Effets des pesticides seuls et en mixtures sur les biofilms périphytiques

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Effets des pesticides seuls et en mixtures sur les biofilms

périphytiques

C. Nassiet

To cite this version:

C. Nassiet. Effets des pesticides seuls et en mixtures sur les biofilms périphytiques. Sciences de l’environnement. 2010. �hal-02593810�

UNIVERSITÉ VICTOR SEGALEN – BORDEAUX 2

UNITÉ DE FORMATION ET DE RECHERCHE DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES

ANNÉE 2009-2010

EFFETS DES PESTICIDES

SEULS ET EN MIXTURES

SUR LES

BIOFILMS PÉRIPHYTIQUES

MÉMOIRE

POUR LE MASTER EAU – SANTÉ - ENVIRONNEMENT

Option Qualité des Écosystèmes Aquatiques

Présenté et soutenu le 08 Octobre 2010

Par

Nassiet Cécile

Mémoire réalisé à la suite du stage effectué au

Cemagref, Cestas

Sous la direction

Soizic Morin

du

01 Avril 2010 au 30 Septembre 2010

Résumé

La culture de la vigne contamine les cours d’eau avoisinants, notamment par les pesticides. Le biofilm périphytique, est utilisé en tant qu’indicateur de la qualité des cours d’eau. La rivière Morcille constitue un site de référence pour l’évaluation de l’impact des toxiques car elle traverse une zone viticole (le Beaujolais) et présente un gradient de contamination par les pesticides d’amont vers l’aval.

Les études présentées dans ce rapport ont permis d’évaluer les effets des mélanges de pesticides présents dans ce cours d’eau, principalement des herbicides et des fongicides, prélevés grâce une technique d’échantillonnage passif. Du biofilm provenant de l’amont de la Morcille a été exposé en microcosmes à des concentrations réalistes de pesticides échantillonnés à l’aval de la rivière. De manière générale, les résultats n’ont pas montré d’effets toxiques sur la durée d’expérimentation mais une différence de structure de la communauté diatomique et de tolérance aux pesticides a été mise en évidence entre l’amont et l’aval du cours d’eau.

Un bio-essai réalisé ensuite pour tester l’effet particulier du pesticide majoritaire, le norflurazon, a montré une toxicité à fortes concentrations sur le biofilm.

Mots-clés: biofilm, pesticides, qualité de l’eau, communauté diatomique, microcosmes,

bio- essai.

Abstract

Vineyards are important causes of water contamination, particularly by pesticides. Periphytic biofilm is used for water quality assessment. The Morcille River is a reference area for pesticides effect, because it drains a large vineyard area (Beaujolais) and presents a contamination gradient from up to downstream.

The studies presented in this report permitted to evaluate the impact of pesticide mixtures present in this river, mainly herbicides and fungicides, collected with a passive sampler technique. Biofilm from upstream the river was exposed in microcosms at realistic concentrations of pesticides sampled downstream.

In a general way, results showed no toxic effects during the experiment but they demonstrated a structure shift in diatomic community and a difference in tolerance to pesticides between upstream and downstream.

A bio-assay, was then performed to assess the particular effect of the main herbicide found in this river, the norflurazon, and revealed toxicity on biofilm at high concentrations.

Keywords: biofilm, pesticides, water quality, diatomic community, microcosms, bio-assay.

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Remerciements

Dans un premier temps, je tiens à remercier François Delmas, Ingénieur et Chercheur dans l'équipe “Réponses biologiques et écologiques à la contamination en milieu aquatique” (BELCA) de m’avoir permis de réaliser ce stage au sein de son équipe. C’est une formidable opportunité qui m’a été offerte.

Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Soizic Morin, chargée de recherche en Algologie-Écotoxicologie, qui m’a encadrée. Elle m’a initiée au vaste domaine de l’écotoxicologie qui m’était inconnu, avec patience et pédagogie, ainsi qu’un enthousiasme et une bonne humeur constants. Je la remercie également du temps passer à m’aider aux déterminations des diatomées, souvent complexes, et pour son soutien lors de notre déplacement à Lyon.

Je tiens également à témoigner ma sympathie à Vincent Roubeix, post-doctorant, pour ses conseils avisés prodigués toujours avec gentillesse.

Je remercie Nicolas Mazella, Maryse Boudigues et Muriel Bonnet, pour m’avoir accueillie au sein du laboratoire de chimie ainsi que d’avoir réalisé toutes les analyses nécessaires lors de mon bio-essai et de mes manipulations à Lyon.

Je souhaiterais également apporter toute ma sympathie à Stéphane Pesce et son équipe EMHA (Écologie Microbienne des Hydrosystèmes anthropisés) au Cemagref de Lyon, pour m’avoir accueillie lors de ces quinze jours d’expérimentation et de m’avoir transmis leurs connaissances mais aussi de m’avoir permis d’aller visiter le bassin versant de la Morcille, dans le Beaujolais.

Enfin je souhaiterais remercier toutes les personnes du Cemagref qui ont participé au bon déroulement de ce stage et en particulier Gaël Gilbert, Laurie Schouler pour leurs aides lors de mes expériences et Ludivine Zecchi pour les bons moments partagés durant ces six mois.

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TABLE DES MATIÈRES

INTRODUCTION... 8

CHAPITRE 1 : Contexte de l’étude ... 9

I. Matériel biologique. ... 10

I.1. Les communautés périphytiques. ... 10

I.2. Les diatomées... 11

I.2.1. Structure cellulaire. ... 12

I.2.2. Cycle de reproduction. ... 12

I.2.3. Classification... 13

I.2.4. Écologie... 14

I.3. Intérêt pour la bio-indication... 14

II. Les pesticides. ... 16

II.1. Les catégories de pesticides. ... 16

II.2. Autorisation de mise sur le marché. ... 18

II.3. Les pesticides dans la Directive Cadre sur l’Eau. ... 19

II.4. Échantillonnage des pesticides... 20

III. Site d’étude... 21

III.1. Le bassin versant de la Morcille... 21

III.2. Les deux stations étudiées. ... 22

IV. Les études réalisées... 23

IV.1. Projet CONCERTO... 23

IV.2. Bio-essai. ... 23

CHAPITRE 2 : Matériel et Méthodes. ... 24

I. Mise en culture du biofilm... 25

I.1. Projet Concerto... 25

I.2. Le bio-essai. ... 25

II. Le milieu de culture... 26

II.1. Le projet Concerto... 26

II.2. Bio-essai. ... 27

III. Les conditions d’expérimentation... 28

III.1. Le courant... 28

III.1.1. Projet Concerto. ... 28

III.1.2. Bio-essai. ... 28

III.2. Température de l’eau... 28

III.3. Éclairement... 29

III.4. pH. ... 29

IV. Schémas d’expérimentation. ... 30

IV.1. Projet Concerto... 30

IV.1.1. Mesure des effets à long terme. ... 30

IV.1.2. PICT. ... 30 IV.2. Bio-essai. ... 33 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

V. Les paramètres étudiés. ... 33

V.1. Mesure de l’activité photosynthétique. ... 33

V.1.1. Phyto-PAM fluorimètre. ... 33

V.1.2. Le fluoroprobe. ... 34

V.2. Le poids sec et la matière sèche sans cendre... 35

V.2.1. Mesure du poids sec. ... 35

V.2.2. Matière sèche sans cendre... 35

V.3. Densité de cellules... 36

V.4. Le taux de mortalité... 37

V.5. Les analyses statistiques... 37

V.6. Analyse qualitative des communautés de diatomées. ... 37

V.6.1. Indices de diversité. ... 38

V.6.2. Analyse en composante principale. ... 38

CHAPITRE 3 : Projet CONCERTO : Mesures des effets à long terme... 39

I. Mise en pratique de l’expérience. ... 40

II. Résultats. ... 42

II.1. Résultats physico-chimiques. ... 42

II.2. Mesure de l’activité photosynthétique. ... 43

II.2.1. Groupes algaux... 43

II.2.2. Quantité de chlorophylle a. ... 43

II.3. Analyse quantitative du biofilm. ... 44

II.3.1. Poids sec et matière sèche sans cendre. ... 44

II.3.2. Densité de cellules vivantes et taux de mortalité... 45

II.4. Analyse qualitative de la communauté... 46

II.4.1. Abondance relative. ... 48

II.4.2. Indices de diversité. ... 49

II.4.3. Analyse en composante principale. ... 49

II.5. Discussion. ... 51

CHAPITRE 4 : Projet CONCERTO : Pollution-Induced Community Tolerance (PICT)... 52

