Etude moléculaire de la résistance bactérienne plasmidique

يملعلا ثحبلاو يلاعلا ميلعتلا ةرازو

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique ةعماج

8 يام 1945 ةملاق

Université 8 Mai 1945 Guelma

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Sciences de la terre et de l’Univers

Mémoire En Vue de l’Obtention du Diplôme de Master

Domaine: science de la nature et la vie

Spécialité/Option: biologie moléculaire de procaryotes Département: biologie

Etude moléculaire de la résistance bactérienne plasmidique

Présenté par : Ben kemouche Houria Boukharouba Asma Boussaha Nour-Elhouda

Devant la commission composée de :

Ben Benbelkacem S. Président Université de Guelma

Khallef M. Encadreur Université de Guelma

Grara N. Examinateur Université de Guelma

Drif F. Membre Université de Guelma

Khanaka K. Membre Université de Guelma

Athamniya M . Membre Université de Guelma

Nous remercions ALLAH tout puissant qui nous a donné le courage et la volonté et de nous avoir bénie pour la réalisation de ce travail.

Nous tenons particulièrement à remercier notre promotrice et directrice de mémoire madame« Khallef M» maitre de conférence à l'université 8 mais 1945 de Guelma pour avoir accepté de diriger ce travail,

pour ses conseils, son aide, son encouragement et ses suggestions sur la rédaction de ce mémoire ainsi que sa confiance au long de cette étude.

Nous remercions également :

Madame «Benbelkacem S» Maitre assistante à l’Université 8 mais 1945 de Guelma pour l’honneur qu’elle nous a fait en présidant ce jury.

Qu’elle trouve ici l’expression de notre profond respect.

Nous adressons nos sincères remerciements à Mme «Grara N» Maitre conférence à l’Université 8 mais 1945 de Guelma pour avoir accepté

d’examiner et juger ce travail

Nos remerciements s’adressent également à

Les membres de commission *Mme Khanaka k* et *Mme Drif F* et monsieur *Athamnia M* participés à ce jury.

Nous remercions également tous les personnes de laboratoire pédagogique et la bibliothèque de l'université 8 mais 1945 de Guelma pour

ces accueils et ces contributions dans ce travail.

*Merci*

À ceux et celles qui nous ont aidé d’une façon ou d’une autre, de prés ou de loin dans notre travail, nous les remercions du fond du cœur.

Je dédie cet humble travail A Mes très chers parents Abd Allah et Fouzia

Pour leur amoure, leurs encouragements et soutien sans faille, Je les remercie de m’avoir accompagnée tout au long de mon parcours vous m'avez transmis l'amour de la science et le savoir.

A ma tendre, gentille et adorable sœur Soumia . A ma poupé ma cristal Malek

A mes fleurs Ritel et Allaa.

A ma chère amie Amina et son fil Mouhamed amine Aux perles de mon cœur qui je l’aime beacoup khaoula et Nour

(Asma )

Je dédie cet humble travail

A Mes très chers parents Rachid et Tounes

Pour leur amoure, leurs encouragements et soutien sans faille, Je les remercie de m’avoir accompagnée tout au long de mon parcours vous m'avez transmis l'amour de la science et le savoir.

A mes chers frères Issam et Aymen , ma fierté dans cette vie.

A mes chères cousines Zineb, Aicha, Hadjer , Iman, Khouloud , Fatima et Mouna en témoignage de mes plus profondes amitiés.

A mes poupées mes fleurs Anfal, hadil, et Nour-Hane A ma cousin Ahmed et le petit garcon ma chere Abd-anour

A mes chères amies Nadjet, Loubna, Faiza, Kanza, Akila, Amina et son fil Mouhamed amine

Aux perles de mon cœur qui je l’aime beacoup Asma, Nour et ma cristal ma sœur ma moitie Nabila.

Houria (khaoula)

Je dédie cet humble travail A Mes très chers parents Salah et Louiza

Pour leur amoure, leurs encouragements et soutien sans faille, Je les remercie de m’avoir accompagnée tout au long de mon parcours vous m'avez transmis l'amour de la science et le savoir.

A ma cher frère Amar, ma fierté dans cette vie.

A ma tendre, gentille et adorable sœur mon amie Loubna .

A mes chères cousines Warda , Mimiya , Najiba , Hayat , Zahra, Nada, Meriem , Leila, Afaf, Besma, Ismahan, Amira, Raja, Amal, Arij, Ritaj, Ahmed en témoignage de mes plus profondes amitiés.

A ma chère amie , Amina et son fils Mouhamed amine

Aux perles de mon cœur qui je l’aime beacoup Asma, Khaoula et ma poupé Hayet

( Nour-elhouda)

R : résistance S : sensible

ATB : antibiotique

Facteur F : facteur de fertilité Facteur R : facteur de résistance Facteur col : facteur de colicinogéne Pc : promoteur

Tn : transposon Int : intégrons

I.M : intégrons de multirésistance S.I : super intégrons

Int-Tn : integrase Xis-Tn : exicisionase

ADN : acide désoxyribonucléique

AMPC : Adénosine monophosphate cyclique Hfr : haut fréquence de recombinaison

Table des matières

Liste des abréviations Liste des figures

Liste des tableaux

Introduction ...

