Élaboration d’un protocole de cryoconservation et d’une cryobanque de sperme de salmonidés

6.1. Amélioration des performances post-congélation 6.1.1. Optimisation de la vitesse de décongélation :

Les résultats antérieurs sur la motilité des spermatozoïdes post-congélation ont montré des variations importantes selon la vitesse de décongélation. Jusqu’alors, pour nos essais de cryoconservation, nous avons réalisé la décongélation dans un bain-marie entre 38-39°C pendant 4-5s ou 9-10s en s’appuyant sur les données techniques de la littérature qui conseillent une température comprise entre 30-40°C pendant 4-40s selon l’espèce.

En vue de déterminer une température et un temps optimum de décongélation pour la population de saumon atlantique du bassin de la Meuse, nous avons comparé deux niveaux de température (35 vs 40°C) et trois temps différents (5s vs 10s vs 15s) de décongélation.

Quatre jeunes saumons ont été utilisés pour chaque niveau de température et chaque temps. Aussitôt après prélèvement de la semence, la cryoconservation a été réalisée par la méthode cryobox à Erezée le 09 janvier 2013. Les résultats de cet essai sont présentés dans les tableaux 18 & 19 et dans la Figure 44.

Tableau 18 : Effet de la vitesse de décongélation sur la motilité post-congélation : température 35°C, durée : 5s (5’’) vs 10s (10’’) vs 15s (15’’) N° Durée : 35°C Motilité (%) 5’’ P1 P2 Moy SD 1 00-0698-6847 15 10 13 4 2 00-0698-54EE 10 15 13 4 3 00-0698-886F 10 10 10 0 4 00-06C9-C5B6 15 15 15 0 5'' 13 2 1 00-0698-6847 25 30 28 4 2 00-0698-54EE 22 30 26 6 3 00-0698-886F 28 23 26 4 4 00-06C9-C5B6 20 25 23 4 10'' 25 2 1 00-0698-6847 33 45 39 8 2 00-0698-54EE 27 30 29 2 3 00-0698-886F 37 33 35 3 4 00-06C9-C5B6 32 40 36 6 15'' 35 4

Subvention 2012-2013 Programme Saumon Meuse. Rapport final année 2012. Avril 2013

Tableau 19 : Effet de la vitesse de décongélation sur la motilité post-congélation : température 40°C, durée : 5s (5’’) vs 10s (10’’) vs 15s (15’’) N° Durée : 40°C Motilité (%) P1 P2 Moy SD 1 00-0698-6847 25 30 28 4 2 00-0698-54EE 10 30 20 14 3 00-0698-886F 28 25 27 2 4 00-06C9-C5B6 20 25 23 4 5'' 24 3 1 00-0698-6847 20 25 23 4 2 00-0698-54EE 25 25 25 0 3 00-0698-886F 20 20 22 0 4 00-06C9-C5B6 15 20 22 4 10'' 23 1 1 00-0698-6847 15 20 18 4 2 00-0698-54EE 20 10 15 7 3 00-0698-886F 30 15 23 11 4 00-06C9-C5B6 15 15 21 0 15'' 19 3 0 10 20 30 40 50 D5 D10 D15 M o ti li té s p z (% )

Durée de congélation (sec)

T35 T40 a b a a a b

Figure 44 : Effet de la température et la durée de la décongélation sur la motilité des spz après le cycle de cryoconservation : T35/T40 : 35 vs 40°C, D5, D10, D15 : 5s (5’’) vs 10s (10’’) vs 15s (15’’)

Globalement, les résultats présentés dans les tableaux 18 & 19 et dans la Figure 44 montrent que la durée de décongélation doit être la plus courte possible lorsque le réchauffement est réalisé à 40°C car nous avons obtenu une motilité réduite après réchauffement des paillettes au-delà de 5s même si quelques individus semblent montrer une quelconque résistance à cette vitesse de décongélation. Par contre, la motilité augmente entre 10 et 15s de réchauffement sans montrer de différences importantes entre individus lorsque la température de décongélation est stabilisée à 35°C. Il est donc plus aisé de réaliser la décongélation du sperme de nos populations de géniteurs à une température de 35°C pendant 15s dans le bain- marie.

Subvention 2012-2013 Programme Saumon Meuse. Rapport final année 2012. Avril 2013

paillettes CBM (pour poisson) vs paillettes ordinaires (bovins, ovins, etc)

La qualité des paillettes de conditionnement a une influence déterminante sur les performances post-congélation et, pour les poissons, des paillettes (CBM) d’épaisseur plus importante sont recommandées. Leur prix est plus élevé comparativement aux paillettes ordinaires utilisées pour les bovins ou autres animaux terrestres.

Nous avons réalisé une comparaison de deux types de paillettes en vue d’une éventuelle réduction des frais de consommables. Trois jeunes saumons ont été utilisés lors des séances de cryoconservation du 09 et 15 janvier 2013, soit six individus pour les deux dates. Aussitôt après prélèvement de la semence, la cryoconservation a été réalisée par la méthode cryobox à Erezée.