I. Principe de la méthode de Pollution-Induced... 53

Community Tolerance (PICT). ... 53

II. Application de la méthode. ... 54

III. Résultats. ... 56

III.1. Résultats physico-chimiques. ... 56

III.2. Mesure de l’activité photosynthétique. ... 57

III.2.1. Groupes algaux... 57

III.2.2. Quantité de chlorophylle a. ... 57

III.2.3. Calcul des CE50... 58

III.3. Analyse quantitative du biofilm. ... 59

III.3.1. Poids sec et Matière sèche sans cendre... 59

III.3.2. Densité de cellules vivantes. ... 60

III.3.3. Taux de mortalité... 61

III.4. Analyse qualitative du biofilm. ... 61

III.4.1. Présentation des espèces. ... 61

III.4.2. Abondance relative. ... 65

III.4.3. Indices de diversité. ... 66

III.4.4. Analyse en composante principale. ... 67

III.5. Discussion. ... 68 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

CHAPITRE 5 : Bio-essai avec un pesticide : le Norflurazon ... 70

I. Définition d’un test d’écotoxicité. ... 71

II. Fiche d’identité de la substance active, le Norflurazon. ... 71

III. Conditions de contamination... 72

IV. Résultats. ... 74

IV.1. Données physiques... 75

IV.2. Mesure de l’activité photosynthétique. ... 75

IV.2.1. Groupes algaux... 75

IV.2.2. Quantité de chlorophylle a. ... 76

IV.3. Analyse quantitative du biofilm. ... 76

IV.3.1. Densité totale de cellules... 76

IV.3.2. Taux de mortalité... 77

IV.3.3. Régression linéaire. ... 78

IV.4. Analyse qualitative des communautés de diatomées. ... 78

IV.4.1. Présentation des espèces. ... 78

IV.4.2. Abondance relative. ... 80

IV.4.3. Indices de diversité. ... 81

IV.4.4. Analyse en composante principale. ... 82

IV.5. Discussion. ... 83

CHAPITRE 6 : Discussion générale, Conclusion et Perspectives... 85

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 89 ANNEXES... 92 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Liste des figures.

Figure 1. Schématisation de la formation du biofilm, (Source, www.ifremer.fr). ………...11

Figure 2. Photographies des différentes formes de diatomées, (Photographies de Jason Oyadomari, Source : http//www.bio.mtu.cdu/)………..11

Figure 3. Vue au microscope électronique de la structure du frustule de la diatomée Luticola Ventricosa, (d’après Güttinger, 1999)………12

Figure 4. Modes de reproduction des diatomées, (d'après Round et al, 1990)……….13

Figure 5. Clé simplifiée de détermination des genres de diatomées d’eau douce, (Morin, 2006, d'après Krammer et Lange-Bertalot, 1986-1991)………...14

Figure 6. Schématisation du transfert des pesticides dans l’environnement, (Source http://tpemonsanto.blogspace.fr)...17

Figure 7. Schéma d’autorisation de mise sur le marché d’une substance active à l’échelle Européenne, (Source, Roulier 2010)………..18

Figure 8. Schéma d’autorisation de mise sur le marché d’un produit phytosanitaire à l’échelle Nationale, (Source Roulier, 2010)………..19

Figure 9. Photographie d’un POCIS (à gauche), schéma éclaté d’un POCIS (à droite), (Source Mazella et al, 2009)……….20

Figure 10. Schéma du bassin versant, Ardières-Morcille, (www.graie.org/zabr/sites/site6.htm)...21

Figure 11. Cartographie du bassin versant de la Morcille (Source Montuelle, 2010)………22

Figure 12. Photographies des deux stations : Saint-Joseph (à gauche), Saint-Ennemond (à droite), (Source Nassiet, 2010)………..23

Figure 13. Schématisation de la mise en culture sur substrats artificiels du biofilm……….25

Figure 14. Photographie de l’aquarium utilisé pour le bio-essai, (Source Nassiet, 2010)……….26

Figure 15. Station Organ sur la rivière Gèze (Gers), (Source Couprie, 2009)………...27

Figure 16. Schéma des canaux dans le cadre de l’expérience sur les effets à long terme………..31

Figure 17. Photographie des microcosmes utilisés dans le cadre des effets à long terme, (Source Nassiet, 2010)………...31

Figure 18. Schéma des canaux dans le cadre de l’expérience avec la méthode PICT………...32

Figure 19. Photographie des microcosmes utilisés pour le PICT, (Source Nassiet, 2010)………32

Figure 20. Dispositif expérimental du bio - essai (plateaux tournants), (Source Nassiet, 2010)……...33

Figure 21. Photographie de l’appareil phyto-pam, (Source www.namoto.com)...34

Figure 22. Photographie de l’appareil fluoroprobe, (Source Martins-Azevedo, 2009)………..35

Figure 23. Photographie des filtres après filtration (à gauche) et après séchage à l’étuve (à droite), (Source Nassiet, 2010)………...36

Figure 24. Photographie d’une cellule de Nageotte (Source Schouler, 2010)………....36

Figure 25. Canaux utilisés lors de la manipulation et disposition des lames colonisées………40

Figure 26. Échelle de temps de l’expérience………..41

Figure 27. Système de refroidissement de température de l’eau synthétique, (Source, Nassiet 2010)..42

Figure 28. Représentation graphique des contributions algales dans les échantillons………...43

Figure 29. Représentation de l’activité photosynthétique aux cinq temps de prélèvement…………...43

Figure 30. Représentation graphique du poids sec et de la matière sèche sans cendre aux cinq temps de prélèvement………...44

Figure 31. Représentation graphique de la densité cellulaire et du taux de mortalité calculés aux temps initial et final……….45

Figure 32. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm……46

Figure 33. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm……47

Figure 34. Représentation graphique de l’abondance relative dans les différents échantillons……….48

Figure 35. Représentation graphique de l’Analyse en Composante Principale des abondances relatives en fonction des traitements………50

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Figure 38. Photographie du système de refroidissement de température de l’eau synthétique (Source

Nassiet, 2010)………56

Figure 39. Représentation graphique de la contribution algale dans les échantillons………57

Figure 40. Représentation graphique de l’inhibition du rendement photosynthétique en fonction du gradient de dilution………57

Figure 41. Représentation graphique du calcul de la CE50 à T0 (à gauche pour P1 et à droite pour P3).58 Figure 42. Représentation graphique du calcul de la CE50 à Tf (en haut à gauche le canal P1, en haut à droite le canal P2 et en bas, le canal P3)……….59

Figure 43. Représentation graphique du poids sec et de la matière sèche sans cendre aux temps T0 et Tf ………...59

Figure 44. Représentation graphique de la densité de cellules vivantes aux temps T0 et Tf…………...60

Figure 45. Représentation graphique du taux de mortalité aux temps T0 et Tf………...61

Figure 46. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm...62

Figure 47. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm...63

Figure 48. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm...64

Figure 49. Représentation graphique de l’abondance relative dans les différents échantillons……….65

Figure 50. Représentation graphique de l’Analyse en Composante Principale des abondances relatives en fonction des traitements……….67

Figure 51. Échelle de temps du bio - essai……….73

Figure 52. Concentrations en Norflurazon entre l’amont et l’aval de la Morcille, Année 2009………74

