólogos de MutL da E. coli, formando um complexo ternário e promovendo a sinalização intracelular para iniciar o processo de excisão de reparo do erro. Ocorre então a interação entre os complexos de MutL e MutS, os quais agem deslocando a DNA polimerase e o PCNA a partir da fita molde, recrutando a exonuclease 1 (Exo 1) e outras proteínas necessárias para excisionar o novo trecho que havia sido produzido até o local da incompatibilidade ou erro. A Exo 1 tem sido estudada tanto geneticamente e bioquimicamente. Estudos in vitro demostram que ela pode mediar a excisão de uma fita de DNA do local em que se encontra a fita até o local da incompatibilidade, por vezes, englobando até 1000 nucleotídeos e podendo se estender até 150 nucleotídeos após o local do erro, a excisão pode ocorre tanto no sentido 3´→5´ como no sentido 5´→3´. A Exo 1 faz a excisão da sequência incorreta de DNA, uma vez removido o erro, Exo 1 não é mais estimulada e passa a ser inibida. A DNA polimerase, principalmente o tipo sintetiza o novo DNA, utilizando a fita-mãe como molde. Por fim, a DNA ligase 1 sela a ruptura remanescente e finaliza o processo de reparo (STOJIC; BRUN; JIRICNY, 2004; PONTES et al. 2005; JASCUR; BOLAND, 2006; JIRICNY, 2006; JUN; KIN; BAN, 2006; O´BRIEN; BROWN, 2006; SEIFERT; REICHRATH, 2006; TOBÓN-ARROYAVE et al., 2009; MARTIN et al., 2010).
Figura 2 Reparo de um nucleotídeo com erro de pareamento. (a) A DNA polimerase erroneamente insere na fita
filha uma base G não complementar a T, criando um erro na fase S. (b) O heterodímero de hMSH2 e hMSH6, vinculado a ADP, em configuração aberta checa o DNA, ao reconhecer o erro ocorre uma troca de ADP para ATP e MutSα se fecha na região do erro. (c) A braçadeira formada pode migrar em qualquer direção a partir do erro, podendo recrutar braçadeiras MutSα adicionais. O movimento no sentido 5´→3´ eventualmente encontrará o complexo PCNA/DNA polimerase e poderá substituir as enzimas envolvidas na síntese de DNA. (d) Exo 1 exisiona a fita até o local onde ocorreu o erro, eliminando G. (e) O erro é corrigido pela ressíntese. FONTE: Adaptado de Jascur e Boland (2006).
Tem sido relatado que a inativação de genes do MMR resulta em elevadas frequências de pequenas deleções ou inserções com repetição de sequências simples, referidas como MSI (PEDRONI et al., 2007).
A perda da função dos genes MMR requer a inativação homozigótica em nível celular, ou seja, os dois alelos selvagens devem ser inativados. Regiões microsatélites são caracterizadas por sequências curtas de nucleotídeos (2 a 5 pares de nucleotídeos) repetidas de 15 a 30 vezes e distribuídas pelo genoma humano, as quais são susceptíveis à ocorrência de nucleotídeos mal pareados. As mutações nos genes do sistema MMR ou a inativação do mesmo criam um ambiente propício à transformação maligna, ao permitir que ocorram mutações em outros genes, como em alguns genes reguladores do crescimento celular, supressores tumorais ou em genes responsáveis pelo reparo do DNA e que realizam a
apoptose (CHUNG; RUSTGI, 2003; PONTES et al., 2005; JASCUR; BOLAND, 2006; FERNANDES et al., 2007).
Por exemplo, Hussein, El-Ghorori e El-Rahman (2006) reportaram que a expressão da proteína p53 e hMSH2 é coordenada por um mecanismo comum, onde a presença de uma ligação específica na p53 promove ativação da proteína hMSH2 para o reparo do DNA, citando também que a proteína p53 pode estar envolvida no mecanismo de reparo de DNA, ligando-se a genes do sistema MMR. Deste modo, os autores propõem que existem interações entre proteínas de controle do ciclo celular e hMSH2 durante a tumorigênese. Portanto, alterações nos genes do sistema MMR podem conduzir a disfunções nas proteínas de checagem do ciclo celular como a p53.
