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Introduction
L’importance du silicium (Si) chez les plantes a depuis plusieurs décennies été rapportée. Retrouvé en très grandes quantités dans l’environnement, le Si n’est cependant par considéré comme un élément essentiel pour les plantes. Il se retrouve disponible pour les plantes sous
la forme d’acide silicique (Si(OH)4) et peut être absorbé par les racines à des pH inférieurs à
9 (Ma et al., 2001). Cette molécule se caractérise par une solubilité dans l’eau jusqu’à 2 mM à 25°C et une polymérisation sous forme de gel à des concentrations supérieures (Takahashi, 1978). Dans la solution du sol, l’acide silicique se retrouve généralement à des concentrations allant de 0,1 à 0,6 mM (Ma et al., 2001). Après l’absorption du Si dans les racines, la molécule atteint le xylème et est transportée dans les parties aériennes pour y être déposée sous forme
de silice amorphe ou de gel de silice (SiO2 + nH20). Le Si est un élément peu mobile, ce qui
explique son accumulation principalement dans les tissus âgés de la plante (Ma et Yamaji, 2006).
Parmi les effets bénéfiques du Si chez les plantes, on remarque principalement une meilleure résistance à divers stress abiotiques et biotiques (Coskun et al., 2019). On rapporte que le Si favorise une meilleure tolérance à la toxicité des métaux, aux stress hydriques et salins. De même, l’élément améliore la résistance des plantes exposées aux basses températures, aux déséquilibres nutritifs, aux extrêmes de température et aux radiations UV. Toutefois la majorité des effets observés du Si sont associés à une meilleure défense contre les stress biotiques. C’est particulièrement au niveau des infections fongiques que le rôle prophylactique de cet élément se fait remarquer (Fauteux et al., 2005). Les études rapportent que les champignons biotrophes et hémibiotrophes sont les organismes les plus réprimés par le Si chez les plantes. Les effets du Si présentent deux particularités bien reconnues aujourd’hui. Dans un premier temps, seules les plantes ayant la capacité d’accumuler l’élément peuvent en bénéficier. D’autre part, ses effets bénéfiques sont observés seulement en conditions de stress.
Bien que le Si soit généralement abondant dans les sols, sa proportion dans les tissus des plantes terrestres varie entre 0,1 et 10 % du poids sec (Liang et al., 2015). En réalité, les plantes n’ont pas toutes la capacité d’absorber le Si en grande quantité, ce qui explique pourquoi elles sont catégorisées selon leur teneur en cet été élément. On retrouve les faibles
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accumulateurs (< 0,5 %), les accumulateurs intermédiaires (0,5 % - 1,5 %), et les forts accumulateurs (˃ 1,5 % du poids sec) (Hodson et al., 2005). Cette variabilité d’absorption est aujourd’hui expliquée par la présence de transporteurs de Si au niveau des cellules racinaires, appelés Lsi1 et Lsi2 (Ma et al., 2006; Ma et al., 2007). Le transporteur Lsi1 est une aquaporine membranaire qui permet l’entrée en influx du Si de la solution du sol dans les cellules racinaires. Sa présence explique en grande partie la forte accumulation de Si possible chez les plantes. Les Poacées rassemblent plusieurs espèces porteuses du gène Lsi1 et, de ce fait, sont de fortes accumulatrices de Si. À l’inverse, les espèces de la famille des Brassicaceae comme Arabidopsis thaliana et Brassica napus figurent parmi les faibles accumulateurs et ne possèdent pas de gène Lsi1.
Des études réalisées chez Arabidopsis thaliana transformé génétiquement avec le gène d’absorption du Si Lsi1 ont révélé que l’ajout de ce transporteur permettait à la plante de bénéficier des effets du Si (Vivancos et al., 2015). Ces auteurs ont en effet démontré que la présence du gène TaLsi1 chez Arabidopsis contribuait à une meilleure résistance au blanc poudreux. Il semblerait, par conséquent, que les effets du Si sont universels et que la capacité d’absorption de l’élément dans les tissus est le principal facteur limitant les plantes à en profiter. Il s’avère donc envisageable de générer des plants plus résistants aux stress grâce à l’insertion du gène Lsi1.