1

Partie I: Synthèse Bibliographique Chapitre 1 : Biologie moléculaire des bactéries nosocomiales I. Infection nosocomiale………

……..2

1. Définition ... 2

2. Agents responsables d’infection nosocomial ... 2

II. Résistance bactérienne aux antibiotiques ...

3

1. Types de résistance ... 3

1.1. Résistance naturelle... 3

1.2. Résistance acquise ... 4

2. Mécanismes de la résistance ... 4

2.1. Inhibition enzymatique ... 4

2.2. Altération de la cible ... 4

2.3. Pompes à efflux ... 5

III. Support génétique de la résistance ...

5

1. Plasmides ... 5

1.1. Définition ... 5

1.3. Classifications des plasmides ... 6

2. Intégrons ... 10

2.1. Définition………....………10

2.2. Types de l’intégrons ... 11

2.3. Cassettes ... 12

2.3.1. Définition ... 12

2.3.2. Structure des cassettes ... 13

2.4. Mécanisme d’intégration ... 13

3. Transposons ... 14

3.1. Définition……….………..….14

3.2. Types des transposons ... 14

3.2.1. Séquences d’insertion (IS) ... 14

3.2.2. Transposons composites………..15

3.2.3. Transposons non composites (Tn3) ... 15

3.2.4. Transposons conjugatifs ... 16

3.3. Mécanisme de la transposition ... 16

3.3.1. Transposition conservative ... 16

3.3.2. Transposition réplicative ... 17

Chapitre 2: le transfert génétique bactérien I. Transformation ... 19

1. Généralité ... 19

2.Définition………...……….19

3. Etat de compétence : ... 20

4. ADN transformant ... 21

II. Conjugaison ... 22

1. Généralité ... 22

2. Définition ... 24

3. Modes de transfert par conjugaison chez les Gram^-……….…….24

4. Conjugaison chez les bactéries Gram + ... 26

III. Transduction ... 27

1. Généralité ... 27

2. Définition ... 28

3.Morphologie de phage ... 28

4. Types de transduction ... 30

4.1. Transduction généralisée... 30

4.2. Transduction spécialisée ... 31

4. 3. Conversion lysogénique ... 32

Partie expérimentale Matériel et méthodes I . Matériel biologique ... 33

II.

Culture des bactéries ... 33

III. Extraction de l’ADN plasmidique ... 36

IV.

Spectrophotométrie ... 39

V. Electrophorèse ... 40

Résultats et discussion

I. Résultats ... 43

2. Concentration d’ADN plasmidique ... 43

3. Electrophorèse ... 47

II.

Discussion ...

49

Conclusion

………...……….………….53

Résumé Abstract صخلم

Références bibliographiques

Figure Titre Page

1

L’incompatibilité du plasmide

7

2

La structure du plasmide F

8

3

Plasmide multirésistance (plasmide R)

9

4

Structure d’intégrons

11

5

Structure de cassette

13

6

Intégration des cassettes dans des intégrons

14

7

Structure des transposons

16

8

La transposition conservative

17

9

La transposition réplicative

18

10

La découverte de la transformation bactérienne

19

11

La transformation par l’ADN

22

12

La preuve de la conjugaison bactérienne

23

13

L’expérience du tube en U

24

14

Le transfert par la conjugaison.

26

15

Comparaison entre la conjugaison chez les bactéries gram positif et les bactéries gram négatif

27

16

Structure du phage

29

17

Cycle lysogénique d’un bactériophage

31

18

Le cycle lytique d’un bactériophage

32

19

L’ensemencement des souches sur des milieux d’isolement spécifiques.

33

20

Les étapes de l’extraction de l’ADN plasmidique

38

21

Les étapes d’électrophorèse

42

22

Précipité d’ADN plasmidique.

43

23

Les concentrations en ADN des souches utilisées

46

24

Profil électrophorétique de l’ADN plasmidique.

48

Liste des tableaux

Tableau Titre Page

1

Principaux types des plasmides.

10

2

Quelque exemple de bactériophage

29

3

Les caractères génétiques des souches utilisées.

34

3

Les caractères génétiques des souches utilisées (suite)

35 4

Les valeurs d’absorbance d’ADN plasmidique extrait dans l’eau

distillée stérile.

44

Introduction

Introduction

L’émergence au sein des structures sanitaires des germes résistants aux antibiotiques suite à l’usage abusif de ces derniers et La progression des résistances bactériennes aux antibiotiques confronte les médecins à des infections difficiles à traiter et pose un problème de santé publique. Les bactéries résistantes sont souvent la cause des infections nosocomiales aggravant le pronostic des malades, prolongeant leur hospitalisation et augmentant les coûts des traitements (Billy, 2002).

Cette résistance aux antibiotiques est codée par des gènes qui peuvent être porté, soit sur le chromosome bactérien, soit sur des éléments extrachromosomiques (plasmide), ces gènes peuvent aussi se transposer, et s’échanger entre les différents réplicons sur le chromosome et les plasmides (Guillot, 2002).

Le problème de l’émergence des bactéries pathogènes résultant par la capacité des bactéries à échanger du matériel génétique par trois mécanismes : la transformation, la conjugaison et la transduction dans des conditions de pressions antibiotiques, implique un programme de surveillance et de suivi (Billy, 2002).

De ce fait l’objectif de ce travail était de chercher et de mettre en évidence la détection de la résistance d’origine plasmidique aux antibiotiques des bactéries responsable d’infections nosocomiales.

Notre étude comporte deux grandes parties :

Partie théorique comporte deux chapitres en relation avec les infections nosocomiales et le support génétique de la résistance bactérienne plasmidique et leur transfert du matériel génétique.

Partie expérimentale qui consiste à extraire l’ADN plasmidique des souches bactériennes résistantes à un ou plusieurs antibiotiques, ensuite nous vérifions la quantité d’ADN plasmidique par le spectrophotomètre et leur existence dans un profil électrophorétique.

Partie I:

Synthèse Bibliographique

Chapitre 1

Biologie moléculaire des bactéries

nosocomiales

I. Infection nosocomiale 1. Définition

L’infection nosocomiale est toute infection qui survient chez un patient dans un de loi supérieurs ou égale 48h après son admission à l’hôpital, compliquant sa pathologie initiale (les infections que le patient apporte à l’hôpital, et qui s’y manifestent cliniquement, ne sont pas considérer comme des infections nosocomiales). Les infections nosocomiales, avant l’ère des antibiotiques, étaient si fréquentes et présentaient une telle létalité que l’on peut se demander aujourd’hui comment on a pu convaincre les patients d’aller à l’hôpital à l’époque.