Figure 53. Photographie du bassin versant de la Morcille (Source, Nassiet 2010)………74

Figure 54. Représentation des contributions algales selon la concentrationà Tf………...75

Figure 55. Représentation graphique de la teneur moyenne en chlorophylle a selon la concentration en herbicide à Tf , (échelle logarithmique), (mesures réalisées au fluoroprobe)…………...76

Figure 56. Représentation graphique de la densité cellulaire selon la concentration à Tf ……...……..76

Figure 57. Représentation graphique du taux de mortalité selon la concentration à Tf………..77

Figure 58. Représentation graphique de la corrélation entre deux descripteurs : chlorophylle a et densité de cellules vivantes………78

Figure 59. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm, Navicula tridentula, (Source, Nassiet, 2010)………79

Figure 60. Microphotographies des espèces principales, (Coste, 1999) – Barre d’erreur = 10µm...80

Figure 61. Représentation graphique de l’abondance relative selon la gamme de concentrations……80

Figure 62. Représentation graphique de l’Analyse en Composante Principale des abondances relatives en fonction des traitements……….82

Figure 63. Schématisation des niveaux d’organisation………..86

Liste des tableaux.

Tableau 2. Références qualité des teneurs en pesticides dans l’eau potable………..18

Tableau 3. Éléments constitutifs de l’eau synthétique………26

Tableau 4. Résultats de l’auto-analyseur (Laboratoire de Chimie du Cemagref)………..27

Tableau 5. Valeurs physico-chimiques relevées lors de l’expérience………42

Tableau 6. Valeurs des indices de diversité………49

Tableau 7. Valeurs propres calculées lors de l’Analyse en Composante Principale………..49

Tableau 8. Dilutions réalisées pour le test écotoxicologique de la méthode PICT………54

Tableau 9. Valeurs physico-chimiques relevées lors de l’expérience………...56

Tableau 10. Valeurs des p-value estimées dans les tests de comparaisons multiples………58

Tableau 11. Valeurs des indices de diversité………..66

Tableau 12. Valeurs propres calculées lors de l’Analyse en Composante Principale………67

Tableau 13. Récapitulatif des valeurs de CE50 (nc= non calculée)...………..68

Tableau 14. Gamme de concentrations réalisées lors du bio-essai……….72

Tableau 15. Valeurs physico-chimiques relevées lors de l’expérience, (nombre de mesures : 13)…...75

Tableau 16. Valeurs des indices de diversité………..81

Tableau 17. Valeurs propres calculées lors de l’Analyse en Composante Principale………82

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INTRODUCTION

La préservation de la qualité des eaux de surface est devenue une préoccupation socio-économique majeure, symbolisée notamment par la mise en œuvre de la Directive Cadre sur l’Eau qui impose le retour au « bon état » chimique et écologique des masses d’eau d’ici à 2015. Les cours d’eau situés en zones agricoles sont notamment très sensibles aux contaminations par les pesticides. L’évaluation de l’impact écologique des produits phytosanitaires utilisés en agriculture impose de déterminer les caractéristiques de sensibilité et de tolérance des organismes qui y sont exposés. Dans ces milieux lotiques, les communautés périphytiques interviennent dans des processus écologiques majeurs tels que la photosynthèse, la dégradation de la matière organique et le recyclage des nutriments. Le périphyton est un maillon biologique central pour illustrer les atteintes provoquées par les toxiques sur la réalisation de la production primaire avec de possibles répercussions sur les niveaux supérieurs de l’édifice. En effet, ces communautés, sont en constante interaction avec les substances dissoutes et sont ainsi capables de répondre de manière rapide aux changements environnementaux et à s’y adapter de manière transitoire ou réversible.

Dans le cas des pollutions à toxiques, le développement de bioindicateurs spécifiques est beaucoup moins avancé qu’en évaluation du niveau de pollution trophique des eaux. Le développement de ces outils de bio-évaluation nécessite en même temps une meilleure évaluation de l’environnement toxique dans lequel évolue ces communautés, afin d’étudier les possibles interactions.

L’objectif de ce stage qui s’inscrit dans le projet du Ministère de l’Energie, de l’Ecologie du Développement Durable et de la Mer, intitulé « Contamination des cours d’eau :

Caractérisation chimique, Effets et Risques Écotoxicologiques » (CONCERTO) est

d’améliorer les réseaux de surveillance de la contamination de l’environnement par les pesticides.

Les études réalisées visent à :

- mieux qualifier et quantifier les impacts des pesticides sur les biofilms des cours d’eau, à différents niveaux d’organisation biologique ;

- caractériser les effets écologiques et les éventuelles interactions de mélanges de pesticides, en privilégiant comme modèle d’étude les communautés périphytiques ; - établir les caractéristiques de sensibilité et de tolérance d’espèces aux différents

modes d’action toxique, et tester les descripteurs les plus pertinents.

Ce rapport est constitué de six chapitres : les deux premiers chapitres situant le contexte de l’étude et présentant les bases méthodologiques utilisées. Les deux chapitres suivants présenteront les résultats relatifs aux effets à long terme des mélanges de pesticides sur les biofilms périphytiques. La partie suivante concerne le bio-essai réalisé à la suite des résultats obtenus lors de l’étude des effets à long terme, à savoir un test écotoxicologique avec le norflurazon. Enfin, dans la dernière partie les résultats obtenus pour chaque étude seront discutés afin d’évaluer les impacts des mélanges de pesticides et d’aborder les perspectives possibles pour les futures études à venir.

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CHAPITRE 1 :

Contexte de l’étude.

I.

Matériel biologique.

I.1. Les communautés périphytiques.

Le périphyton, ou biofilm, est un ensemble d’organismes microbiens (microalgues, bactéries, champignons…) enchâssés dans une matrice de polymères extracellulaires, ubiquiste des écosystèmes aquatiques et plus particulièrement de toute surface immergée. Il joue un rôle essentiel dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques car il est le siège de processus auto- et hétérotrophes intervenant dans les principaux cycles biogéochimiques (Kostel et al, 1999). Grâce à la présence d’algues, le périphyton contribue largement à la production primaire et la présence d’organismes hétérotrophes lui permet d’assurer la biodégradation et la minéralisation de composés organiques et le recyclage des nutriments. Sa biomasse constitue une source de nourriture importante pour les invertébrés (Cattaneo et Kalff, 1980).

Il existe une classification selon le type de substrat que colonise le périphyton :

o

oo ll’’ééppiipphhyyttoon désigne le périphyton colonisé sur les végétaux, n

o

oo ll’’ééppiilliitthhoon désigne le périphyton colonisé sur des substrats minéraux, tels que les n

galets ou les cailloux,

o

oo ll’’ééppiippeelloon désigne le périphyton colonisé sur la vase. n

o

oo ll’’ééppiippssaammmmoon désigne le périphyton colonisé sur le sable. n

Dans notre étude, sera étudié uniquement du périphyton collecté sur substrats durs dans la rivière et mis en culture en aquariums sur substrats artificiels de type « lame de verre ».

La formation du biofilm peut être décrite en cinq étapes:

1- La première étape est l'adhésion (réversible) de microorganismes mobiles à une surface.

2- L’adhésion permanente par la formation de molécules protéiques appelées ligands. 3- Les microorganismes se divisent en place, formant ainsi des micro-colonies. À partir d'une concentration suffisamment dense d'individus, les micro-colonies commencent la sécrétion de la matrice extracellulaire.

4- Le biofilm grandit et « mûrit », s'épaississant jusqu'à devenir macroscopique.

5- La cinquième étape est la phase de dispersion induite par le vieillissement du biofilm (auto-détachement), stress ou par certaines carences. Les microorganismes peuvent alors se séparer du biofilm, en consommant parfois la matrice qui représente alors une source d'énergie. Ces microorganismes retournent à l'état de libre circulation et peuvent aller coloniser de nouvelles surfaces (Davies et al, 1998).