Dans ce présent projet, nous nous intéressons à mesurer l’effet du Si chez le canola (Brassica napus L.) transformé avec le gène Lsi1. Étant donné que cette culture est largement répandue au Canada et qu’elle fait aujourd’hui face à plusieurs difficultés, incluant la présence de maladies, il paraît primordial de trouver de nouvelles méthodes pour lutter contre les stress qu’elle subit. Sachant qu’Arabidopsis fait partie de la même famille que le canola, une transformation avec le gène Lsi1 permettrait potentiellement d’améliorer sa capacité à lutter contre divers agents pathogènes. Nous posons donc la première hypothèse que le canola transformé avec Lsi1 accumule des quantités supérieures de Si dans ses parties aériennes comparativement au canola non transformé. En seconde partie, nous posons l’hypothèse que les plants de canola transformés avec Lsi1 sont plus tolérants au champignon hémibiotrophe Leptosphaeria maculans Desm. Cet organisme est l’agent pathogène engendrant les pertes économiques les plus importantes dans la culture de canola au Canada. L’objectif de cette
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présente étude est de démontrer que les effets du Si chez les plantes sont universels et qu’ils dépendent uniquement de la capacité des plantes à absorber l’élément. L’objectif sous-jacent vise à démontrer que les plants de canola génétiquement modifiés avec le gène Lsi1 bénéficient d’apports supérieurs en Si. Le taux de Si dans les parties aériennes a été mesuré chez les plants transformés et non transformés préalablement fertilisés au Si ou non afin de mesurer leur capacité relative à accumuler l’élément. Les plants de canola transformés ont ensuite été inoculés avec L. maculans en plus de la fertilisation en Si pour évaluer leur résistance au stress.
Matériels et méthodes
Production des plants de canola transgéniques
L’espèce modèle Brassica napus (canola), une plante faiblement accumulatrice de Si, a été transformée avec un des deux homologues de Lsi1 à l’étude afin de permettre l’absorption de Si. Certains plants de canola de la variété Westar ont subi une transgénèse de manière à introduire le gène VaNIP2-1 (VaLsi1), un transporteur de Si provenant de Vigna angularis, et d’autres le gène CaNIP2-1 (CaLsi1), un transporteur de Si provenant de Cicer arietinum. Le vecteur pCAMBIA-1302 a été utilisé pour la transformation. La présence du promoteur constitutif CaMV 35S dans la construction a permis de réguler l’expression du gène Lsi1. Le marqueur de sélection bactérien utilisé a été la kanamycine, tandis que le marqueur de sélection végétal a été l’hygromycine. Agrobacterium tumefaciens GV3101 comportant la construction 35S::VaNIP2-1 ou 35S ::CaNIP2-1 a été utilisé pour faire la transformation du canola. Les transformants (T0) ont été régénérés et sélectionnés par une germination sur un milieu contenant l’hygromycine comme agent de sélection. Les plants résistants à l’hygromycine ont été transférés dans des pots contenant du terreau et laissés pousser en serre sous conditions contrôlées. La présence du transgène VaLsi1 ou CaLsi1 a par la suite été vérifiée par amplification PCR en utilisant les amorces spécifiques à ces gènes (Tableau 4). Une fois la floraison et la maturation des siliques, les graines T1 de chaque plant ont été récoltées individuellement.
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Tableau 4 Amorces utilisées pour détecter le transgène VaNIP2-1 ou CaNIP2-1 chez le canola transgénique.
Nom de
l’amorce Direction Séquence Commentaire
VaNIP2- 1-F
F ATGGAAGGTACCAGCCCAAACAC Pour détecter le gène VaNIP2;1 dans le canola
transgénique
VaNIP2- 1-R
R TCAAACCAAGCTTCGTTGGTCGG Pour détecter le gène VaNIP2;1 dans le canola
transgénique
CaNIP2- 1-F
F ATGGACAGAAGAACACACAGTTT Pour détecter le gène CaNIP2;1 dans le canola
transgénique
CaNIP2- 1-R
R TCACACTGAACATTGATTGTCCT Pour détecter le gène CaNIP2;1 dans le canola
transgénique
Croissance des plants de canola
Les graines de canola Westar WT, VaLsi1 et CaLsi1 ont d’abord été stérilisées avec 1 % d’hypochlorite de sodium pendant 5 minutes puis rincées plusieurs fois à l’eau distillée. Les graines de canola ont ensuite été semées à une profondeur de 1,5-2,0 cm dans la vermiculite et arrosées à l’eau distillée. La photopériode pour la germination a été de 16h à une température de 16 °C la nuit et 22°C le jour. Une semaine après le semis, les plantules ont été transplantées dans des pots individuels de 8 pouces contenant du terreau Promix et fertilisées avec un engrais 20-20-20. Préalablement à la transplantation, le terreau a été saturé d’eau Si+/Si- selon les traitements. L’eau Si+ était composée d’eau de pluie, de silicate de
potassium (Kasil®, PQ Corporation)à 1,7 mM et d’hydroxyde de potassium pour corriger le
pH à 6,5. L’eau Si- était composée d’eau de pluie uniquement. Durant toute la croissance des plants, ils ont été arrosés à l’eau de pluie, fertilisés au 20-20-20 et en Si+/Si- deux fois par semaine avec un volume égal pour tous les plants. Ce volume variait d’une fertilisation à l’autre selon l’humidité du terreau (100 mL ou 200 mL). Les conditions de croissance dans la serre ont été maintenues identiques à celles de la période de germination, c’est-à-dire 16°C la nuit, 22°C le jour et une photopériode de 16h.