Avec l’instauration des mesures d’hygiène, leur nombre a diminué et, avec l’introduction des antibiotiques, leur létalité s’est fortement réduite. Mais elles sont toujours là, pouvant devenir dangereuses pour le patient et compromettre les plus belles réussites médicales. Les infections nosocomiales peuvent se développer à partir de la flore d’un patient (infections endogènes) ou à partir de sources extérieures (infections exogènes). Les infections endogènes sont les plus fréquentes, dans cette situation, le patient peut apporter l’agent infectieux à l’hôpital. Mais le plus souvent, la peau et les muqueuses du patient sont colonisées en 1-3 jours par des bactéries hospitalières souvent multirésistantes, qui prennent la place de la flore propre du patient. Ainsi beaucoup des infections endogènes sont causées par la flore spécifique hospitalière. La source d’infection des infections exogènes est principalement le personnel soignant, la plupart du temps, les germes transmis par les mains lors des actes médicaux et de soin. Plus rarement, le soignant est lui-même infecté ou colonisé par la flore hospitalière. Des causes importantes d’infection nosocomiale sont aussi présentées par l’environnement (eau, nutrition, poussière, air) et par les actes médicotechniques et de diagnostique invasifs qui permettent aux agents infectieux de trouver une porte d’entrée dans l’organisme (kayser et al., 2008).

2. Agents responsables d’infection nosocomiale

 Bactéries

Elles sont au premier plan en tant qu’agents des infections nosocomiales. Il s’agit souvent de bactéries facultativement pathogènes comme staphylococcus aureus. Mais on trouve plus souvent des bactéries opportunistes : entérobactéries, staphylococcus epidermidis, psodomonas aeruginosa., stenotrophomonas maltophilia., burkholderia cepacia , acinetobacter, entérocoque, etc, qui présentent fréquemment une résistante vis-à-vis de

nombreux antibiotiques. Elles sont implantées dans les hôpitaux comme « flore hospitalière ».

Le type de résistance de ces bactéries reflète, pour les différents hôpitaux (kayser et al., 2008 ; Nauciel et vildé, 2005).

 Virus

Les virus sont aussi des agents d’infections nosocomiales : le VIH agent du sida ,le virus des hépatites B et C ,tout transmis par le sang ; les virus donnant des atteintes respiratoires : virus grippal; VRS (virus respiratoire syncytial) actif chez les jeunes enfants ; coronavirus humain, un des agents du rhume; métapneumovirus humain, un des agents de la broncho-alvéolite du nourrisson ; un autre coronavirus, donnant des pneumopathies sévères (SRAS), virus agents de gastro-entérites (rotavirus chez l’enfant, norovirus à tous les âges) et d’autres (adénovirus et conjonctivite) (Briand, 2012).

 Champignons

Les infections nosocomiales à champignons ont augmenté au cours de ces dernières années.

Elles apparaissent fréquemment chez les patients immunodéprimés (kayser et al., 2008).

II.

Résistance bactérienne aux antibiotiques

La résistance bactérienne à un antibiotique est d’origine génétique. Les gènes de résistance se trouvent soit dans le chromosome (résistance chromosomique), soit dans un élément mobile, comme les plasmides, les éléments transposables ou les intégrons (résistance extra chromosomique). La résistance peut être soit naturelle, soit acquise.

1. Types de résistance

1.1 . Résistance naturelle (ou intrinsèque)

Les gènes de résistance font partie du patrimoine génétique de la bactérie. La résistance naturelle est un caractère présent chez toutes les souches appartenant à la même espèce. Ce type de résistance est détecté dès les premières études réalisées sur l’antibiotique afin de déterminer son activité et contribue à définir son spectre antibactérien. Cette résistance peut être due à l’inaccessibilité de la cible pour l’antibiotique, à une faible affinité de la cible pour l’antibiotique ou encore à l’absence de la cible. Par exemple, la résistance des entérobactéries et du Pseudomonas aux macrolides ou des bactéries à gram négatif à la vancomycine est naturelle. La résistance bactérienne naturelle est permanente et d’origine chromosomique.

La résistance naturelle est stable, transmise à la descendance (transmission verticale) lors de la division cellulaire (Thiriet, 2010).

1.2. Résistance acquise

Les bactéries peuvent développer la résistance à un antibiotique préalablement sensible, ce qui implique des changements génétiques. Cette résistance est souvent instable (Thiriet, 2010).

2. Mécanismes de la résistance 2.1. Inhibition enzymatique

Le micro-organisme produit une enzyme qui détruit ou inactive l’antibiotique. La production enzymatique peut être induite par un facteur externe (un autre antibiotique) ou constante (non affectée par stimuli externes). On appelle inductible une résistance qui se produit à la suite d’une exposition à un agent d’une classe pharmacologique donnée et constitutive lorsque les gènes à l’origine de la résistance s’expriment en permanence, même en l’absence de tout antibiotique (Carle, 2009).

2.2. Altération de la cible

Cette modification a pour effet de diminuer l’affinité de l’antibiotique pour sa cible, compte du caractère essentiel des fonctions cibles des antibiotiques, la modification de la cible se doit de conserver un phénotype viable à l’organisme (Paolozzi et Liébart, 2015).

La résistance aux ß-lactames s’obtient par mutation des PBP (protéine liant la pénicilline).

Leur conférant une affinité diminuée pour l’antibiotique. La résistance à la vancomycine, qui agit sur l’incorporation des résidus D-ala-D-lac. Dans les précurseurs du peptidoglycane s’obtient par remplacement de ce peptide par du D-ala-D-lac (Paolozzi et Liébart, 2015).

Dans le cas des antibiotiques affectant la synthése protéique, les mutations conférant la résistance aux macrolides affectent l’ARN 23S de la sous-unité 50S : celles concernant les aminoglycisides affectent l’ARN 16S de la sous-unité la transcription (tel la rifampicine). Les mutants résistants résultent d’une mutation du géne rpoB, codant la sous-unité ß de l’ARN plymérase (Paolozzi et Liébart, 2015).

La cible classique des antibiotiques affectant la synthése de l’ADN est la gyrase, constituée de deux sous-unité, GyrB, sensible à certaines dérivés de la coumarine tels la novobiocine, et

GyrA, sensible aux fluoroquinolones telles la ciprofloxacine. Les résistances sont dues à des mutations affectant la sous-unité correspondante de l’ADN gyrase (Paolozzi et Liébart, 2015).