Il existe au sein du biofilm plusieurs types de relations possibles comme des relations de compétition, ou de dépendance entre les microorganismes en fonction de la nature même du biofilm, des conditions environnementales,…

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I.2. Les diatomées.

Les diatomées, appelées également Bacillariophycées, sont des algues unicellulaires eucaryotes dont la taille varie de 10µm à 500µm. Ce sont des algues brunes appartenant à l’embranchement des Chromophytes. Elles peuvent évoluer sous forme solitaires ou sous forme de colonies, étoilées, rubanées ou filamenteuses. Actuellement, plus de 11 000 espèces ont été recensées (Mann et Droop, 1996). Ces algues brunes entrent dans la composition du biofilm. Leur faible besoin en lumière et en humidité leur permettent de se développer dans des milieux bien différents que ce soit dans l’eau ou sur le sol.

Figure 2. Photographies des différentes formes de diatomées, (Photographies de Jason Oyadomari, Source : http//www.bio.mtu.cdu/).

5/ Détachement

Figure 1. Schématisation de la formation du biofilm, (Source, www.ifremer.fr). CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

I.2.1. Structure cellulaire.

Les diatomées sont constituées d’un squelette externe appelé le frustule essentiellement composé de silice, formant une paroi entourant la cellule. Celui-ci se compose de deux valves qui s’imbriquent : l’hypovalve et l’épivalve, reliées entre elles par des ceintures connectives, l’épicingulum et l’hypocingulum. La cohérence de cet ensemble est renforcée par une matrice organique extracellulaire constituée de polymères au travers de perforations présentes sur toute la surface du frustule (Duke et Reinmann, 1977). Les substances sécrétées jouent un rôle dans la mobilité, l’adhésion au substrat ainsi que dans la formation des colonies et la dessication (Hoagland et al, 1993). Les diatomées possèdent un protoplasme contenant les mêmes organites cellulaires que les autres algues eucaryotes : noyau, mitochondries, chloroplastes,… Les pigments photosynthétiques sont des chlorophylles (a et c) et des caroténoïdes (β-carotène, fucoxanthine, diatoxanthine, diadinoxanthine) (Jørgensen, 1977). Ce sont ces pigments qui ont induit la classification des diatomées dans le groupe « algues brunes » du fait de la coloration jaune- brun des chloroplastes.

Figure 3.Vue au microscope électronique de la structure du frustule de la diatomée Luticola ventricosa, (d’après Güttinger, 1999).

I.2.2. Cycle de reproduction.

Les diatomées alternent une multiplication végétative, qui prédomine, et une multiplication sexuée. Lors de la reproduction asexuée, chaque cellule fille reçoit la moitié de la paroi de la cellule mère, l’épivalve, et fabrique elle-même la paroi qui lui manque, l’hypovalve. Chaque division produit une cellule de même taille que la cellule-mère et une cellule plus petite. Ce processus de bipartition entraîne une réduction de la taille de l’espèce. Lorsque la taille de l’individu atteint une limite critique ou lorsque les conditions environnementales le permettent, la reproduction sexuée est mise en place et permet de retrouver des individus de taille normale. Celle-ci varie selon les espèces mais l’auxosporulation (formation de cellule-œuf) a toujours lieu (Round et al, 1990). Cette reproduction sexuée permet également un brassage génétique.

Lorsque les conditions sont défavorables, (notamment lorsque l’azote devient un facteur limitant) on observe la formation de microspores de résistance : les hypnospores (McQuoid, 2002). CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

Figure 4. Modes de reproduction des diatomées, (d'après Round et al 1990).

I.2.3. Classification.

La classification des diatomées se fait par observation des caractéristiques du frustule, observé en vues valvaire (de face) et connective (de profil) : forme, taille, symétrie, agencement et densité des ornementations des valves… En effet, les valves de certaines espèces sont très caractéristiques telles que le nombre de stries, de ponctuations… L’élimination par traitement chimique du protoplasme des cellules et de la couche extérieure des matières organiques permet d’observer les détails des frustules au microscope photonique. Ces critères morphologiques sont utilisés pour leur identification jusqu’au niveau de l’espèce, lors de l’examen microscopique (Round et al, 1990). Il existe de nombreuses classifications des diatomées, qui sont révisées régulièrement. La Süβwasserflora de Krammer et Lange-Bertalot (1986-91), distingue deux ordres de diatomées :

- les diatomées centriques, majoritairement pélagiques, sont définies par des critères de symétrie axiale des valves, et d’arrangement des ornementations (nombre de pores, organisation radiale ou concentrique).

- Les diatomées pennées, prédominantes dans le microphytobenthos, se distinguent par une forme allongée des valves (linéaires, lancéolées ou ovales) et une symétrie des ornementations du frustule généralement bilatérale. Certaines présentent une interruption des stries dans l’axe longitudinal de la valve, le pseudo-raphé ou une fente longitudinale, le raphé. Les diatomées pennées se distinguent entre elles par, la présence et le nombre de raphé :

- les araphidées, qui ne possèdent pas de raphé ;

- les monoraphidées, qui possèdent un raphé sur une seule des deux valves ; - les biraphidées, avec un raphé sur chaque valve, celui-ci pouvant être placé longitudinalement au centre, décalé latéralement, excentré ou confiné aux marges de la valve entière.

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Figure 5. Clé simplifiée de détermination des genres des diatomées d'eau douce, (Morin, 2006, d'après Krammer et Lange-Bertalot, 1986-1991).

I.2.4. Écologie.

Les diatomées possèdent une grande amplitude écologique et sont capables de coloniser tous les types de milieux aquatiques (lacustres, marins, terrestres ou aériens), même ceux aux conditions rigoureuses. Les habitats aquatiques colonisés peuvent être des lacs, des mares, des rivières, mais aussi des estuaires ou encore le milieu marin.

Les diatomées présentent deux modes de vie différents, une partie des espèces étant planctoniques alors que les autres sont périphytiques. Les diatomées dites phytoplanctoniques se développent essentiellement dans la colonne d’eau, et appartiennent généralement au Centriques et aux Araphidées. Elles ont une importance écologique considérable, contribuant à près de 25 % de la production primaire totale de la planète (Werner, 1977). Les diatomées benthiques, se développent à la surface des substrats immergés et peuvent être classées en

cinq groupes selon leur substrat d’attachement : ééppiippéélliiqquuees (sédiments organiques fins), s

é

éppiippssaammmmiiqquuees (grains de sable), s ééppiilliitthhiiqquuees (substrats durs, roches), s ééppiipphhyyttiiqquueess

(macrophytes), et ééppiizzooïïqquueess (animaux). Elles sont sensibles aux variations des divers

facteurs que sont la température, le pH, la lumière, la salinité, les macronutriments (tels que l’azote ou le phosphore), la teneur en silice ou encore le courant.

I.3. Intérêt pour la bio-indication.

Le terme bioindication englobe les méthodes biologiques qui permettent de tirer des conclusions sur les conditions de l’environnement en se basant sur les organismes présents (Nagel, 1991). D’après la définition de Blandin, en 1986, un bio-indicateur peut être défini comme un organisme ou ensemble d’organismes qui - par préférence à des variations biochimiques, cytologiques, physiologiques, éthologique ou écologique - permet de façon pratique et sûre de caractériser l’état d’un écosystème ou d’un écocomplexe et de mettre en évidence aussi précocement que possible leurs modifications naturelles ou provoquées.

Pour que des organismes ou des communautés d’organismes puissent être qualifiés de

bio-indicateurs, leur présence, leur comportement ou leurs adaptations physiologiques

(changements d’état réversibles) doivent être en relation aussi simple et étroite que possible avec des facteurs écologiques (facteurs de stress).

