ÉTUDE EN MILIEU MODÈLE

II.1.2.1. FONCTIONNEMENT DU DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL

Le dispositif utilisé dans ce travail est présenté dans la Figure 1 §2.2. « Experimental device

description » du matériel et méthodes de l’article 2 (Section III.2) et de manière plus détaillée

dans la Figure 13 ci-dessous. Il est composé d’un corps en verre (volume ≈ 100 ml), rempli avec un milieu de culture liquide, et d’une ouverture comportant une membrane en polyethersulfone (PES) de 47 mm de diamètre et d’une porosité de 0,45 µm (Merck Millipore, Billerica, MA, États-Unis).

Figure 13. Dispositif expérimental, représentation schématique du dispositif vide (a), dispositif rempli avec un milieu de culture liquide avant l’inoculation (b), à l’inoculation (c), juste après l’inoculation (d) et niveau critique du milieu de culture (e).

Le dispositif est rempli en ajoutant du milieu de culture jusqu’à ras-bord de l’ouverture supérieure, puis le bouchon SVL® 42 avec la membrane déjà en place est vissé. Le remplissage se termine par le capillaire en penchant le dispositif pour chasser les bulles d’air qui s’infiltrent sous la membrane et le niveau de milieu est ajusté en dessous du niveau de la membrane (Figure 13b). Lorsque la suspension d’inoculation contenant L. sakei est placée sur la face supérieure de la membrane (Figure 13c), le liquide de la solution s’infiltre à travers la membrane d’une part par capillarité et d’autre part grâce à la différence de niveau entre le corps du dispositif et le capillaire, et les bactéries restent en surface. Par la suite, lorsque le dispositif est en fonctionnement (Figure 13d), la surface supérieure de la membrane supporte la croissance de

L. sakei pendant que la surface inférieure est en contact permanent avec le milieu de culture

agité. Ceci permet aux bactéries d’accéder aux nutriments de manière continue et non-limitante et de la même manière d’évacuer les produits du métabolisme fermentaire tels que l’acide lactique. Lorsque, du fait de l’évaporation du milieu de culture à travers la membrane, le niveau dans le capillaire passe en deçà d’un niveau critique (Figure 13e), des bulles d’air se forment sous la membrane et les bactéries ne sont plus en contact permanent avec le milieu de culture. Toutefois, la présence du couvercle en verre au dessus de la membrane limite cette évaporation et le niveau critique n’est jamais atteint au cours des essais.

II.1.2.2. MILIEU DE CULTURE LIQUIDE CONTENU DANS LE DISPOSITIF

Le milieu dénommé MYG pour « Meat, Yeast, Glucose » se compose de 10 g/l d’extrait de viande (BBL™ Beef Extract Powder, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, États-Unis), 5 g/l d’extrait de levure (Bacto™ Yeast Extract, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, États-Unis) et 5 g/l de glucose (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). Après stérilisation par autoclave (15 min à 121 °C) le pH du milieu est ajusté en conditions stériles avec de l’acide chlorhydrique (HCl 1N) à un pH de 5,60.

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II.1.2.3. FORMULATION DU MILIEU DE CULTURE CONTENU DANS LE DISPOSITIF Le milieu MYG est formulé en activité en eau, en utilisant du glycérol pur (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis) et en NaCl (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). La variation de l’activité en eau du milieu en fonction de l’ajout de ces deux composants est présentée dans la Figure 14.

Figure 14. Activité en eau du milieu MYG en fonction de la concentration en NaCl ([NaCl] ()) et en glycérol ([gly] ()).

D’autre part, afin de déterminer la concentration en acide lactique non-dissocié en fonction du pH, un MYG contenant 2 % (p/v) d’acide lactique (pureté 80 % (p/v), Grosseron, Saint-Herblain, France) a été neutralisé progressivement avec de la soude (NaOH 5N) jusqu’à atteindre un pH de 5,60. La concentration en LaH a été calculée selon le système d’équations (26) pour chaque valeur de pH pour obtenir la courbe de la Figure 15.