2. 3. Pompes (transporteurs) à efflux

L’antibiotique ne peut pas atteindre son site d’action par pompage actif de l’antibiotique à l’extérieur de la bactérie (efflux). Les transporteurs d’efflux de plusieurs médicaments sont des composants normaux des cellules bactériennes et contribuent pour une large part à la résistance intrinsèque des bactéries à de nombreux agents antibactériens. Ces pompes ont besoin d’énergie. L’exposition aux antibiotiques favorise une surexpression par mutation de transporteurs, entraînant une hausse de la résistance bactérienne. Il est également possible qu’une résistance par efflux apparaisse à cause de l’exposition à un antibiotique d’une autre classe. Ainsi, on sait que la ciprofloxacine peut favoriser l’émergence d’une résistance à la céphalosporine par la voie de ce mécanisme. Parmi les bactéries d’importance clinique munies d’une pompe à efflux comme mécanisme de résistance, on trouve l’Escherichia coli et le Shigella, le Staphylococce aureus peut également comporter une pompe à efflux lui permettant d’acquérir une résistance aux macrolides (Carle, 2009).

III.

Support génétique de la résistance

1. Plasmides 1.1. Définition

Le terme plasmide fut introduit par biologiste moléculaire américain Joshua Lederberg en 1952.

Les plasmides sont des fragments d’ADN bicaténaire extrachromosomique de taille variable (1 pour 1000 à 1 pour 100 de la taille du chromosome). Caractérises par leur structure circulaire surenroulée, peuvent être plusieurs mais différents dans une même bactérie .Avec taille différente (3. 10⁶ à 4,5.10⁶ pb), et réplication autonomes, Localises dans le cytoplasme (Boulahbal, 2002).

Les plasmides de grande taille sont présents en règle générale dans la cellule sous forme d’une à deux copies, et le petite taille sous 10 à 100 copies. Les plasmides ne contiennent pas de essentiels pour la survie de la bactérie, beaucoup des plasmides portent des gènes codant pour des propriétés phénotypiques de leur cellule hôte (kayser et al., 2008).

1.2. Réplication de plasmide

La réplication de l'ADN plasmidique fait largement appel à l'équipement enzymatique de la bactérie hôte. En général, les plasmides contiennent une ou plusieurs origines (ori) de réplication et un ou plusieurs éléments régulateurs, situés dans un fragment d'ADN ne dépassant pas 4 kb. Souvent, l'initiation de la réplication nécessite la synthèse d'une protéine appelée Rep codée par le plasmide, et qui agit d'une manière spécifique sur l'origine ori, avec ou sans intervention de la protéine DnaA qui permet l'initiation de la réplication de l'ADN chromosomique. Le nombre de copies d'un plasmide varie de 1 à quelques dizaines par bactérie, souvent en relation avec leur taille. Le contrôle de la réplication se fait essentiellement par deux types de mécanismes. L'un utilise une série des séquences répétées, appelées itérons, localisées dans l'ori et sont capables d'interagir avec la protéine de réplication. Le 2ème mécanisme implique la synthèse de petits ARN anti-sens qui s'hybrident d'une façon complémentaire aux transcrits responsables du processus de l'initiation (Yassine, 2015).

1.3. Classifications des plasmides

 Groupes d’incompatibilités

Le phénomène d’incompatibilité des plasmides est lié à la régulation du nombre de copies des plasmides et à leur ségrégation. Un groupe d’incompatibilité est défini comme un ensemble de plasmides dans les membres sont incapables de coexister dans la même cellule bactérienne.

La raison de cette incompatibilité est qu’un ne peut les différencier les uns des autre à des étapes essentielles au maintien du plasmide. Comme la réplication de l’ADN ou la ségrégation. Dans le modèle du contrôle négatif de l’incompatibilité des plasmides, on suppose que le contrôle du nombre de copies est assuré par la synthèse d’un répresseur qui mesure la concentration de l’origine de réplication (c’est en fait le même modèle que celui de la titration pour la régulation de la réplication du chromosome bactérien). L’introduction de nouvelle origine sous la forme d’un deuxième plasmide du même groupe de compatibilité reproduit le résultat de la réplication du plasmide de résident deux origines sont maintenant présentés, donc toute réplication ultérieure est deux plasmides dans des cellules différentes pour retrouver le nombre de copies correct avant l’étape de réplication (Figure 1) (Benjamin, 1999).

Figure 1: l’incompatibilité du plasmide (Benjamin, 1999).

 Facteur F

Le plasmide F chez Escherichia coli est le premier plasmide découvert par Hayes qui commande les gènes tra (figure 2) qui sont responsables de la formation des pilis sexuels des cellules F et de la procédure de transfert (Gaudriault et Vincent, 2009). Le transfert du plasmide conjugatif par les étapes de conjugaison bactérienne grâce à des gènes occasionnelle du facteur F dans le chromosome, celui-ci acquiert des propriétés de conjugaison de ce facteur. Du fait de cette intégration constituée un élément conjugatif géant qui, par le même mécanisme, permet le transfert des gènes chromosomique. les cellules qui possèdent un facteur F intègrent pour cette raison, dénommées cellules HFR (Tableau 1) (Kayser et al.,2008).

Figure 2: la structure de plasmide F (Madigan et al., 2012).

 Facteur R

Le premier plasmide baptisé RTF (résistance transfer factor) puis R. conférant la résistance à plusieurs antibiotique, a été isolé au début des années 1960, à partir d’une souche de shigella multirésistante; sa structure révéle deux régions bien distinctes: l’une impliquée dans le transfert conjugatif du plasmide, l’autre, conférant la résistance aux antibiotique (figure 3), il s’avéré transférable aussi bien aux bactéries Gram- qu’aux bactéries Gram+. Il a pu être caractérisé chez des souches issues de collections réalisées au début des années 1930, c’est à dire dans la période pré thérapie par antibiotique (Paolozzi et Liébarta, 2015).

Ce plasmide a été le premier d’une longue série de plasmides un phénotype de résistance multiple aux antibiotiques, dits à large spectre d’hôtes, et pouvant donc se maintenir et s’exprimer de façon stable dans de nombreuses espèces bactériennes tant Gram+ que Gram- (Tableau 1) (Paolozzi et Liébarta, 2015).