L’utilisation du périphyton ou des communautés de diatomées en tant que bio-indicateur n’est plus à démontrer : en effet ils possèdent de nombreuses qualités leur

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d’intégrer et de refléter les conditions physiques et biologiques de l’environnement où il se trouve. Son taux d’accroissement élevé, lié à une vitesse de reproduction rapide des organismes qui le composent, conduit à une intégration rapide des changements environnementaux biotiques ou abiotiques. De plus, la diversité taxonomique ou son niveau d’organisation biologique par la présence de microorganismes de nature diversifiée (hétérotrophes, décomposeurs,…) confère au périphyton une sensibilité modérée et des relations complexes.

La communauté de diatomées présente une grande diversité spécifique ainsi qu’une large répartition géographique, ce qui a permis la constitution de vastes bases de données et donc une source d’informations importante. Elles appartiennent au phytoplancton tout comme au périphyton, et sont à la base du réseau trophique : leur cycle de développement est donc très court et elles réagissent de manière rapide lors d’une pollution. Enfin leur rémanence, assurée par leur squelette siliceux, favorise la conservation des informations. En effet, garder les montages des échantillons constitue une forme de traçabilité.

Depuis les années 80, différents indices biologiques ont été mis en place afin d'estimer la qualité des systèmes aquatiques à partir de communautés diatomiques périphytiques. L’indice le plus utilisé est l’indice biologique diatomique, IBD (Lenoir et Coste, 1996) qui a été conçu pour une application à l’ensemble des cours d’eau, à l’exception des zones naturellement salées. Cet indice est utilisé pour évaluer l’état écologique des cours d’eau dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l’Eau.

L’Indice Biologique Diatomique a été proposé en 1995 (Lenoir et Coste, 1996) à la demande des Agences de l’Eau afin de mettre à disposition des gestionnaires un indice global pratique et normalisé venant compléter les informations fournies par l’Indice Biologique Global Normalisé. L’Indice Biologique Diatomique a été normalisé selon la norme AFNOR NF T90-354 qui encadre les techniques d’échantillonnages, d’analyse et de calcul de l’indice. Une nouvelle version a été proposée en 2006. Cet indice permet d’évaluer la qualité de l’eau d’un cours d’eau au moyen d’une analyse de la flore diatomique benthique.

La mise au point de l’indice biologique diatomées s’est faite à partir de la constitution d’une base de données biologiques et chimiques. 2704 relevés ont été réalisés entre 1974 et 1998, un ensemble de 209 taxons a été retenu pour le calcul de l’indice. Concernant les données chimiques, elles ont été extraites des bases de données des Agences de l’Eau et concernent quatorze paramètres : température de l’eau, pH, conductivité, matières en suspension,

demande biologique en oxygène (DBO5), demande chimique en oxygène (DCO), O2 et

pourcentage d’O2, azote Kjeldhal, ammonium, nitrate, nitrite, orthophosphate et chlorure.

Cet indice peut être appliqué en vue de :

- évaluer la qualité biologique d’une station bien définie (étude ponctuelle);

- suivre l’évolution temporelle de la qualité biologique d’une station (saisonnière ou

pluriannuelle);

- suivre l’évolution spatiale de la qualité biologique d’un cours d’eau (comparaison

entre l’amont et l’aval);

- évaluer les conséquences d’une perturbation sur le milieu (comparaison entre

l’amont et l’aval d’un rejet);

Si cet indice est un indicateur pertinent pour l’évaluation d’une pollution d’origine trophique, il est cependant peu efficace contre les pollutions toxiques (Morin 2009, 2010). C’est pourquoi dans le cadre de cette étude il ne sera pas utilisé.

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II.

Les pesticides.

Depuis près d’un demi-siècle, la modernisation de l’agriculture a été marquée par

l’introduction et l’utilisation massive des pesticides dans les pratiques culturales.

Actuellement, la surface agricole utile occupe en France près de 30 millions d’hectares (en 2004) et elle est le troisième consommateur mondial de produits phytosanitaires. L’agriculture conditionne donc amplement le cycle des ressources naturelles, la biodiversité et le paysage.

(IFEN, 2004). Les formes les plus intensives de l’agriculture peuvent altérer la qualité de la

ressource en eau par un excès éventuel de fertilisants ou une utilisation mal appropriée de produits phytosanitaires. Cela engendre ainsi une contamination des différents compartiments, eau, air et sol et une pollution de ces compartiments. L'évolution des pratiques agricoles s'est accompagnée de la hausse des rendements, mais aussi d'effets non intentionnels incontestables sur différentes composantes du milieu naturel. Les données acquises par les réseaux de surveillance de la qualité des eaux (superficielles et aquifères) témoignent de la dégradation progressive de la qualité, tant sur le plan des enrichissements en nutriments que de la présence de produits phytosanitaires.

D’après les données 2006 publiées par l’Institut Français de l’ENvironnement, la présence de pesticides a été détectée et quantifiée au moins une fois sur 90% des 1097 points interprétables des réseaux de connaissance générale et phytosanitaires. Les molécules les plus rencontrées dans les cours d’eau sont le glyphosate, le diuron ou l’atrazine. Ils appartiennent tous à la famille des herbicides et pour les deux derniers ont été retirés de l’homologation depuis 2003. De manière plus générale, les fongicides et les herbicides sont les produits les plus vendus en France et sont donc le plus souvent retrouvés dans les eaux superficielles ou souterraines.

II.1. Les catégories de pesticides.

Les pesticides sont destinés à protéger les plantes cultivées et les produits récoltés des attaques de champignons, parasites, d’insectes, d’acariens, de rongeurs ou encore à détruire les adventices ou mauvaises herbes. Leur utilisation peut être très diverse, depuis les applications au champ jusqu’au désherbage des parcs, des trottoirs, mais également le traitement des jardins. Ils sont formés d’une ou plusieurs substances actives et d’adjuvants. Il existe trois grandes catégories de pesticides présentées dans le tableau 1 suivant :

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N

Naattuurree CCiibbllee MMooddeedd’’aaccttiioonn CCaattééggoorriiee

Herbicides Plantes envahissantes •• Action multiple :

perturbation photosynthèse, inhibition synthèse des lipides, acides aminés et caroténoïdes • • Carbamates, • • Urées substituées, • • Triazines • • Phytohormones • • Amines • • … Insecticides Insectes nuisibles •• Action sur le système

nerveux, notamment inhibition de la transmission de l’influx nerveux • • Organochlorés • • Organophosphorés • • Carbamate • • … Fongicides Champignons parasites

des végétaux

•

• Action sur respiration mitochondriale, inhibition de la synthèse d’éléments essentiels : stérols, acides aminés,… • • Produits à base de métaux, • • Soufre, • • Produits soufrés, • • Carbamates, • • … Tableau 1. Caractéristiques des trois types de pesticides les plus importants.

La dispersion des produits phytosanitaires après application engendre des pollutions de tous les milieux, aériens, terrestres ou aquatiques. Comme le montre le schéma ci-après, les produits, dans les milieux aquatiques, peuvent s’introduire dans le cycle de l’eau et ainsi pénétrer dans les différents compartiments tels que les eaux superficielles mais également dans les nappes d’eau souterraines.

Niveau de traitement

Substance

Dans ce cas là, les polluants peuvent contaminer l’eau potable, c’est pourquoi des critères de

potabilité liés aux quantités de pesticides sont fixéscomme le montre le tableau ci-après :

Figure 6. Schématisation du transfert des pesticides dans l’environnement (Source http://tpemonsanto.blogspace.fr).

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Paramètres Limites de qualité Pesticide (1) _{(par substance}

individuelle)

0,10 Aldrine, dieldrine, heptachlore,

Heptachlorépoxyde, (par substance individuelle)

0,03

Total des pesticides (2) _0,50

(1)_{Le terme pesticide regroupe : les fongicides organiques, les herbicides organiques, les insecticides organiques,}

les acaricides organiques, les nématocides organiques, les algicides organiques, les rodenticides organiques, les produits anti-moisissures organiques et leurs métabolites, produits de dégradation et de réaction pertinente.

