Étude de la régulation de Prox1 par les PPARs dans les cellules INS1-E

Comme nous avons vu que les SNPs de PROX1 qui sont associés au DT2 sont localisés dans les régions régulatrices du gène et que certains d’entre eux modulent l’expression de gène rapporteur, nous nous sommes intéressés à l’étude de la

régulation de Prox1 dans les cellules β−pancréatiques. A l’aide du logiciel Genomatix,

nous avons recherché la présence de sites consensus pour des facteurs de transcription sur le promoteur et l’intron 1 du gène Prox1. Nous avons mis en évidence la présence de 11 PPRE (PPAR Response Element) au niveau du promoteur et de l’intron 1 du gène Prox1 (Figure 24).

Figure 24 : PPRE présents au niveau du promoteur et de l’intron 1 du gène PROX1.

Les PPRE sont des sites consensus de fixation des PPARs. Ces derniers sont des facteurs de transcription connus pour jouer un rôle important dans la survenue du

DT2, notamment PPARγ [Altshuler et al. 2000] [Ridderstrale et al. 2009]. En effet, les

PPARs jouent un rôle physiologique important dans la captation des lipides, la régulation du métabolisme lipidique [Berger et al. 2002] et la sensibilité à l’insuline. De

plus, les glitazones (agonistes synthétiques de PPARγ) sont utilisés comme agent

sensibilisateur à l’insuline chez les patients diabétiques. Afin de vérifier la régulation

potentielle de l’expression de Prox1 par les PPARs, les cellules β−pancréatiques

INS-1E et MIN6 ont été traitées avec les agonistes spécifiques des 3 PPARs, comme expliqué dans le paragraphe II.5 de la partie Matériels et Méthodes.

Dans un premier temps, nous avons vérifié que les différents traitements avaient bien fonctionné en analysant l’expression de certains gènes cibles connus des

PPARs. En effet, d’après la littérature, PPARγ active par exemple l’expression de

FATP et PPARG lui-même, PPARα active l’expression de CPT1 et PPARA lui-même

et PPARβ/δ active l’expression de CD36 et CPT1. Nous avons donc vérifié par qPCR

en temps réel que l’activation des PPARs par leurs agonistes respectifs entraînait l’augmentation de l’expression de ces différents gènes cibles.

Concernant les cellules MIN6, bien que les traitements aient été effectués à plusieurs reprises, les résultats des gènes témoins positifs étaient trop hétérogènes pour pouvoir être interprétables dans ces cellules.

Dans les cellules INS-1E, suite à un traitement avec les agonistes des PPARs, l’expression des gènes cibles des PPARs est augmentée comme attendus, validant ainsi les traitements (Figure 25). Dans un second temps, nous avons analysé par qPCR (Figure 25) et par Western blot (Figure 26), l’expression de PROX1 suite à l’activation des différents PPARs par leurs agonistes respectifs.

Figure 25 : Analyses par qPCR des effets des traitements avec les agonistes des PPARs sur l’expression de leurs gènes cibles et de PROX1.

Les cellules INS1-E ont été traitées avec les agonistes des PPARs ou du DMSO pendant 48h. A) Traitement avec la troglitazone (PPARγ), B) traitement avec le W-14643 (PPARα) et C) traitement avec le L165041 (PPARβ/δ). Leurs effets ont été mesurés par qPCR en temps réel. Le gène TFIIB a été utilisé comme gène de référence. Les résultats présentés sont représentatifs d’au moins 3 expériences. *p<0.05 (test exact non-paramétrique Mann & Whitney).

Figure 26 : Analyses par Western blot des effets des traitements avec les agonistes des PPARs sur l’expression de PROX1.

Les cellules INS1-E ont été traitées avec les agonistes des PPARs ou du DMSO pendant 48h.