Les résultats de cet essai présentés dans le Tableau 20 et dans la Figure 45 montrent que la motilité post-congélation est significativement plus faible pour le conditionnement dans des paillettes ordinaires comparativement aux paillettes CBM quelle que soit la date de prélèvement indiquant une meilleure qualité cryoprotectrice de ces dernières.

Tableau 20 : Variations de la motilité des spz post-congélation en fonction de la qualité des paillettes (paillettes « ordinaires » = bovins, ovins etc, Paillettes CBM = poisson)

N° Pit-Tag Dates Paillettes "ordinaires" Paillettes CBM Moy P1-P2 Moy P1-P2 1 00-06C9-FE37 9-janv 16 1 23 1 2 00-0696-CEFB 9-janv 31 8 40 5 3 00-06C9-FF2E 9-janv 29 4 42 2 4 00-0698-69B5 15-janv 30 0 40 2 5 00-06C9-DAFB 15-janv 31 1 40 1 6 00-06CA-0C2B 15-janv 27 4 34 1 Moyenne 27 36 6 7 0 15 30 45 60 09-01-2013 15-01-2013 M o ti li té s p z ( % )

Paillettes ordinaires Paillettes CBM

Subvention 2012-2013 Programme Saumon Meuse. Rapport final année 2012. Avril 2013 station d’Erezée :

Au cours de la saison de reproduction 2012, un lot de jeunes saumons Loire-Allier (issus d’un croisement femelle F1 et mâle sauvage) ont été jugés stratégiques pour des programmes futurs de reproduction au centre d’Erezée et une vingtaine d’individus spermiants ont été sélectionnés pour la cryoconservation. Ces derniers individus ont été marqués (PIT-tags) et ces numéros ont été imprimés sur les paillettes grâce à la collaboration avec l’AWE de Ciney afin de permettre un meilleur suivi des paillettes lors du stockage et manipulations à long terme dans l’azote liquide.

Deux séances de cryoconservation ont été réalisées en dates du 09 et 15 janvier 2013 en vue de conserver un maximum de laitance de chacun de ces individus. Aussitôt après prélèvement de la semence, la cryoconservation a été réalisée par la méthode cryobox sur place à Erezée. La qualité de la semence a été évaluée après le cycle de cryocongélation-décongélation sur base de la motilité des spz dont les résultats sont présentés dans les tableaux 21 et 22.

Un total de 658 paillettes a été stocké. Globalement, la motilité post-congélation est bonne pour 18 des 20 individus sélectionnés avec des valeurs comprises entre 27 et 44% et une moyenne de 35+5%. Pour 15 des 18 individus de bonnes performances, la motilité post- congélation est jugée suffisante pour être utilisée en reproduction car les valeurs sont supérieures à 30%, soit comprises entre 33-44%. Pour les deux individus dont les valeurs sont trop faibles (13 et 23%), les paillettes analysées étaient mal bouchées ou avaient perdu leurs bouchons de poudre de silicone. Ce problème technique est inévitable lors d’un remplissage manuel comme déjà signalé dans les précédents rapports, néanmoins avec l’expérience, il peut être minimisé car le pourcentage n’est que de 3.8% (2/52 paillettes analysées, cf Tableau 14b*).

Pour les 18 individus de bonnes performances (29-44% de spz motiles), le total de paillettes utilisables est de 584 ; si on considère une dose pratique moyenne de 100-150g d’œufs/paillette, on a un stock pouvant fertiliser 58-87 kg d’œufs.

Quelle que soit la motilité post-congélation, toutes les paillettes sont stockées car une évaluation avec des techniques plus performantes (CASA, cytométrie des flux) sera réalisée au cours de l’année 2013 en collaboration avec l’AWE.

Tableau 21 : Motilité des spz post-congélation de jeunes saumons Loire Allier (femelle F1 x male sauvage) (09 janvier 2013)

Cuve N°4 N° Pit-Tag Vol (ml) N° paillettes

MoyP1 MoyP2 MoyP1-P2

Canister 2 (vert) 1 00-0698-6847 4 27 16 16 39 8

Canister 2 (vert) 2 00-0698-54EE 5 37 21 21 28 2

Canister 2 (vert) 3 00-0698-886F 4 28 16 16 35 3

Canister 2 (vert) 4 00-06C9-C5B6 5 37 21 21 36 6

Canister 3 (Jaune) 5 00-06CA-1A04 4,5 30 17 17 38 0

Canister 3 (Jaune) 6 00-06CA-13BB 5 38 22 22 37 5

Canister 3 (Jaune) 7 00-0698-6F9C 4 26 15 15 44 1

Canister 3 (Jaune) 8 00-0698-83B3 5 35 20 20 35 0

Canister 4 (Rouge) 9 00-06CA-0C04 5,5 40 23 23 33 4

Canister 4 (Rouge) 10 00-06C9-FE37 5,5 41 23 23 23 1

Canister 4 (Rouge) 11 00-0696-CEFB 5,5 41 23 23 40 5

Canister 4 (Rouge) 12 00-06C9-FF2E 5 36 21 20,5 42 2

ΣΣΣΣ 416 36 6

Subvention 2012-2013 Programme Saumon Meuse. Rapport final année 2012. Avril 2013