(26)

a_{w, NaCl} = -1,8 10-4[NaCl]² - 4,8 10-3[NaCl] + 1 R² = 0,999

a_{w, gly} = -4,7 10-5[gly]² - 1,4 10-3[gly] + 1 R² = 0,998 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 0 10 20 30 40 50

a

[osmo-depresseur] (% (p/v))

Figure 15. Concentration en acide lactique non-dissocié ([LaH]) en fonction du pH du milieu MYG contenant 2 % (p/v) d’acide lactique neutralisé jusqu’à pH 5,60 par ajout progressif de soude (NaOH 5N).

Les effets du pH et de LaH sur la croissance deviennent importants à des valeurs proches des valeurs en fin de fermentation d’un produit type saucisson sec c'est-à-dire un pH voisin de 4,7 et une teneur en acide lactique total proche de 2 % (p/p). D’autre part, il est d’autant plus pertinent d’étudier l’effet de LaH à pH 4,70 plutôt qu’à 5,60, valeur trop éloignée du pKa de l’acide lactique à laquelle la forme non-dissociée n’est quasiment pas présente (Figure 15). À l’aide de l’équation du polynôme de régression en Figure 15 (LaH = 0,16pH²  2,02pH + 6,38), on déduit qu’à pH 4,70, 2 % (p/v) d’acide lactique total correspondent à 0,4 % (p/v) de LaH soit un pourcentage d’environ 18 %. Par la suite, pour formuler le MYG en LaH à pH 4,70, cette valeur sera utilisée pour déterminer la quantité d’acide lactique total qu’il faut ajouter pour avoir une concentration en LaH donnée.

II.1.2.4. SOUCHE DE LACTOBACILLUS SAKEI

La souche de L. sakei DGCC5038 utilisée dans les essais en dispositif a été fournie par Danisco (Danisco, Copenhague, Danemark) sous forme lyophilisée.

LaH = 0,16pH² - 2,02pH + 6,38 R² = 0,984 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2 3 4 5 6

[L

a

H]

(%

(p

/v

))

pH

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II.1.2.5. PRÉPARATION DE LA SUSPENSION D’INOCULATION

Une pré-culture de L. sakei est préparée en plaçant 0,1 g/l de la souche lyophilisée dans 250 ml de MYG et incubés à 25 °C pendant 3 h (début de phase exponentielle de croissance). La pré-culture est ensuite diluée d’un facteur d’environ 100 selon une mesure d’absorbance à 600 nm pour obtenir une suspension d’inoculation à 5,0 log10 UFC/ml.

II.1.2.6. INOCULATION ET INCUBATION DES DISPOSITIFS

Les dispositifs préalablement stérilisés par autoclave (15 min à 121 °C) puis remplis avec le milieu de culture MYG en conditions stériles, sont inoculés en plaçant 1 ml de la suspension d’inoculation sur la membrane. La charge atteinte sur la membrane est ainsi autour de 4 log10 UFC/cm². Les dispositifs sont placés sur un agitateur magnétique multipostes (VELP Scientifica, Usmate, Italie) dans une enceinte climatique (modèle CL, BIA, Conflans-Sainte-Honorine, France) à 25 °C pour incubation.

II.1.2.7. ÉCHANTILLONNAGE

Pour chaque temps d’échantillonnage, un dispositif est sorti de l’enceinte climatique. La membrane et le milieu de culture MYG sont prélevés en conditions stériles. Le milieu de culture peut-être analysé directement (mesure du pH) ou stocké à 20 °C pour être analysé ultérieurement (dosage du D-glucose, et des acides D- et L-lactique). La membrane est placée dans un tube à centrifuger de 50 ml avec des billes en verre stériles et 10 ml d’eau peptonée tamponnée à 2 % (p/v). Après passage au vortex pendant une minute pour décrocher les cellules de la membrane, on obtient la suspension-mère qui sera utilisée pour les dénombrements.