Figure 3 : plasmide multi résistance (plasmide R) (Madigan et al., 2012).

 Facteur métabolique

Codent pour la Fermentation de certaine sucres, et l’utilisation de certains acides aminée (Boulahbal, 2002). Permettent la transformation d’éléments inhabituels du milieu extérieur comme des solvants organiques (toluéne, xyléne, octane) ou l’acide salicylique (Tableau 1) (Carip, 2008).

 Facteur de virulence

Ces plasmides sont responsables de la transmission de caractères pathogènes comme par exemple pour les Escherichia coli entérotoxigènes (Tableau 1) (Carip, 2008).

 Facteur Colicinogéne

Le facteur col est un plasmide codant pour la synthèse de colicines (substances élaborées par la bactérie et douées d’un effet l’éthal sur certaines bactéries) (Tableau1) (Boulahbal, 2002).

Tableau 1 : Principaux types de plasmides (Meyer et al.,2010).

2. Intégrons 2.1. Définition

Les intégrons sont des éléments génétiques retrouvés exclusivement chez les bactéries ils constituent un système naturel de capture, d’expression et de dissémination des transposons.

C’est donc une structure qui permet à des gènes de s’intégrer et de s’exprimer. Les intégrons sont définis comme l’association entre : un gène intI codant une protéine appelée intégrase.

Cette enzyme appartient à la famille des recombinases spécifique de site, elle catalyse l’insertion et l’excision de gènes contenus dans des éléments nommés cassettes de gènes un site attI, adjacent au gène intI, il contient le point d’insertion des gènes de cassettes Un

Types Exemple Taille

approximative (Kb)

Hôtes

Facteur de fertilité Facteur F 95-100 Escherichia coli

citrobacter

Plasmides R RP₄

R₁ pSH₆

54 80 21

Pseudomonase Gram^-

Staphylocoque aureus

Plasmides col col E₁ col E₂

9 E.coli

Shigella

Plasmides de

virulence

Ent (p307) Col V-K₃₀

83 2

E.coli E.coli Plasmides

métaboliques

pZa 10 CAM SAL TOL

56 230 56 75

Staphylocoque aureus Pseudomonase

Pseudomonase p.putida

promoteur Pc, orienté dans le sens inverse du gène de l’intègrase, qui permet la transcription des gènes de cassettes (figure 4). L’ensemble de ces trois éléments constitue une région bien conservée en 5’, commune à tous les intégrons. Dans la très grande majorité des cas, elle est suivie en 3’ d’un réseau de cassettes en tandem orientés dans le sens inverse du gène intI cette partie en 3’ est variable d’un intégrons à un autre (Ploy et Denis, 2000).

Figure 4 : structure d’intégrons (Collis et Hall, 1994).

2.2. Types de l’intégrons

On distingue deux grands types d’intégrons:

- Les intégrons de multirésistance (IM) : sont portés par des plasmides et/ou des transposons; ils sont connus pour leur rôle majeur dans la dissémination des gènes de résistances aux antibiotiques (Boudjemaa, 2015).

- Les super-intégrons (SI) : sont strictement chromosomiques et jouent un rôle plus large en tant que réservoir de gènes à haute valeur adaptative.

Des dizaines de classes d’intégrons ont été définies sur la base de la séquence de leurs intégrases IntI. La majorité des classes correspondent à des super-intégrons et cinq à des intégrons de multirésistance. Les IM 1 à 3 sont les classes d’intégrons les plus prévalentes en microbiologie clinique et les mieux caractérisées (Boudjemaa, 2015).

2.3. Cassettes 2.3.1. Définition

Les cassettes de gènes sont des éléments mobiles non-réplicatifs qui existent sous une forme libre circulaire et sous forme linéaire, intégrée au sein d’un intégron le plus souvent.

Elles sont constituées d’une (ou plus rarement, de plusieurs) séquence codante et d’un site de recombinaison attC. Les fonctions des gènes portés par les cassettes correspondent à des résistances vis-à-vis de molécules antimicrobiennes (antibiotique, antiseptiques) et plus généralement de gènes à haute valeur adaptative. En revanche, les gènes de ces cassettes sont dépourvus de promoteur (Belouni et al., 2009).

2.3.2. Structure des cassettes

les cassettes possèdent une organisation commune (figure 5). Elles contiennent un gène flanqué son extrémité 3’ d’une séquence palindromique, le site attC. Il s’agit d’un site spécifique de recombinaison reconnu par l’intégrase, et souvent désigné «élément 59pb » car les premiers sites attC décrits avaient une taille de 59pb. Il est constitué de plusieurs séquences relativement conservées, inversées et répétées, capables de réaliser une structure cruciforme. En fait, les séquences conservées recouvrent surtout les 20 premières et les 20 dernières bases, et encadrent une région de séquence et de longueur variables. Ainsi, certains sites attC sont formés de 141 paires de bases, d’où l’ambiguïté de la terminologie « élément 59-pb ». On trouve aux deux extrémités de chaque site attC deux séquences inversées et répétées de 7 paires de bases désignées core et core inverse. Le core (GTTRRRY; R: purine ; Y: pyrimidine) est localisé à l’extrémité 3’ du site attC et le core inverse, de séquence complémentaire RYYYAAC, à l’extrémité 5’ (Ploy et Denis, 2000).

Figure 5 : structure de cassette (Ploy et Denis, 2000).