(2)

Somme de tous les pesticides individualisés, détectés et quantifiés.

II.2. Autorisation de mise sur le marché.

L’autorisation de la mise sur le marché d’un produit phytosanitaire dépend de la Directive européenne 91/414 CEE. Elle prévoit des règles en matière d’évaluation, d’autorisation de mise sur le marché et de contrôle à l’intérieur de l’Union Européenne des produits phytopharmaceutiques et des substances actives qu’ils contiennent. Seuls sont autorisés les produits dont les substances actives sont inscrites à l’Annexe I de la directive et qui ne présentent pas de risque pour la santé humaine ou animale, ni pour l’environnement lorsque le produit est utilisé dans des conditions normales.

En France, l’autorisation de mise sur le marché des produits phytosanitaires relève de la compétence de la Direction Générale de l’Alimentation du Ministère chargé de l’Agriculture qui s’appuie notamment sur l’expertise de la Commission d’Etude de la toxicité ainsi que sur plusieurs instances complémentaires.

Société phytopharmaceutique

(pétitionnaire):

Constitue son dossier (données requises par

Annexes II et III)

États Membres Peer Review:

Examinent le rapport d’évaluation et consolident

l’évaluation des risques PRAPeR**** Groupe évaluation (vue

d’ensemble)

Commission Européenne

Phase décisionnelle: Examine le journal de l’AESA et propose une décision d’inclusion ou

de non inclusion

État Membre Rapporteur: (RMS**)

Examine le dossier Rédige un projet de rapport

d’évaluation (DAR***) AESA* coordonne l’évaluation AESA Préparation du journal de l’AESA *AESA: Autorité Européenne de Sécurité des Aliments

** RMS: Rapporteur Member State *** DAR: Draft Assessment Report

**** PRAPeR: Pesticide Risk Assessment Peer Review

Durée totale = 2-3 ans

13

Figure 7. Schéma d'autorisation de mise sur le marché d'une substance active à l'échelle européenne, (Source, Roulier 2010).

Tableau 2. Références qualité des teneurs en pesticides dans l’eau potable.

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Société phytopharmaceutique:

Constitue le dossier de demande d’AMM (données requises par

Annexes II et III et données d’efficacité)

Évaluateurs (CES*, Unités d’évaluation)

Rédigent des rapports d’évaluation DiVE: coordonne et réalise l’évaluation Ministère de l’Agriculture Phase décisionnelle: Consultation interministérielle et décision (ou non) de

mise sur le marché

CES:

Évaluation ou validation des rapports d’évaluation réalisés en

interne

DiVE:

•Consolidation des rapports

d’évaluation

•Préparation des avis de l’Afssa •Préparation des propositions de

décision

•Préparation des « Registration

Reports » Durée totale =

12 mois

21

*CES: Comité d’Experts Spécialisés

Figure 8. Schéma d'autorisation de mise sur le marché d'un produit phytosanitaire à l'échelle nationale (cas de la France), (Source Roulier, 2010).

II.3. Les pesticides dans la Directive Cadre sur l’Eau.

La Directive Cadre européenne sur l’Eau (Directive 2000/60/CE) a été élaborée par le parlement européen établissant un cadre pour une politique communautaire dans le domaine de l’eau. Il s’agit de la mise en place d’un cadre de protection pour :

- les masses d’eaux intérieures de surface ; - les masses d’eau souterraines ;

- les masses d’eau de transition ; - les masses d’eau côtières ;

Les États membres désignent une autorité compétente pour l’application de règles prévues par la directive au sein de chaque district hydrographique. Dans le cadre de cette directive, les États membres ont pour objectif, dans un premier temps, de recenser et identifier les différentes masses d’eau en évaluant leur qualité, et dans un second temps, de mettre en place un plan de gestion associé à un programme de mesures. Elle impose le maintien en bonne qualité, ou leur restauration pour l’atteinte du bon état en 2015.

Ce plan de gestion vise à :

- Prévenir la détérioration, améliorer et restaurer l’état des masses d’eau de surface, atteindre un bon état écologique et chimique de celles-ci au plus tard fin 2015, et à réduire la pollution due aux rejets et émission de substances dangereuses.

- Protéger, améliorer et restaurer l’état des masses d’eau souterraines, prévenir leur pollution, leur détérioration, et assurer un équilibre entre leurs captages et leur renouvellement.

- Préserver les zones protégées.

Ainsi une liste de substances prioritaires, inscrites à l’Annexe X de la directive, a été réalisée, ces substances représentant un danger pour la préservation de la qualité des masses d’eau. Cette liste implique pour les substances répertoriées, une réduction progressive des rejets, des émissions et des pertes de substances identifiées ainsi que l’arrêt ou suppression progressive des certaines substances. Seize pesticides figurent parmi les substances prioritaires : il s’agit d’herbicides (alachlore, atrazine, diuron, isoproturon, simazine, trifluraline), d’insecticides (chlorpyriphos, endosulfan, hexachlorocyclohexane dont l’isomère actif le lindane, chlorfenvinphos, aldrine, dieldrine, endrine, isodrine, DDT) et d’un fongicide (hexachlorobenzène). CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

II.4. Échantillonnage des pesticides.

Le retrait d’homologation de certaines substances actives sur le marché a amené une évolution des pratiques agricoles avec la substitution de produits et l’utilisation plus importante de molécules plus récentes. L’évaluation de l’état chimique des hydrosystèmes imposée par la mise en application de la Directive Cadre sur l’Eau nécessite en effet une estimation quantitative fiable de l’exposition des cours d’eau aux micropolluants. Il existe actuellement deux types d’échantillonnage des polluants qui sont l’échantillonnage « actif » qui consiste à effectuer des prélèvements ponctuels et l’échantillonnage « passif » (ou intégratif) qui lui tient compte du paramètre « temps » dans le prélèvement. L’échantillonnage ponctuel est, à l’heure actuelle la méthode la plus utilisée par les réseaux de surveillance, cependant il présente un inconvénient non négligeable qui est le manque de représentativité temporelle. Il a été démontré que, en ce qui concerne les micropolluants, il fallait intégrer la notion de flux de polluants et de variabilité de ces flux. En effet, selon les périodes de cultures agricoles, les conditions météorologiques, les quantités de polluants présents dans les milieux aquatiques vont varier. Ainsi, dans le cadre de cet étude, l’utilisation d’échantillonneur passif a été privilégié et plus particulièrement du Polar Organic Chemical Integrative Samplers (POCIS). C’est un échantillonneur permettant l’extraction en continu des molécules organiques ayant un log Kow inférieur à 4 (Alvarez et al, 2004). Il est immergé sur le site que l’on souhaite échantillonner sur une durée de quinze jours environ. Il est constitué de deux membranes en polyethersulfone qui renferment un adsorbant polymérique (type Oasis HLB). Le tout est maintenu par deux anneaux en acier inoxydable.

De retour au laboratoire le dispositif est démonté et la phase adsorbante qu’il contient est récupérée dans des cartouches qui sont ensuite éluées pour récupérer les molécules d’intérêt. Ces éluats sont ensuite analysés en HPLC/MS/MS (technique analytique communément utilisée en analyse de traces organiques pour sa sensibilité et sa sélectivité).

Figure 9. Photographie d’un POCIS (à gauche), schéma éclaté d’un POCIS (à droite), (Source Mazella et al, 2009).

Dans le cadre de ces études, les POCIS ont été immergés trois semaines à Saint-Ennemond afin de reproduire dans l’expérience une exposition en cocktail à des concentrations environnementales réalistes. L’analyse des extraits de POCIS (réalisé par les laboratoires de chimie des Cemagref de Bordeaux et Lyon) ont permis de mettre en évidence la présence de : Azoxystrobine, Diuron

Carbendazime, Fénitrothion Chlorpyriphos ethyl Flazasulfuron Chlorpyriphos methyl Norflurazon

Dichloroaniline, Norflurazon desméthyl 3-(3,4-dichlorophényl)-1 méthylurée Procymidone

Diflufénilcanil Spiroxamine Adsorbant Membrane de polyethersulfone Anneau de compression Adsorbant Membrane de polyethersulfone Anneau de compression Adsorbant Membrane de polyethersulfone Anneau de compression CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

III.