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Six semaines plus tard, une fois le stade de floraison atteint, une vielle feuille ainsi qu’une jeune feuille de chaque plant ont été récoltées et lyophilisées. Ces deux feuilles ont été récoltées sur un total de cinq plants différents par traitement. Une extraction d’ADN de chaque canola transgénique a également été réalisée, suivie d’une amplification PCR des gènes VaNIP2-1 et CaNIP2-1 avec des amorces spécifiques selon les échantillons afin de confirmer la présence du transgène.
Détermination de la concentration en Si dans les feuilles
Afin de déterminer la concentration en Si des tissus végétaux récoltés préalablement, les échantillons de feuilles préalablement lyophilisées ont été broyées séparément en une poudre fine avec un broyeur à billes. Des pastilles de 13 mm de diamètre x 5 mm d’épaisseur ont par la suite été faites grâce à une intense compression de la poudre. Puis, les pastilles ont été dosées en Si avec le X-ray fluorescence (XRF) (Niton XL3t GOLDD XRF Analyzer, Thermo Fisher Scientific) selon la procédure de Reidinger et al. (2012).
Préparation de l’inoculum de Leptosphaeria maculans, inoculation des plants et mesure de la sévérité de la maladie
Des nouvelles cultures de L. maculans ont été préparées sur milieu de culture V8-Agar
contenant 200 ml de V8, 15 g d’agar et 0,75 g de CaCO3. Elles ont ensuite été entreposées à
température ambiante pendant 14 jours pour obtenir des cultures sporulantes. Deux semis du témoin et de chaque transformant (WT, VaLsi1 et CaLsi1) ont été effectués à une semaine d’intervalle afin d’obtenir deux lots de plants d’âges distincts. Après la germination, la transplantation et la fertilisation ont été réalisées de la manière décrite précédemment, les plants âgés de 6 semaines et de 5 semaines ont été inoculés avec L. maculans. L’inoculation a été réalisée le même jour pour les deux lots afin d’uniformiser les conditions d’inoculation. Pour l’inoculation, une légère blessure au niveau du limbe a été faite au scalpel sur les deux plus vieilles feuilles matures de chaque plant (Huang et al., 2006). Une pastille de mycélium de L. maculans sur gélose V8 Agar a ensuite été placée sur chaque blessure tête vers le bas et maintenue collée grâce à un tissu collant de type Hypafix®. Deux jours avant l’inoculation, les conditions de la serre ont été ajustées à 90 % d’humidité relative, 12°C (nuit) et 24 °C (jour) afin de favoriser le développement du champignon. Ces conditions ont été maintenues
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jusqu’à 48h après l’inoculation. Une photopériode de 16 heures a été conservée durant l’ensemble de l’expérimentation. Les mesures de la sévérité ont été réalisées 14 jours après l’inoculation en mesurant le diamètre des lésions en afin d’estimer l’étendue des dommages. Analyses statistiques
Les résultats ont été présentés sous forme de moyennes ± erreur-type (SE). Les différences entre les moyennes ont été analysées en suivant le test de comparaisons multiples de Tukey basé sur l’analyse de la variance (ANOVA) et ont été considérées significatives à P < 0,05.
Résultats
Caractérisation des plantes transgéniques
La présence de l’insert VaLsi1 ou CaLsi1 a d’abord été analysée pour l’ensemble des plants de canola utilisés pour les différents tests. Les résultats d’amplification démontrent que la majorité des plants de canola T1 possèdent l’insertion. Les plants de canola démontrant une amplification PCR du gène VaLsi1 ou CaLsi1 (Figure 6 et 7) ont été sélectionnés pour les expérimentations. L’ensemble de plants de canola transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 sont respectivement issus d’un seul évènement de transformation.