2.4. Mécanisme de l’intégration

Les cassettes sont intégrées seules ou en tandem entre les deux régions conservées de l’intégron. Lorsqu’elles sont intégrées, les cassettes sont sous forme linéaire, mais elles peuvent aussi exister sous forme libre, circulaire, après leur excision (figure 6). L’intégrase IntI1 catalyse en effet aussi bien l’intégration que l’excision des cassettes, ces mouvements (qui ne font pas intervenir la protéine RecA) s’effectuant par recombinaison entre deux sites spécifiques reconnus par l’intégrases. Il s’agit des sites attC situés à l’extrémité 3’ de chaque cassette, mais aussi d’un autre site, le site attI, localisé à la jonction de la région 5’ conservée de l’intégron et de la première cassette (figure 6). Les évènements de recombinaison peuvent impliquer 2 sites attC ou un site attC et un site attI. L’intégration des cassettes se fait préférentiellement par recombinaison entre le site attI de l’intégron et le site attC de la cassette, tandis que leur excision se fait plutôt par recombinaison entre deux sites attC. Le site attI contient la même séquence core, GTTRRRY, que le site attC mais ne contient pas de séquence complémentaire RYYYAAC (core inverse) ni de séquence inversée et répétée. Les sites attI des trois classes d’intégrons sont très différents hormis la séquence GTTRRRY et la présence de nombreuses bases A localisées dans la région 5’. L’activité de ce site ne semble donc pas liée à une séquence particulière ni à une structure secondaire, contrairement aux sites de recombinaison habituellement reconnus par les intégrases dont les sites attC. Cependant, une région minimale de 33 paires de bases paraît nécessaire à l’activité du site attI des intégrons de classe1. Exceptionnellement, l’événement de recombinaison peut impliquer un site spécifique et un site non spécifique, appelé site secondaire dont la séquence, généralement GWTMW (W:T/A; M:A/C), est semblable à celle du core GTTRRRY. L’intégration est alors stable car l’excision d’une cassette au niveau d’un site secondaire est peu probable (Ploy et Denis, 2000).

Figure 6 : Intégration des cassettes dans un intégrons (Ploy et Denis, 2000).

3. Transposons

3.1. Définition

Les éléments transposables ou transposons constituent une autre discrète du génome qui sont mobiles capables de se transporter elles-mêmes à d’autres endroits du génome. La caractéristique d’un transposon est de ne pas utiliser une forme indépendante de l’élément (comme un ADN phagique ou plasmidique), mais ces éléments peuvent, donc, se transférer d’une localisation chromosomique à une autre, d’un chromosome à un plasmide (Prieur et al., 2015).

3.2. Types des transposons 3.2.1. Séquences d’insertion (IS)

Les IS sont les éléments transposables les plus simples. Elles ne contiennent que les informations génétiques nécessaires à leur transposition et sont donc considérées comme phénotypiquement cryptiques. De petite taille (généralement inférieure à 2 500 pb), elles sont le plus souvent bordées par des séquences IR (inversement répétées) de 20 à 40 pb qui sont reconnues par la machinerie de transposition. Plus de 500 IS ont été identifiées dans 73 genres

chromosomes procaryotes partiellement ou complètement séquencés et sur de nombreux plasmides et bactériophages. Seul le chromosome séquencé de Bacillus subtilis n’a révélé aucune IS, sans qu’on sache s’il s’agit d’un cas particulier inhérent à la souche utilisée ou

d’une caractéristique générale de l’espèce (figure 7a) (Merlin et Toussaint, 1999).

3.2.2. Transposons composites

Les transposons composites contiennent différents gènes situés entre deux éléments IS quasiment identiques orientés en sens inverse (figure 7b) et qui de ce fait, forment une répétition inversée. La transposase pour catalyser le déplacement du transposon entier. Tn10 est un exemple de transposon composite ;Tn10 porte un gène qui conféré la résistance à l’antibiotique tétracycline et est flanqué de deux éléments IS10 orientés en sens inverse. Les éléments IS appartenant aux transposons composites sont incapables de se transposer seuls en raison des mutations qu’ils portent dans leurs répétitions inversées (Vivcent, 2007).

3.2.3. Transposons non composites (Tn3)

Les transposons non composites n’ont pas d’IS à leurs extrémités mais deux séquences terminales IR (de 35 à 48 Pb) nécessaires à la reconnaissance par la transposase. leur mode de transposition implique une transposase ( TnpA) mais également une autre enzyme , la résolvase (TnpR) qui permettra de terminer la réaction en catalysant une étape de recombinaison à un site spécifique (res) porté par le transposon ( résolution de coïntégrat ) . Leur transposition est réplicative et conduit à une duplication de 5 Pb du site cible .En plus des protéines essentielles à leur dissémination, ces transposons codent des gènes de résistance aux antibiotiques ou aux métaux lourds (figure 7c)(Prieur et al., 2015).

Figure 7: structure des transposons, a : séquence d’insertion, b : transposon (Tn), c : transposon non composite (schaehter et al., 1999).

3.2.4. Transposons conjugatifs

Les transposons conjugatifs portent des gènes impliqués dans la coupure et l’échange de brins d’ADN, la conjugaison (tra) et des marqueurs de résistance (antibiotique par exemple).La première étape de la transposition ( l’excision ) conduit à la circularisation de l’élément ,et est contrôlée par une intégrase (Int –Tn) et parfois une excisionase (Xis – Tn) . L’originalité de ces transposons et qui ils sont capables de se propager « verticalement » mais également « horizontalement » par conjugaison .Ils sont donc très souvent associés aux phénomènes de propagation des résistances aux antibiotiques (Prieur et al., 2015).

4. Mécanisme de transposition 4.1. Transposition conservative

La transposition conservative implique que l’élément transposable quitte le réplicon donneur pour se réinsérer au site cible. Le départ du transposon laisse une brèche dans le réplicon donneur qui, de ce fait, sera perdu à moins qu’une autre copie du réplicon ne soit présente dans la cellule hôte et ne puisse servir de réplicon modèle pour une conversion génique.

Celle-ci permettra alors de réparer la brèche à partir de la copie du transposon présente sur le

réplicon modèle. Après transposition et réparation, il y aura donc deux copies du transposon dans la cellule, l’une dans le réplicon donneur, l’autre dans le réplicon cible (figure 8) (Merline et Tousaint, 1999).

Figure 8 : la transposition conservative (Dale et Park, 2004).

4.2. Transposition réplicative

Dans La transposition réplicative le transposon original reste au site parental sur le chromosome et une réplique s’insère dans l’ADN au site cible (figure 9). La transposition du transposon Tn3est un exemple bien étudié de transposition réplicative. Au premier stade, l’ADN contenant Tn3 fusionne avec l’ADN cible pour former une molécule Co-intégrée. Ce processus requiert la transposase de Tn3 codée par le gène tnpA notez que le Co- intégrât contient deux copies du transposon Tn3 au second stade, le co-intégrat est résolu pour donner deux molécules d’ADN, avec chacune une copie du transposon.la résolution implique un enjambement et est catalysée par une résolvase, codée par le gène tnpR (Prescott et al.,2010).