As proteínas de reparo têm sido relacionadas com a função da Bcl-2 que é uma proteína anti-apoptótica, superexpressa em alguns tipos de câncer. Estudos relataram que a expressão de Bcl-2 conduziu à baixa regulação de hMSH2, através da inibição do fator de transcrição E2F-1 (que exibe papel importante no controle do crescimento celular) presentes em regiões promotoras de hMSH2, o que levou a concomitante perda de atividade MMR. Os autores concluíram que a Bcl-2 pode induzir a tumorigênese, inibindo a apoptose e induzindo a baixa regulação do sistema MMR (YOUN et al., 2005).
Sugere-se que situações de hipóxia e estresse oxidativo, como as que ocorrem em reações de inflamação, em microambientes tumorais causam a baixa regulação das proteínas MMR, fazendo com que as células percam parcialmente sua função de reparo (JASCUR; BOLAND, 2006). Lazzaro et al. (2009) mencionaram que a relevância funcional do MMR é reforçada pelo fato de que em células com MMR não funcional, as taxas de mutações espontâneas estão aumentadas, com a presença de MSI.
Células com alterações deficientes no MMR possuem um “genótipo mutante”, no qual a taxa de mutação espontânea é muito elevada. A Síndrome do Câncer Coloretal Hereditário sem Polipose ou Síndrome de Lynch (HNPCC) é produto de mutações herdadas nos genes do MMR (hMLH1 e hMSH2) e constitui um exemplo de neoplasia maligna de caráter hereditário relacionada à falha no MMR (O´BRIEN; BROWN, 2006). A deficiência no MMR é uma das mais compreendidas formas de instabilidade genética em câncer colorretal (CRC). A falta de reparo associada a erros na replicação, devido a defeitos no sistema MMR permite a persistência e acúmulo de mutações sobre o genoma, mas especialmente em regiões microssatélites, dando origem a MSI. A alta freqüência de MSI é a marca registrada da forma mais comum de doenças hereditárias associadas ao CRC, conhecida como HNPCC. Mutações
nos genes hMLH1 e hMSH2 estão comprovadamente associados à carcinogênese nessa síndrome (ZHANG et al., 2008; HITCHINS; WARD, 2009).
Além de influenciar no desenvolvento de neoplasias malignas, problemas no sistema MMR estão associados ao processo de morte celular em tratamentos quimioterápicos, da forma que células deficientes de proteínas MMR não respondem a agentes alquilantes e a drogas antineoplásicas, como a cisplatina e a carboplatina. Relatou-se que células MMR- deficientes são até 100 vezes mais resistentes à morte por agentes alquilantes, 2 a 4 vezes mais resistentes ao tratamento por cisplatina (quimioterapêutico utilizado principalmente no tratamento de cânceres de ovário e testículos) e tolerantes ao antimetabólico 6-tioguanina comumente utilizado no tratamento de leucemias e como imunossupressor em pacientes transplantados (STOJIC; BRUN; JIRICNY, 2004; JASCUR; BOLAND, 2006; JIRICNY, 2006; O´BRIEN; BROWN, 2006; MARTIN et al., 2010). Strathdee et al. (1999) verificaram resistência à cisplatina em linhagens de carcinomas ovarianos portadores de defeitos no MMR.
Células com defeitos no MMR são relativamente resistentes ao 5-fluorouracil (5- FU)5-FU, um agente quimioterápico comumente empregado no tratamento do câncer coloretal. (TAJIMA et al., 2004).
O tratamento de neoplasias com agentes metilantes resulta na fosforilação do p53 e indução a apoptose, uma resposta que depende da presença funcional do hMutSα e hMutLα, principalmente o MSH2. O sistema MMR participa da indução a apoptose em células atingidas pelos raios UVB, relacionada com a progressão do CE de lábio. Este mecanismo de morte é significativamente reduzido em células deficientes de MMR, o que se correlaciona com diminuição da ativação do p53 (fundamental para induzir a parada no ciclo celular na fase G1 em células atacadas pela radiação UV). Isso sugere que o MSH2 pode atuar como mediador da indução do p53 à apoptose pós-UVB (JUN; KIM; BAN, 2006; SEIFERT; REICHRATH, 2006; LAZZARO et al., 2009).
A literatura mostra a relação de defeitos no sistema MMR com a radiação ionizante. Acredita-se que as proteínas do MMR são importantes para o reconhecimento de erros provenientes da radiação ionizante e indução a parada no ciclo celular na fase G2/M, participando também no processo de apoptose pós-radiação ionizante. Dados têm sugerido que a sensibilidade das células à radiação ionizante pode estar associada com níveis das proteínas MMR, onde células deficientes em hMLH1 e hMSH2 apresentam-se radioresistentes. Isso interfere na eficácia do tratamento radioterápico (MARTIN et al., 2010).