Figure 6 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert VaLsi1 chez les différents plants de canola issus d’une transformation. Les plants de canola fertilisés (Si+) ou non
(Si-)en Si ont été analysés pour confirmer la présence de l’insert. La taille de l’insert VaLsi1
attendue étant de 867 pb, les amplifications illustrées ont permis de sélectionner précisément les plants possédant le gène d’absorption du Si pour l’expérimentation.
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Figure 7 Gels illustrant les amplifications par PCR de l’insert CaLsi1 chez les différents plants de canola issus d’une transformation. Les plants de canola fertilisés (Si+) ou non (Si-) en Si ont été analysés pour confirmer la présence de l’insert. La taille de l’insert CaLsi1 attendue étant de 822 pb, les amplifications illustrées ont permis de sélectionner précisément les plants possédant le gène d’absorption du Si pour l’expérimentation.
Accumulation de Si chez le canola transformé avec VaLsi1
L’accumulation en Si des feuilles de plants de canola transformés génétiquement avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) et fertilisés avec ou sans Si (Si-/Si+) a été mesurée. Une quantité significativement plus élevée de Si s’est accumulée dans les feuilles de plants transformés avec VaLsi1 sans fertilisation en Si (VaLsi1 Si-) comparativement aux feuilles de canola témoin sans transformation et sans fertilisation en Si (WT Si-) (Figure 8). Pour ce qui est des traitements avec fertilisation en Si (Si+), une accumulation en Si près de 40 % plus importante a été remarquée chez les plants transformés avec VaLsi1 comparativement aux plants de canola WT. Pour l’ensemble des plants WT ou transformés, une quantité supérieure en Si a été principalement observée dans les vieilles feuilles. Une diminution graduelle du niveau de Si a été mesurée entre les vieilles feuilles, les feuilles centrales et les jeunes feuilles. En plus d’accumuler plus de Si dans ses tissus comparativement au canola WT Si- et Si+, le canola transformé avec VaLsi1 et fertilisé en Si a accumulé significativement plus de Si que son équivalent sans fertilisation en Si. Par, ailleurs, les taux
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de Si dans les feuilles des plants WT Si+ sont comparables aux taux retrouvés dans les feuilles des plants VaLsi1 Si-.
Accumulation de Si chez le canola transformé avec CaLsi1
L’accumulation en Si des feuilles de plants de canola transformés génétiquement avec le gène Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) et fertilisés avec ou sans Si (Si-/Si+) a été mesurée. Une quantité significativement plus élevée de Si a été obtenue dans les feuilles de canola soumis à un traitement Si+ (WT et CaLsi1 Si) comparativement aux traitements Si- (WT et CaLsi1) (Figure 9). Cependant, aucune différence significative d’accumulation en Si n’a été remarquée entre les plants de canola WT Si+ et CaLsi1 Si+ au niveau des vieilles feuilles. Une quantité supérieure de Si a néanmoins été mesurée dans les jeunes feuilles de plants de canola CaLsi1 Si+ en comparaison aux jeunes feuilles de plants de canola WT Si+.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
WT Si- WT Si+ VaLsi1 Si- VaLsi1 Si+
Conte nu e n Si (mg /g MS ) Vieilles feuilles Feuilles centrales Jeunes feuilles
Figure 8 Contenu en silicium (Si) des feuilles de plants de canola Westar WT et de plants transformés avec le gène VaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). Les mesures du contenu en Si (mg/g MS) ont été réalisées chez les vieilles feuilles, les feuilles centrales et les jeunes feuilles. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type
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Figure 9 Contenu en Si dans les feuilles chez les plants de canola Westar WT et les plants transformés avec le gène CaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). Les mesures du contenu en Si (mg/g MS) ont été réalisées chez les vieilles feuilles et les jeunes feuilles. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de six réplicas
biologiques indépendants.
Sévérité de la maladie causée par Leptosphaeria maculans chez les plants
de canola transformés avec VaLsi1 ou CaLsi1 et fertilisés en Si.
