Éléments de biosynthèse

La synthèse de la colibactin est assurée par une machinerie enzymatique composée de mégasynthases, dont trois PKS (ClbC, ClbI et ClbO), trois NRPS (ClbH, ClbJ et ClbN) et deux hybrides PKS-NRPS (ClbB et ClbK), ainsi que d’enzymes accessoires (ClbA, ClbD-G, ClbL, ClbP-Q).

À ce jour, la structure complète de la colibactine est inconnue, mais plusieurs études publiées ces trois dernières années ont identifié de nombreux intermédiaires de synthèse [82–91].

Chapitre II : Métabolites secondaires de type PK-NRP synthétisés par Escherichia coli

Activation de la machinerie

ClbA est une PPTase, enzyme essentielle pour l’activation des mégasynthases, qui catalyse la fixation d’un bras pantéthéinyl terminé par un groupe thiol sur les domaines de thiolation [2,39]. ClbA participe également à la biosynthèse des autres composés PK/NRP synthétisés par E. coli, l’entérobactine, les salmochélines et la yersiniabactine [92]. Il faut donc garder à l’esprit qu’une souche mutée pour clbA ne sera certes plus capable de produire la colibactine, mais pourra également être altérée dans sa capacité à produire les sidérophores.

Étapes de biosynthèse

Une fois activées, les mégasynthases recrutent leurs monomères spécifiques. La première enzyme intervenant dans la synthèse est la NRPS ClbN. Cette mégasynthase, dont le substrat est l’asparagine (Asn), génère du N-myristoyl-D-asparagine, ou produit de clivage (cf. § Clivage page suivante) [82,83]. L’assemblage se poursuit ensuite avec l’intervention successive des enzymes ClbB-C-H-I-J-K qui utilisent divers substrats, conventionnels (malonyl-CoA, alanine, sérine, glycine, cystéine) ou non (acide aminocyclopropane-carboxylique) (Figure 14) [84–91].

Figure 14. Biosynthèse de la pré-colibactine

Étapes de biosynthèse détaillées dans le texte. D’après [91].

Par ailleurs, il a été récemment démontré que les enzymes accessoires ClbD-E-F, en collaboration avec l’un des domaines A de ClbH, génèrent à partir de L-sérine un monomère inhabituel utilisable par les PKS de l’îlot, l’aminomalonyl-ACP [93]. Ce monomère est ensuite transféré aux différents modules PKS par ClbG, enzyme monofonctionnelle à activité acyltransférase [89]. La dernière étude publiée sur la biosynthèse de la colibactine par Li et al.

a pour la première fois identifié une pré-colibactine comportant un résidu aminomalonyl [91].

L’intégration de ce monomère atypique modifie drastiquement la conformation de la molécule.

La pré-colibactine caractérisée dans cette étude diffère d’ailleurs des autres intermédiaires de synthèse proposés jusqu’ici. Les auteurs proposent ainsi deux voies alternatives de synthèse, intégrant (voie A) ou non (voie B) une unité aminomalonyl par ClbK (Figure 14) [91].

Enfin, trois enzymes ont encore une fonction inconnue dans la biosynthèse de colibactine : ClbL serait une amidase d’après une analyse in silico, mais son rôle est énigmatique [2] ; ClbO est une PKS qui pourrait, comme ClbK, intégrer un résidu aminomalonyl.

Li et al. évoquent dans leur dernière étude qu’ils auraient détecté un intermédiaire issu de l’action de ClbO, en cours de caractérisation structurale (Figure 14) [91] ; ClbQ est une thioestérase de type II, dont le rôle habituel est de débloquer les chaines d’assemblage en hydrolysant les intermédiaires de synthèse aberrants. ClbQ pourrait cependant avoir un fonctionnement atypique et libèrerait les intermédiaires précoces conformes de la machinerie de biosynthèse [91].

Export

Le métabolite final produit par la chaine d’assemblage, dont la structure complète reste inconnue, est une pré-colibactine inactive. Cette pré-colibactine est ensuite exportée dans le périplasme de la bactérien grâce à ClbM (Figure 15) [70]. Cette pompe à efflux est insérée dans la membrane interne par douze domaines transmembranaires, dont l’inactivation par mutation du gène clbM conduit à une réduction de l’activité génotoxique. L’hypothèse actuelle pour ce phénotype atténué suppose que d’autres pompes à efflux complémentent partiellement l’absence de ClbM [2,70].

Clivage

Une fois dans le périplasme, la pré-colibactine subit l’action de ClbP. Cette protéine périplasmique ancrée à la membrane interne hydrolyse, par son activité D-amino-peptidase, le motif pro-drogue de la pré-colibactine, libérant la forme active de la colibactine ainsi que le produit de clivage, ou N-myristoyl-D-asparagine (Figure 15) [71,82,94].

Chapitre II : Métabolites secondaires de type PK-NRP synthétisés par Escherichia coli

L’ensemble des intermédiaires de synthèse proposés jusqu’ici ont été identifiés dans des souches mutées pour clbP. Leur relevance biologique est donc inconnue. De plus, la perte du produit de clivage grâce à l’intervention de ClbP modifie très probablement la structure chimique et la réactivité de la colibactine active.

Systèmes de protection

La stratégie pro-drogue, précédemment décrite pour deux antibiotiques PK/NRP, la zwittermicine [95] et la xénocoumacine [96], serait un mécanisme de protection de la bactérie productrice de l’activité de ces composés toxiques.

L’îlot pks code un système de protection additionnel, la protéine ClbS, qui protègerait la bactérie productrice de l’activité génotoxique de la colibactine en modifiant ou en séquestrant les molécules de colibactine active qui pourraient se trouver dans le cytoplasme, par exemple lors d’une ré-internalisation après l’étape de clivage périplasmique (Figure 15) [72]. De plus, l’expression hétérologue de ce système de protection dans des cellules eucaryotes leur confère une résistance partielle à la génotoxicité induite par la colibactine, suggérant une pénétration de la toxine dans la cellule hôte [72].

Système de régulation ?

La protéine ClbR codée par l’îlot pks comporte un domaine de liaison à l’ADN comportant un motif hélice-tour-hélice [2]. Bien que la fonction de cette protéine de la famille LuxR soit inconnue, elle pourrait intervenir dans la régulation de l’expression des gènes de l’îlot.

Figure 15. Modèle de synthèse et d’export de la colibactine

PPTase ; PKS ; NRPS ; enzyme accessoire ; pompe à efflux ; peptidase ; protéine de résistance [69].