Site d’étude.

III.1. Le bassin versant de la Morcille.

Le site retenu est une rivière située dans le Sud-est de la France, dans la région du Beaujolais, la Morcille. C’est une rivière de premier ordre étendue sur 7 kms. Le bassin versant de la Morcille est situé au Nord du département du Rhône, dans le Haut-Beaujolais, entre la bordure orientale du Massif Central et l’extrémité Ouest de la vallée de la Saône. Il constitue un sous bassin de l’Ardières. L’Ardières est un affluent de la Saône dont le bassin versant est majoritairement occupé par des vignes (44%), des pâturages (36%), des zones boisées ou des forêts (20%) et il collecte les rejets de quatre stations d’épuration.

Figure 10. Schéma du bassin versant Ardières-Morcille. (www.graie.org/zabr/sites/site6.htm)

Le bassin versant de la Morcille (9,5 km²) est essentiellement forestier en amont et planté de vignes en aval. Les vignes recouvrent ainsi 72 % du bassin versant qui est dépourvu d’activités industrielles ou de rejets urbains majeurs. Le cours d’eau est donc soumis à une forte pression agricole, essentiellement exercé par les viticulteurs qui occupe plus de 80 % de la surface du bassin versant. Il subit donc les pollutions liées à l’activité viticole et aux traitements associés, notamment les épandages successifs de pesticides organiques et minéraux. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

III.2. Les deux stations étudiées.

Dans notre étude, deux points de prélèvements ont été échantillonnés, Saint-Joseph, situé à l’amont du bassin versant, et Saint-Ennemond, situé à l’aval de la Morcille, juste en

amont de sa confluence avec l’Ardières. D’après la figure 11, le pourcentage de vignes (1)

augmente considérablement entre l’amont et l’aval du bassin versant. La station Saint-Joseph situé à l’amont de la Morcille, est entourée majoritairement de forêt, et ainsi est moins impactée par les pollutions agricoles, avec des concentrations en pesticides en dessous des limites de quantification (Rabiet, 2007). Elle constitue une station référence d’étude. A contrario, la station Saint-Ennemond, située à l’aval de la Morcille, est fortement impactée par les pesticides, étant entourée de vignes mais recevant également les pollutions des vignes situées plus en amont. Des concentrations en pesticides totaux supérieures à 5µg/l ont été détectées à cette station (Rabiet, 2007). Il existe un point de prélèvement automatique des pesticides (« Préleveur automatique », figure 11) situé à la station intermédiaire Les Versauds. Ceci permet une quantification continue de la teneur en pesticides à cet endroit là situé entre Saint-Joseph et Saint-Ennemond. Sub watershed « St Joseph » 6,7%(1)_{// 0,2}(2)_{// 0,05} Sub watershed « St Ennemond » 79% // 97,1 // 6,9 Sub watershed « Versauds » 51,6% // 33,4 // 0 7 (1) Surface de vigne (2) _{Linéaire de fossés (kms)}

(3)_{Surface bâtie (ha)}

Préleveur automatique

Figure 11. Cartographie du bassin versant de la Morcille, (Source Montuelle, 2010). CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

Figure 12. Photographies des deux stations : Saint – Joseph (à gauche), Saint Ennemond (à droite), (Source, Nassiet, 2010).

IV.

Les études réalisées.

IV.1. Projet CONCERTO.

Le stage effectué s’inscrit dans un projet Concerto dont l’objectif est d’évaluer les effets de mélanges « réalistes » de pesticides sur les biofilms périphytiques. Ainsi, deux études ont été menées, au sein du Cemagref de Lyon :

- La première étude vise à étudier l’impact de ce mélange de pesticides à long terme sur les communautés du biofilm. Ainsi, une expérience d’une durée de quinze jours a été réalisée sur des biofilms prélevés à la Morcille, qui ont été soumis à des extraits de POCIS prélevé à la station Saint-Ennemond. Différents descripteurs seront étudiés afin d’évaluer les effets, qui seront décrits dans le chapitre 2.

- La seconde étude vise à évaluer le différentiel de réponse aux extraits de POCIS entre des communautés naturelles faiblement exposées dans le milieu (prélevées en amont de la Morcille) et des communautés pré-exposées aux pesticides (prélevées en aval de la Morcille).

IV.2. Bio-essai.

Suite à l’étude qui a été réalisée sur la Morcille, les analyses des POCIS ont révélé la présence majoritaire du norflurazon dans les eaux à l’aval de la rivière. Ce bio-essai vient donc en complément de cette étude, afin d’évaluer plus spécifiquement l’effet de ce pesticide sur le biofilm de la Morcille. Il s’agissait donc ici de mettre en culture un inoculum de biofilm ayant pour origine la station amont et effectuer un test écotoxicologique par le biais d’une gamme de concentrations, afin de déterminer une gamme d’effets et l’écotoxicité du polluant majoritaire. Le schéma ci-dessous reprend les conditions de mise en culture du biofilm.

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CHAPITRE 2 :

Matériel et Méthodes.

Ce chapitre présente, les différents matériels nécessaires lors des expériences réalisées, et les descripteurs étudiés. Dans un premier temps, l’élaboration de protocoles expérimentaux a permis la mise en place des manipulations. Dans chacune des études menées, une mise en culture d’inoculums de biofilms a été nécessaire afin d’obtenir une colonisation sur substrat artificiel (en l’occurrence des lames de microscope). Ainsi, une étape de mise en culture a été effectuée avant les expérimentations.

I.

Mise en culture du biofilm.

L’échantillonnage du biofilm a été fait sur des galets lotiques aux stations Saint-Joseph et Saint Ennemond de la Morcille. Lors de chaque prélèvement, le périphyton a été gratté à l’aide d’une lame de cutter et remis en suspension dans de l’eau minérale naturelle (Ondine,

eau de source achetée).

I.1. Projet Concerto.

Une fois prélevé, le biofilm a été introduit dans huit aquariums de 10 litres, à l’intérieur desquels préalablement 30 lames de microscopes (76×26 mm) avaient été placées. Ces lames ont servi de substrats pour le développement des communautés. L’eau utilisée pour les aquariums, provenait de la station Saint-Joseph, ainsi cela permettait de conserver la même eau que celle du milieu naturel. De plus, cette station est considérée comme station référence, car située en amont et peu impactée par les produits phytosanitaires. La mise en culture du biofilm a duré quinze jours du 14 Juin au 22 Juin.

I.2. Le bio-essai.

Dans le cadre du bio-essai, le protocole a été le même que précédemment. Une fois prélevé, le biofilm a été introduit dans un aquarium d’une capacité de 34 litres. À l’intérieur de cet aquarium, ont été placées selon un plan aléatoire d’expérience (réalisé à partir du

logiciel R) 30 lames de microscopes (76×26mm) qui ont servi de substrats pour le

développement des communautés. La colonisation a eu lieu du 03 Mai au 31 Mai, soit sur une durée 28 jours.

Lames

Aquarium

Bac de refroidissement

Pompe

Figure 13. Schématisation de la mise en culture sur substrats artificiels du biofilm. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

Figure 14. Photographie de l'aquarium utilisé pour le bio - essai, (Source Nassiet, 2010).

II.

Le milieu de culture.

II.1. Le projet Concerto.