Après la croissance, la fertilisation en Si et l’inoculation avec Leptosphaeria maculans, la sévérité de la maladie a été mesurée chez les plants de canola WT et les plants transformés avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 afin d’évaluer l’effet protecteur du Si chez les plantes. Quatorze jours après l’inoculation, la sévérité de la maladie a été évaluée en mesurant le
diamètre des lésions aux régions inoculées et en calculant par la suite leur aire (mm2). Pour
les plants inoculés après 6 semaines de croissance, la sévérité de la malade n’a pas été différente entre les traitements Si+ et Si- autant chez le canola WT, que chez les transformants VaLsi1 et CaLsi1 (Figure 10. A). Ce même constat a été fait chez les plants âgés de 5 semaines lors de l’inoculation (Figure 10. B). De plus, la taille des lésions chez les plants de canola WT et les plants des transformants VaLsi1 et CaLsi1 n’a présenté aucune différence significative selon le traitement Si, et ce, pour les plants âgés de 5 ou de 6 semaines. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
WT Si- WT Si+ CaLsi1 Si- CaLsi1 Si+
C ontenu e n S i (mg /g MS ) Vieilles feuilles Jeunes feuilles
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Un aperçu des plants et des lésions pour chaque traitement est présenté à la Figure 11. La santé des plants est demeurée similaire entre ceux venant de canola WT, VaLsi1 ou CaLsi1, qu’ils aient été fertilisés en Si ou non. Un flétrissement des vieilles feuilles ainsi qu’une décoloration foliaire ont été remarqués pour l’ensemble des traitements. Pour ce qui est des lésions causées par le champignon L. maculans, aucune différence visuelle n’a été identifiée. Dans tous les cas, le centre des lésions a présenté les symptômes typiques d’une infection par ce champignon, soit des tissus nécrosés de couleur grise envahis de pycnides ainsi qu’un halo jaune illustrant une chlorose des tissus environnants. Aucun symptôme de la maladie n’a été remarqué dans les tissus n’ayant pas subi d’inoculation.
0 50 100 150 200 250 300 350 WT VaLsi1 CaLsi1 Aire de la lé sion (mm 2)
A
Si- Si+ 0 50 100 150 200 250 300 350 WT VaLsi1 CaLsi1 Aire de la lé sion (mm 2)B
Si- Si+Figure 10 Aire des lésions causées par Leptosphaeria maculans sur les feuilles de plants de canola Westar WT, de plants transformés avec le gène VaLsi1 ou CaLsi1 fertilisés (Si+) ou non (Si-) avec une solution de Si (1,7 mM). L’aire (mm2) des lésions a été mesurée sur les feuilles centrales. Les plants étaient âgés de 6 semaines (A) ou 5 semaines (B) lors de l’inoculation. Les valeurs représentent les moyennes ± erreur-type (SE) de quatre réplicas
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Si -
A
B
C
D
E
F
Si +
Figure 11 Lésions causées par Leptosphaeria maculans chez des plants de canola non transgéniques (WT), transformés avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou avec le gène Lsi1 de Cicer arietinum (CaLsi1) traités ou non avec le silicium (Si). Lésions sur plants WT Si- (A), WT Si+ (B), VaLsi1 Si- (C), VaLsi1 Si+ (D), CaLsi1 Si- (E) et sur CaLsi1 Si+ (F). L’inoculation a été effectuée sur les vieilles feuilles et la taille des lésions a été mesurée au point d’inoculation. Les plants représentés étaient âgés de 5 semaines lors de l’inoculation.
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Le contenu en Si des plants de canola WT, VaLsi1 et CaLsi1 inoculés avec L. maculans a été mesuré chez les feuilles centrales. Les taux de Si des plants sans fertilisation au Si ont été similaires entre les WT, les VaLsi1 et les CaLsi1. À l’inverse, une différence significative a été remarquée en comparant les niveaux de Si des traitements Si- avec leur équivalent Si+. De plus, une quantité supérieure de Si a été mesurée chez les plants des transformants VaLsi1 Si+ et CaLsi1 Si+ comparativement aux plants de canola WT Si+. Par ailleurs, l’accumulation en Si entre les plants des transformants VaLsi1 et CaLsi1, ont été comparables.
Discussion
Après la transformation du cultivar de canola Westar avec le gène Lsi1 de Vigna angularis (VaLsi1) ou de Cicer aretinum (CaLsi1), l’accumulation de Si dans les parties aériennes a été mesurée chez les plants fertilisés ou non en Si (Si+/Si-). Les résultats obtenus ont révélé que les plants de canola transformés avec le gène VaLsi1 et fertilisé au Si accumulaient près de 40 % plus de cet élément dans les vieilles feuilles que les plants WT Si+. L’insertion du