Tableau 22 : Motilité des spz post-congélation de jeunes saumons Loire Allier (femelle F1 x male sauvage) (15 janvier 2013)

Cuve N° 4 N° Pit-Tag Vol (ml) N° paillettes

MoyP1 MoyP2 MoyP1-P2

Canister 5 (blanc) 1 00-0698-69B5 6,5 48 27 43 40 2

Canister 5 (blanc) 2 00-0698-7F8B 5 33 19 15 13 2P1*P2* Canister 5 (blanc) 3 00-06B8-9106 5 29 17 32 33 1

Canister 5 (blanc) 4 00-0698-655D 5 27 16 27 29 2

Canister 6 (bleu) 5 00-06C9-E2D5 4 30 17 38 38 0

Canister 6 (bleu) 6 00-0698-7233 3,5 28 16 27 27 3P1* Canister 6 (bleu) 7 00-06C9-DAFB 3,5 26 15 42 40 1

Canister 6 (bleu) 8 00-06CA-0C2B 3 21 12 35 34 1

ΣΣΣΣ 242 35 5

ΣΣΣΣ 209Motilité 27-40%

6.3. Elargissement de la collaboration avec les équipes des pays voisins afin d’augmenter la capacité de stockage du matériel génétique pour le

saumon Atlantique :

6.3.1. Collaboration avec le centre de Roermond

Une réunion de travail consistant à élaborer les bases d'un projet de collaboration internationale entre la pisciculture d’Erezée et les centres allemand et hollandais de repeuplement sur la Roer/Rur a eu lieu en avril 2012. Au cours de cette réunion, un accord de collaboration permettant un échange de géniteurs et de matériel génétique a été acquis entre les trois équipes de repeuplement de saumon Atlantique dans le réseau de la Meuse, avec comme centre de stockage la pisciculture à Erezée. Cet accord inclut aussi la mise en place d’une cryobanque commune aux géniteurs capturés par ces trois centres dès lors stockés à la pisciculture d’Erezée.

6.3.2. Appui sollicité auprès de l’AWE de Ciney :

En rapport avec la possibilité d’augmentation du nombre de géniteurs d’élite destinés à la cryoconservation et dans le souci de sécuriser la conservation à long terme des paillettes, une demande de collaboration a été adressée à l’AWE de Ciney. Cet appui concerne trois tâches spécifiques et des propositions d’accord ont été discutées au cours d’une réunion tenue le 3 octobre 2012 entre l’URBE-Namur et le directeur du centre de Ciney :

(1) Entretien des cuves de stockage de paillettes : suivi du niveau d’azote de trois ou quatre cuves de stockage:

- Les membres de l’AWE sont favorables et ont pris contact avec l’AFSCA concernant la réglementation en vigueur. Il a été confirmé qu’il n’y aurait pas de contrainte réglementaire à un éventuel stockage de la semence « poisson » par l’AWE ; mais un tel entreposage ne peut pas se faire dans les mêmes locaux de stockage que ceux de la semence bovine. L’AWE pense qu’il y a moyen de trouver un local propre pour répondre à l’appui que nous sollicitons mais les coûts de l’opération seront plus élevés en rapport avec l’entretien supplémentaire de ce local.

- Les coûts du service de stockage et entretien seront définis en fonction des services requis par demande:

Subvention 2012-2013 Programme Saumon Meuse. Rapport final année 2012. Avril 2013

• Prestation partielle (stockage, remplissage automatique des cuves)

- Un achat de deux grandes cuves cryogéniques est recommandé, les petites cuves URBE dont nous disposons ne sont pas adaptées pour le remplissage automatique. Une vielle cuve de grande capacité de stockage de paillettes a été mise en prêt par la pisciculture de LLN ; mais après testage, celle-ci s’est avérée inutilisable (problème sévère d’étanchéité).

(2) Impression des paillettes afin d’une meilleure gestion individuelle de la traçabilité de chaque géniteur:

- Un accord d’appui pour cette tâche spécifique est acquis

- Une première impression de 2000 paillettes a été réalisée par l’équipe de l’AWE entre le 3-6 décembre 2012.

(3) Training pour une évaluation de la motilité post-congélation par cytométrie de flux et une initiation à l'encodage des fichiers de suivi des stocks de paillettes.

Un accord d’appui pour cette tâche spécifique est acquis ; mais une vérification des aspects analytiques avec les chercheurs AWE s’avère nécessaire avant la réalisation d’une action plus précise. Le but de cette tâche est de réaliser une évaluation des caractéristiques de la motilité individuelle des spermatozoïdes post-congélation par une technique de pointe et ainsi d’établir une validation plus objective de la méthode d’évaluation actuellement utilisée.