II) Recherche de biomarqueurs par analyse protéomique
1.3 Outils
1.3.1 Électrophorèse bidimensionnelle
L’électrophorèse 2D permet de séparer les protéines d’un échantillon à la fois en
fonction de leur point isoélectrique (pI) lors de l’étape d’isoélectrofocalisation (IEF) et de leur
poids moléculaire (Mr) lors de la seconde dimension (SDS-PAGE). Cette technique présente
également l’avantage de mettre en évidence plusieurs isoformes de la même protéine
[Lescuyer et al. 2004]. De plus, il s’agit d’une technique reproductible permettant de
quantifier le niveau d’expression des protéines.
1.3.1.1 Isoélectrofocalisation
Pour cette étape, l’échantillon protéique est déposé sur un gel de polyacrylamide
contenant un gradient de pH stable établi par des immobilines qui copolymérisent avec
l’acrylamide dans le gel d’IEF. Le gel de polyacrylamide utilisé présente une forte porosité
pour que la taille des protéines n’influence pas leur migration. Le gradient d’immobilines
présente de nombreux avantages tels qu’une bonne stabilité au cours du temps, une meilleure
reproductibilité, une grande capacité de chargement en protéines et enfin la possibilité
d’obtenir des gradients de pH très étroits sur une ou deux unités [Dutt et al. 2000].
Les protéines sont des molécules amphotères, c’est-à-dire qu’elles peuvent être chargées
positivement, négativement ou avoir une charge neutre selon le pH de la solution dans
laquelle elles se trouvent. Sous l’effet d’un champ électrique, les protéines vont migrer dans le
gel jusqu’à leur pI qui correspond au pH pour lequel leur charge nette est nulle. Pour cette
étape, les paramètres de migration sont optimisés en fonction de l’échantillon à analyser.
L’étape d’IEF est représentée schématiquement en Figure 37.
Figure 37 : Représentation schématique de l’étape d’IEF.
1.3.1.2 Seconde dimension ou SDS-PAGE
Le gel d’IEF est ensuite déposé au sommet d’un gel de polyacrylamide avec une
réticulation plus ou moins importante permettant la séparation des protéines de l’échantillon
en fonction de leur Mr sous l’effet d’un champ électrique. Cette technique permet de séparer
de façon résolutive jusqu’à 3000 protéines [Faber et al. 2006]. La migration en gel
SDS-PAGE est représentée schématiquement en Figure 38.
Figure 38 : Représentation schématique de la SDS-PAGE.
3 4 5 6 7 8 9 10 gradient de pH
SDS-PAGE
Mr (kDa)
100 75 50 42 37 20 15 10 3 4 5 6 7 8 9 10 gradient de pHSDS-PAGE
Mr (kDa)
100 75 50 42 37 20 15 10 100 75 50 42 37 20 15 10 + -3 4 5 6 7 8 9 10 gradient de pH + -3 4 5 6 7 8 9 10 gradient de pH IEF + -3 4 5 6 7 8 9 10 gradient de pH + -3 4 5 6 7 8 9 10 gradient de pH IEF1.3.1.3 Détection des spots polypeptidiques
Différentes techniques de révélation non spécifiques des protéines sur gel de
polyacrylamide peuvent être utilisées (Tableau X).
Table X : Les différentes techniques de coloration d’un gel de polyacrylamide.
Le choix de la coloration se fait essentiellement en fonction de l’utilisation ultérieure
des gels d’électrophorèse 2D. Les propriétés les plus importantes du colorant sont sa
sensibilité (seuil limite de détection), une échelle dynamique linéaire pour une quantification
précise, sa reproductibilité et sa compatibilité avec les étapes d’identification par
spectrométrie de masse (MS).
En général, elles font appel à l’emploi de colorants tels que des sels d’argent (technique
très sensible), une solution de bleu colloïdal (de plus faible sensibilité), des sondes
fluorescentes telles que le Sypro®Ruby (Sypro®Ruby Protein Gel Stain Molecular Probes™)
ou le marquage par des cyanines utilisé pour la technique de 2D DIGE (très sensible mais plus
coûteuse) [Rabilloud 2000].
Certains marquages permettent également de visualiser des catégories spécifiques de
protéines telles que la coloration au Pro-Q®Diamond (Pro-Q®Diamond Phosphoprotein Gel
Stain, Molecular Probes™) qui permet de détecter les protéines phosphorylées ou la
coloration au Pro-Q®Emerald qui permet de détecter les glycoprotéines. De manière
intéressante, la technologie du Pro-Q®Diamond nous offre la possibilité de détecter et de
quantifier les protéines contenant des phospho-sérines, -thréonines ou -tyrosines puisque ce
colorant fluorescent ne révèle que les phosphoprotéines, sans détecter les autres
macromolécules telles que l’ADN, l’ARN ou encore les glycanes sulfatés [Steinberg et al.
2003]. De plus, cette technique est rapide, simple à mettre en œuvre, reproductible, réversible
et compatible avec d’autres technologies telles que la spectrométrie de masse. Cependant, la
sensibilité de cette technique reste faible et nécessite une quantité importante d’échantillons.
Technique de coloration Détection Avantages Inconvénients
Pro-Q®Diamond Compatible avec la spectrométrie de masse Relativement coûteuse Faible sensibilité
Pro-Q®Emerald Compatible avec la spectrométrie de masse Relativement coûteuse
Sypro®Ruby Compatible avec la spectrométrie de masse Relativement coûteuse Compatible avec la spectrométrie de masse
Analyse bioinformatique facilitée
Relativement coûteuse Linéaire sur un log Compatible avec la spectrométrie de masse
Economique Nitrate d'argent 2D-DIGE fluorescence visible Bleu colloïdal Relativement coûteuse
Moins sensible que le nitrate d'argent Plus sensible que le bleu colloïdal