Figure 9 : la transposition réplicative (Prescott et al., 2010).

Chapitre 2 :

Le transfert génétique

I. Transformation

1. Généralité

Découvert par Griffith en 1928. Le phénomène de transformation n’a été compris qu’en 1944 à la suite des expériences d’Avery, Macleod et MacCarthy (figure10).

Démontrent, après une analyse systématique in vitro, que la substance responsable de la transformation n’est autre que l’acide désoxyribonucléique (Figarella et Calas, 2001).

Figure 10 : La découverte de la transformation bactérienne (Karp, 2010).

1. Définition :

Certaines bactéries peuvent capter des fragments d’ADN à partir du milieu extérieur. Ceci est un autre moyen pour les bactéries d’échanger leur génes. L’ADN peut provenir d’autres cellules de la méme espéce ou de cellules d’autres espéces. Dans certains cas, l’ADN est issu de cellules mortes. Dans d’autres cas, L’ADN a été sécrété hors de cellules bactériennes vivantes. L’ADN capté s’intégre dans le chromosome du receveur.si cet ADN provient d’un génome différent de celui du receveur, le génotype du receveur peut étre changé durablement au cours d’un processus appelé transformation (Thomas, 2016).

2. Etat de compétence

La compétence est un état physiologique transitoire (sauf exception comme chez Neisseria gonorrhoeae) génétiquement contrôlé, que de nombreux procaryotes développent de façon naturelle, et que l’on sait induire artificiellement en laboratoire. La compétence naturelle a été étudiée dans les conditions de laboratoire, et chez peu d’organismes, essentiellement deux bactéries modèles, Gram+, ce qui a longtemps maintenu l’idée que seul ce groupe de bactéries en était capable : Streptococcus pneumoniae et Bacillus subtillis. Le développement de la compétence exige la synthèse de 25 à 50 protéines différente, qui sont produites en réponse à des stimuli externes comme les changements des conditions de croissance, de l’accessibilité aux nutriments, c’est-à-dire de condition de carences, et de la densité de la population cellulaire (Paolozzi et Liébart, 2015).

Chez Streptococcus pneumoniae, le développement de la compétence se manifeste des que la population atteint une certaine densité et quand le pH intercellulaire est de l’ordre de 8,3.Dans les conditions de laboratoire, la compétence est un état transitoire (une trentaine de minutes environ équivalent à un temps de génération), contrairement à d’autres espèces pour lesquelles la compétence se poursuit bien au-delà du temps de doublement. Chez Bacillus subtilis, la compétence se développe à la fin de la croissance exponentielle de la population et à la suite d’un stress nutritionnel prolongé. Pour d’autres bactéries comme haemophilus influenzae, le signal déclencheur est inconnu ; ce processus exige une carence nutritionnelle et la présence d’adénosine-monophosphate cyclique (AMPc). La proportion de cellules qui deviennent compétentes au sein d’une population est très variable selon les espèces, et comprise entre une fraction et 100% (Paolozzi et Liébart, 2015).

La physiologie de l’état de compétence, et sa régulation complexe, font intervenir des systèmes de réponse aux signaux externes et des interactions intercellulaires. ainsi l’état de compétence peut-être associé, au moins chez les bactéries du genre Streptococcus, à un comportement fratricide, une stratégie qui conduit les cellules compétentes à tuer les cellules non compétentes pour en libérer l’ADN (Paolozzi et Liébart, 2015).

Certaines espèces naturellement non transformables peuvent être poussées à devenir compétentes. Par exemple, l’Escherichia coli, en utilisant des traitements chimiques par le CaCl₂, glacé suivis d’une courte période de choc thermique. Cette compétence n’est pas identique à la compétence naturelle (Nicklin et al., 2000 ).

3. ADN transformant

L’aptitude à la transformation est étroitement conditionnée par la taille des fragments de chromosome de la bactérie donatrice. Avec le pneumocoque, la masse molaire moyenne des préparations d’ADN actif est de 5

×

¹⁰⁶ daltons. Chaque molécule de préparation transformant représente environ la 300^e partie du génome d’une bactérie. La probabilité de transformation doit donc augmenter en fonction de la concentration en ADN .l’ADN doit être bicaténaire. En général, un seul caractère est transféré au cours du phénomène, même si les bactéries donatrices et réceptrice différent par de nombreuses autre propriétés (Figarella et Calas, 2001).

4. Absorption et la sort de l’ADN

La nature de l’ADN prise dépend du genre. La plupart des bactéries vont absorber toute molécule d’ADN, l’Haemophilus requiert la présence d’une séquence spécifique de 10 Kb sur l’ADN. L‘Haemophilus, bactérie Gram négative, lie et absorbe ADN double brins, contrairement aux bactéries Gram positives, Bacillus et Streptocoque , qui lient l’ADN double brins et qui dégradent un brin alors que l’autre brin est emporté dans la cellule. l’ADN linéaire entrant est protégé contre la dégradation par des protéines de compétence-spécifique et est intégré dans le génome par recombinaison grâce à l’action de la protéine RecA. Apres induction artificielle d’une compétence chez Escherichia coli, des ADN plasmidiques circulaires sont préférentiellement absorbés et restent indépendants dans le chromosome (figure 11 ) (Nicklin et al., 2000 ).

Figure 11 : la transformation par l’ADN (Moussard, 2005).

II.

Conjugaison

1. Généralité

Lederberg et tatum mélangèrent deux souches autotrophes, incubèrent la culture pendant plusieurs heures dans un milieu nutritif et l’étalèrent sur un milieu minimum. Afin de réduire le risque que leurs résultats soient dus à une simple réversion, ils employèrent des doubles et triples auxotrophes, considérant que deux ou trois réversions simultanées seraient extrêmement rares. Par exemple, une souche exigeait de la biotine (Bio^-), de la phénylalanine (phe^-) et de la cystéine (cys^-) pour sa croissance, et une autre souche exigeait des colonies recombinantes prototrophes apparurent sur le milieu minimum après incubation (Figure12).

les chromosomes des deux souches auxotrophes étaient donc capables de s’associer et se recombiner (Prescoti et al.,2010).