Leurs effets sur l’expression de PROX1 ont été mesurés par Western blot. L’expression de la protéine RAN (RAs-related Nuclear protein) a été utilisée comme référence. Les résultats présentés sont représentatifs d’au moins 3 expériences. *p<0.05 (test exact non-paramétrique Mann & Whitney). DMSO = DiMéthylSulfOxyde

D’après ces résultats, l’expression de PROX1 n’est pas modulée (que ce soit en ARNm ou en protéine), suite à un traitement avec le WY-146043 ou avec le L165041. Cependant, lorsque les cellules INS1-E sont traitées avec 50 µM de

troglitazone (activant ainsi spécifiquement PPARγ), l’expression de PROX1 est inhibée

d’environ 45% au niveau de l’ARNm (p=1,5.10^-4) et d’environ 35% au niveau protéique

(p=0,03).

Contrairement à PPARα et PPARβ/δ, PPARγ semble donc inhiber l’expression

de PROX1, probablement en se fixant au niveau des PPRE de ce dernier.

Suite à ces résultats, nous avons réalisé des traitements avec différentes concentrations en troglitazone afin de voir s’il existe un effet dose de l’activation de

PPARγ sur l’expression de PROX1 (Figure 27).

Figure 27 : Effet dose-dépendant d’un traitement à la troglitazone sur l’expression de PROX1. Les cellules INS1-E ont été traitées avec 5, 25 ou 50 µM de troglitazone ou du DMSO, pendant 48h. A) L’effet de la troglitazone a été mesuré par qPCR en temps réel. Le gène TFIIB a été utilisé comme gène de référence. Les résultats présentés sont représentatifs d’au moins 3 expériences. *p<0.05 (test exact non-paramétrique Mann & Whitney).

B) L’effet de la troglitazone a été mesuré par Western blot. L’expression de RAN a été utilisée comme référence. Les résultats présentés sont représentatifs d’au moins 3 expériences. *p<0.05 (test non-paramétrique Mann & Whitney).

D’après ces résultats, nous constatons que 5 µM de troglitazone conduit à une sur-expression de l’ARNm de Prox1 d’environ 80%. Cependant, cette sur-expression n’est pas retrouvée au niveau protéique. L’augmentation progressive de la concentration en troglitazone (25 puis 50 µM) entraîne une diminution également

A

progressive de l’expression de PROX1, jusqu’à une inhibition d’environ 40% obtenue avec 50 µM de troglitazone, à la fois au niveau de l’ARNm mais également au niveau protéique (Figures 25, 26 et 27). Il existe donc un effet dose-dépendant d’un traitement à la troglitazone sur l’expression de PROX1.

Nos résultats peuvent être mis en parallèle avec une étude réalisée par Kawai et al., montrant qu’un traitement de 48h des cellules INS-1 avec 5 µM de troglitazone augmente la sécrétion d’insuline en réponse au glucose (5,6 ou 11 mM),

probablement via PPARγ et que plus la concentration en troglitazone augmente (à

partir de 10 µM), plus la sécrétion d’insuline diminue [Kawai et al. 2002]. Un traitement des cellules INS-1E avec 5 µM de troglitazone entraîne donc une augmentation de l’expression de PROX1 et de la sécrétion d’insuline, et plus la concentration en troglitazone augmente, plus l’expression de PROX1 et la sécrétion d’insuline diminuent. Ces résultats corroborent nos résultats de siRNA montrant que PROX1

semble influencer la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par les cellules β

-pancréatiques.

En conclusion, l’expression de Prox1 semble être modulée par PPARγ,

probablement via sa fixation sur les PPREs présents au niveau du promoteur ou de l’intron 1 du gène Prox1. Des retards sur gel pourraient être menés pour vérifier cette hypothèse. Les concentrations en WY-146043 et en L165-041 que nous avons testées correspondant aux concentrations les plus élevées utilisées dans la littérature, il pourrait également être intéressant d’étudier l’impact de ces agonistes à des concentrations plus faibles. En effet, comme nous avons pu le constater avec la troglitazone, la modulation de l’expression de PROX1 varie selon sa concentration.