A expressão anormal de proteínas do MMR pode ser detectada através da imunoistoquímica, a qual pode mostrar ausência, redução ou superexpressão das proteínas hMLH1 e hMSH2. Esses dados podem sugerir que o sistema MMR está alterado, não exercendo corretamente sua função de correção de erros durante a replicação do DNA, uma vez não corrigido esses erros, a célula acumulará mutações, facilitando o processo de carcinogênese (JASCUR; BOLAND, 2006; FERNANDES et al. 2008; POULOGIANNIS; FRAYLING; ARENDS, 2010).
Muito embora, a deficiência no MMR tenha sido relacionada predominantemente com carcinomas colorretais (RIGAU et al., 2003), uma variedade de tumores malignos, tais como carcinomas de mama, ovário, gástrico e de cabeça e pescoço (NUNN et al., 2003; O´BRIEN; BROWN, 2006; SEIFERT; REICHRATH, 2006) têm mostrado, através da imunoistoquímica, fraca expressão das proteínas hMLH1 e hMSH2.
Na pesquisa de Xinarianos et al. (2000) foi demonstrada redução da expressão das proteínas hMLH1 e hMSH2 em adenocarcinomas de pulmão. Skarda et al. (2006) não encontraram correlação entre a sobrevivência de pacientes portadores de adenocarcinomas de pulmão e a expressão das proteínas hMSH2 e hMLH1.
Saito et al. (2003) pesquisaram a expressão imunoistoquímica das proteínas hMLH1 e hMSH2 emsarcomas alveolares de partes moles. Identificaram que houve perda de expressão da proteína hMSH2 em 2 (18,2%) dos 11 casos analisados, ambos os casos apresentaram mutações genéticas no gene correspondente (hMSH2). A ausência de expressão da proteína hMLH1e presença de mutação no gene foi observada em 3 (27,3%) dos 11 casos analisados. Os demais casos da pesquisa mostraram marcação difusa para ambas proteínas.
A expressão da proteína hMSH2 foi observada, de forma homogênea, em hepatócitos normais, células inflamatórias mononucleares (linfócitos), ductos biliares, nódulos cirróticos, nódulos macroregenerativos e displasias nodulares na pesquisa realizada por Hussein (2004). Para carcinomas hepatocelulares, a forma de marcação foi bem heterogênea, variando de células com marcação positiva à negativa. A média de marcação da proteína hMSH2 foi reduzida em carcinomas hepatocelulares em comparação aos demais tecidos analizados.
Helal et al. (2010), em um estudo realizado no Egito, afirmaram que a expressão reduzida das proteínas hMLH1 e hMSH2 em carcinomas hepatocelulares é um evento precoce na carcinogênese deste tumor e possui significante associação com a gradação histológica do mesmo.
Ju et al. (2006) detectaram, em um estudo feito com adenocarcinomas endometrióides esporádicos, que 24% destes apresentavam alta frequência de MSI. Observou-se ainda que
64% tinham perda de expressão nuclear da proteína hMLH1, da mesma forma que 38% mostraram ausência de marcação para o hMSH2. Os resultados desse estudo correlacionaram significativamente o status da MSI com a expressão das proteínas hMLH1 e hMSH2, onde a perda da expressão dessas proteínas está correlacionada com a presença de MSI. Sugeriu-se que alterações na expressão desses genes podem estar associadas à patogênese do adenocarcinoma endometrióide esporádico.
Naqvi et al. (2008) encontraram hipermetilação dos genes hMLH1 e hMSH2 em 43,5% (sendo, 66,9% localmente avançados) e 16% (sendo, 21,3% localmente avançados) dos pacientes com câncer de mama, respectivamente, sugerindo que a inativação destes dois genes pode atuar como marcadora de etapas específicas para definir estágios localmente avançados do câncer de mama.
Na pesquisa de Rubio-Del-Campo et al. (2008), constatou-se que a MSI tem valor prognóstico em tumores do trato urinário e que a baixa expressão das proteínas codificadas pelo sistema MMR está asociada a tumores de alto grau.