Dans un premier temps, les lames colonisées ont été introduites dans des microcosmes (les dimensions des microcosmes sont présentés dans l’annexe 3). Au total, 30 lames ont été introduites dans chaque microcosme. Six microcosmes ont été utilisés pour l’étude des effets à long terme et trois microcosmes ont été nécessaires pour le PICT. Ces canaux ont été remplis d’eau synthétique, dont la composition est décrite dans le tableau ci-dessous, favorisant la croissance du biofilm durant toute l’expérimentation. Ainsi, chaque canal a été alimenté, par le biais d’un circuit fermé et d’une pompe, par l’eau synthétique circulant en continu, d’un volume de 4,5 litres à 9 litres chacun.

Au cours de l’expérience l’eau a été renouvelée une fois pour chaque microcosme.

Oligo-éléments (issus du milieu de culture

BG-11)

Nutriments Quantité Vitamines Quantité

H3BO3 KNO3 1,2 g Cobalamine (Vitamine B12) 13,7 mg MnCl2.4H2O KH2PO4 24 mg Biotine (Vitamine H) 13,7 mg ZnSO4.7H2O Na2O3Si. 9H2O 16,7 g Thiamine (Vitamine B1) 2,7 g Na2MoO4.2H2O MgSO4. 7H2O 2,8 g CuSO4.5H2O CaCl2. 2H2O 3,9 g Co(NO3)2.6H2O

Tableau 3. Éléments constitutifs de l’eau synthétique.

10 ml ont été introduits dans le volume final CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

II.2. Bio-essai

.

L’aquarium a été alimenté par l’eau provenant d’une rivière : la Gèze à Organ, station de référence suivie par le Cemagref (au niveau de la teneur en pesticides) et oligotrophe à sa source. Cette eau a été préalablement filtrée afin d’ôter les matières en suspension et éventuellement un ensemencent par des diatomées planctoniques de la Gèze (filtre Fisherbrand, 1µm). Trois renouvellements d’eau ont été réalisés durant la mise en culture, avec un volume de 17 litres à chaque fois.

Figure 15. Station Organ sur la rivière Gèze (Gers), (Source, Couprie, 2009).

Une première analyse d’eau a été effectuée afin de connaître les teneurs de certains éléments contenus dans l’eau (cf. Tableau 4). Les autres analyses réalisées sont en annexe 2. L’eau a été enrichie en silice et orthophosphate afin d’obtenir des concentrations non limitantes. En effet, ces deux éléments sont particulièrement importants pour le développement des diatomées. Le besoin en silice varie d’une espèce à l’autre mais également au sein d’une même espèce, selon son stade de développement. Ainsi, la disponibilité de la silice peut influencer grandement la diversité algale dans les rivières. Le phosphore est le nutriment le plus susceptible d’être limitant pour la croissance des algues. En effet, il est nécessaire à la synthèse des nucléotides, phospholipides, sucres phosphatés et autres composés phosphorilés intermédiaires (Wetzel et Likens, 2000). De ce fait, il est possible d’opposer les espèces hypereutrophes (présentes en eaux riche en nutriments) aux espèces oligotrophes.

Analyse Résultat Unité Limite de

quantification pH 7,36 Unité pH 1 Conductivité électrique (25°C) 138 µS/cm 5 Nitrate (en NO3) 8,83 mg/l 0,3 Nitrate (en N) 1,993871611 mg/l 0,07 Nitrite (en NO2) 0,004 mg/l 0,002 Nitrite (en N) 0,001217393 mg/l 0,002

Azote ammoniacal (en NH4) 0 mg/l 0,01

Azote Ammoniacal (en N) 0 mg/l 0,004

Azote minéral soluble (en N) 1,995089004 mg/l 0,08

Orthophosphate (en PO4) 0,0156273 mg/l 0,005

Orthophosphate (en P) 0,005099428 mg/l 0,002

Silice (en SiO2) 6,33765 mg/l 0,05

Tableau 4. Résultats de l’auto-analyseur (Laboratoire de Chimie du Cemagref).

Les conditions physico-chimiques reproduites à l’intérieur de l’aquarium ont été les plus proches de la réalité pour le bio - essai. Il a donc été décidé, de tenir compte de la station Les Versauds de la Morcille situé entre Saint-Joseph et Saint-Ennemond car cette station possède un préleveur automatique de données physico-chimiques.

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III.

Les conditions d’expérimentation.

III.1. Le courant.

III.1.1. Projet Concerto.

Chaque canal était alimenté par un circuit fermé régulé par une pompe (pompe Rena RFPN, modèle P600), avec un débit de 580 litres /heure. L’eau synthétique utilisée, a été, dans un premier temps, introduite dans un bécher servant de réservoir au circuit, les volumes des béchers variant de 3,5 litres pour les microcosmes dédiés au PICT à 5 litres pour les microcosmes de l’expérience sur les effets à long terme. Les pompes étaient ensuite maintenues dans ces béchers afin de permettre la circulation du courant. Le biofilm recevait donc une agitation comparable à celle du milieu naturel.

III.1.2. Bio-essai.

Une agitation a été créée par la mise en place d’une pompe (Aquariums systems New

A), avec un débit de 1200 litres/heure tournant en continu. Afin de soumettre tous les biofilms

à des conditions d’agitation comparables, une alternance du positionnement de la pompe a été effectuée à chaque changement d’eau. En effet, le développement du biofilm était légèrement différent sur les lames situées à l’opposé de la pompe, avec un développement supérieur pour celles-ci.

III.2.

Température de l’eau.

L’influence de la température de l’eau sur le peuplement diatomique est difficile à mettre en évidence car ce facteur n’est pas indépendant des autres paramètres environnementaux et peut influer sur ceux-ci. En effet, un changement de température modifie à la fois l’oxygénation, la viscosité de l’eau, la solubilité… C’est pourquoi elle devait être constamment surveillée.

Dans le projet Concerto et le bio-essai, la température au sein des microcosmes a du être régulée en raison des fortes températures relevées lors de l’expérimentation. Un système de refroidissement a été installé : les béchers ont été maintenus dans un bac rempli d’eau auquel a été rajoutée de la glace à plusieurs reprises pour le projet Concerto et un bac de refroidissement a ensuite été installé (cf. figure 27), relié à un refroidisseur permettant une circulation permanente de l’eau dans le bac et le maintien à une température de 15,7°C jusqu’à la fin de la culture pour le bio-essai. En effet, la température moyenne relevée, pour le mois de Juin 2009 à la station les Versauds, qui était de 15,7°C (±0,8), a servi de référence. Un changement d’eau du bac a également été effectué pendant l’expérimentation. De plus, dans le cadre du projet Concerto, un système de récupérateur de chaleur a été installé pour éviter que les néons ne surchauffent les microcosmes.

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III.3.

Éclairement.

Les microcosmes utilisés pour le projet Concerto et le bio-essai ont été soumis à une photopériode de 10 heures d’éclairement et 14 heures d’obscurité. Sur ce cycle 10/14, la période d’éclairement s’étalait de 8 heures à 18 heures et la période d’obscurité s’étalait de 18 heures à 8 heures. Les microcosmes du projet, ont été placés dans un laboratoire sur deux néons assurant une intensité lumineuse d’environ 12 000 lux. L’aquarium du bio-essai a été disposé dans une enceinte fermée par un rideau noir et éclairé par deux rangées de néons disposées parallèlement à l’écoulement des pompes. Le réglage de la photopériode a été assuré par une minuterie et l’intensité lumineuse incidente était de 150 µmol/m/s.

III.4. pH.

Le pH est également un paramètre déterminant pour la distribution des diatomées par ses effets induits sur la solubilité de différentes substances.

Concernant les études relatives au projet Concerto, aucune valeur de pH n’a servi de référence. Une surveillance régulière a été effectuée tout au long de l’expérimentation afin d’éviter de trop grandes variations.

Le pH, à la station les Versauds, avait pour valeur en moyenne 7 (±0,1). Lors de l’introduction de silice, le pH a légèrement augmenté et un ajout d’acide chlorhydrique a été nécessaire pour maintenir cette valeur.

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