Algumas pesquisas analisando a participação das proteínas hMLH1 e hMSH2 em tumores de cabeça e pescoço têm sido realizadas, mencionando-se a de Liu et al. (2002) que sugeriram que a inativação do sistema MMR é um importante mecanismo relacionado a tumorigênese de carcinomas de cabeça e pescoço.
Castrilli et al. (2001), sugeriram que o desenvolvimento e a progressão do ameloblastoma não depende de defeitos no sistema MMR, embora acreditem que estudos nessa área, com ênfase na MSI, ainda são necessários para comprovar esta hipótese. Nesta pesquisa todos os ameloblastomas apresentaram imunomarcação das proteínas hMLH1 e hMSH2, possuindo um padrão moderado de marcação, a qual se restringiu ao núcleo.
Tobón-Arroyave et al. (2009) analisaram através da imunoistoquímica a expressão das proteínas hMSH2 e hMLH1 em adenomas pleomórficos de glândulas salivares. O grupo classificou os adenomas pleomórficos em 2 grupos, aqueles com alto e aqueles com baixo risco de transformação maligna, através da utilização dos seguintes parâmetros: 1. Clínicos que incluiam o tempo de evolução da lesão, a idade estratificada, e o tamanho da lesão 2. Histológicos que incluiam a variante tumoral (rico, intermediário e pobre em estroma), presença de hialinização (normal, leve e moderada), presença de calcificações, de necrose e de atipias celulares. Como resultados, encontraram que deficiências nestas proteínas estavam mais presentes em adenomas pleomórficos de alto risco, sugerindo que este evento pode estar relacionado à progressão desta neoplasia. Os autores concluiram que deficiências nos sistemas
MMR de reparo de DNA podem ser utilizadas como indicadoras de prognóstico para os adenomas pleomórficos.
Segundo Fernandes et al. (2007), as proteínas hMLH1 e hMSH2 são expressas na mucosa oral normal, principalmente na camada basal e suprabasal. Os autores observaram que a expressão da proteína hMLH1 no epitélio normal aumenta com o uso do tabaco e é reduzido com a presença da inflamação no tecido conjuntivo. Wei et al. (1998) também sugeriram que a redução na expressão dos genes MMR (hMLH1, hPMS1 e hGTBP/hMSH6) é geneticamente ou epigeneticamente influenciada por exposição e acúmulo a carcinógenos ambientais.
Caldeira et al. (2011a) relataram que a imunoepressão da proteína hMLH1 foi inversamente proporcional ao grau de displasia oral em leucoplasias intraorais. Afirmaram ainda que a contagem total de células epiteliais sem considerar suas camadas (basal e suprabasal) parece ser de maior relevância clínica do que a avaliação por camadas. Os resultados do estudo também sugeriram que alterações no MMR são eventos iniciais na carcinogênese oral.
Caldeira et al. (2011b) realizaram um estudo com 62 casos de leucoplasias orais (17 sem displasia, 19 com displasia leve, 16 com displasia moderada e 10 com displasia severa), avaliando a expressão das proteínas p53 e hMLH1 e o grau de proliferação celular, através da técnica AgNOR. Observaram que imunoexpressão da hMLH1 reduz com a gradação das leucoplasias orais em fenótipos mais displásicos, enquanto a expressão da p53 e a proliferação celular (AgNOR) aumentam com a aquisição de fenótipos mais displásicos nesssa lesões. Os autores concluiram que alterações nos padrões de imunoexpressão da hMLH1 e p53 parecem ser eventos precoces na carcinogênese oral e que as células epiteliais diminuem a capacidade de reparo e aumentam o grau de proliferação celular, a medida que adquirem fenótipos mais displásicos.
Fernandes et al. (2008) analisaram através da imunoistoquímica a expressão das proteínas hMLH1 e hMSH2 em 46 casos de CEs, verificando que o grau histológico de malignidade interfere na imunoexpressão da proteína hMLH1 (superexpressão em tumores bem diferenciados), não encontrando relação na expressão da proteína hMSH2. Adicionalmente, os autores sugeriram que a expressão reduzida desta proteína em tumores menos diferenciados pode refletir a exaustão do sistema MMR.
Czerninski et al. (2009) avaliaram imunoistoquimicamente, amostras de mucosa oral e CEs, localizados em diferentes sítios da cavidade oral e observaram que todas as amostras de epitélio normal (n = 10) mostraram positividade nuclear para ambas proteínas hMLH1 e
hMSH2, predominante nas camadas basal e parabasal. Das 10 amostras de CEs analisadas, a