Figure 12 : la preuve de la conjugaison bactérienne (Brooker, 2012).

Lederberg et tatum n’avaient pas directement prouvé que le contact physique des cellules était nécessaire pour le transfert de gènes. Ceci fut démontré par Bernard Davis (1950) qui construisit un tube en U, fait de deux tubes de verre condés soudés à la base pour le U, avec un verre filtré entre les deux moitiés. Le filtre permet le passage du milieu nutritifs et inocula chaque branche avec une souche auxotrophe différente d’Escherichia coli (figure 13). Au cours de l’incubation, le milieu fut pompé en aller-retour, à plusieurs reprises, à travers le filtre pour s’assurer qu’il y avait échange du milieu liquide entre les deux du tube. Après 4 heures d’incubation, les bactéries furent étalées sur milieu minimum. Davis constata que lorsque les deux souches auxotrophe étaient séparées l’une de l’autre par le mince filtre, le transfert de gènes ne pouvait avoir lieu. par conséquent, un contact direct était requis pour la recombinaison que lederberg (Prescott et al.,2010).

Figure 13 : l’expérience du tube en U (Brooker, 2012).

2. Définition

La conjugaison est le transfert de matériel génétique d’une bactérie donatrice et une bactérie réceptrice par contact direct entre les deux bactéries. Le matériel génétique transféré peut être chromosomique ou extra-chromosomique (plasmide) ou transposon conjugatif (Boulahbal,2002).

3. Les modes de transfert par conjugaison chez les Gram^-

 Croisement F+× F-

Au cours d’un croisement F+× F- ou conjugaison. Facteur F se réplique par un mécanisme de cercle roulant et une copie migrer vers la cellule receveuse. La chaine en voie de pénétration est copiée pour donner un ADN double brin. La fréquence de recombinaison des gènes chromosomique est faible parce que chromosome bactérien est rarement transféré avec le facteur F indépendant. On ne comprend pas toujours bien comment le plasmide passe d’une bactérie à l’autre. Le pilus sexuel ou pilus F unit le donneur et le receveur et peut se contracter pour les rapprocher. Le canal de transfert d’ADN pourrait été le pilus F creux ou un tube de conjugaison particulier formé lors du contact (figure 14a) (Prescott et al.,2007).

 Conjugaison Hfr

Dans ce type de conjugaison le donneur transfère des gènes chromosomiques avec une grande efficacité, mais ne transforme pas les bactéries receveuses en cellules F+ à cause a la haute fréquence de recombinants produits par ce croisement, on parle de conjugaison Hfr bien

qu’initialement on ne connut pas le mécanisme de la conjugaison Hfr, on finit par établir que les souches Hfr contenaient le facteur F intégré dans leur chromosome, plutôt que libre dans le cytoplasme.

Le transfert de l’ADN commence par la coupure du facteur F intégré, a son site d’origine de transfert. Tout en se répliquant, le chromosome migre vers le receveur. Comme le facteur F n’est transféré qu’en partie, le receveur F^- ne deviendra pas F⁺, sauf si le chromosome est transféré en entier (figure 14b), (Prescott et al.,2010).

 Croisement F⁺× F’

Le plasmide F étant un épisome, il peut quitter le chromosome bactérien. Durant ce processus le plasmide fait parfois des erreurs d’excision et emporte une portion du matériel chromosomique pour former un plasmide F⁺. Il n’est pas plasmide F excisés. La cellule F’

conserve tous ses gènes. Certaine portés par le plasmide, et ne peut effectuer un croisement qu’avec une receveuse. La conjugaison F’× F⁺ est essentiellement identique au croisement F+

sont transférés avec celui-ci et ne doivent pas être incorporés dans le chromosome de la cellule receveuse afin d’être exprimés.la receveuse devient F’ (figure 14c) (Prescott et al.,2007).

Figure 14: le transfert par la conjugaison (Tortora et al.,2013).

4. Conjugaison chez les bactéries Gram +

Il existe des plasmides auto transmissible chez des genres bactériens Gram-positifs, comme Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Etraphylococcus et Streptomyces. Ces systémes sont beaucoup moins bien connus. Il apparait que moins de gènes de transfert y sont impliqués, peut-être parce que le transfert de ces plasmides ne semble pas exiger de pilus sexuel. Par exemple, les cellules receveuses d’Enterococcus hirae libèrent de courts peptides servant de signaux chimiques, qui activent les gènes de transfert des cellules donneuses qui contiennent le plasmide adéquat. Cellules donneuses et receveuses adhérent l’une à l’autre directement, par l’intermédiaire de protéines spéciales codées par le plasmide et relâchées par la cellule donneuse activée, le transfert du plasmide a alors lieu (Figure 15) (Prescott et al.,2010).

Figure 15 : Comparaison entre la conjugaison chez les bactéries gram positif et les bactéries gram négative (Hiron, 2008).

III. Transduction

1. Généralité

Ce phénomène a été mis en évidence en 1951 par Zinder et Lederbrg chez Salmonella thphimurium. Ces auteures cherchaient à recombiner du mutants auxotrophes provenant de diverses souches de salmonella afin d’obtenir des prototrophes .C’est un autre phénomène qu’ils découvrirent, différent de la conjugaison. Deux souches auxotrophes de salmonella sont utilisées : l’un (2A) exige de l’histidine pour sa croissance, l’autre (22A) du tryptophane .Dans un tube U séparé a la base par une membrane de verre fritté interdisant le passage de des bactéries mais non celui des virus, on introduit d’un coté 108 bactérie de la souche 2A et, de l’autre, 10⁸ de la souche 22A. Des prototrophes sont formé de ce dernier coté à une fréquence de 10^-5 environ, mais aucun ne peut être isolé de la partie ensemencée avec la souche 2A. Les bactéries 22A portent un bactériophage (22A) qui traverse la membrane et lyse les cellules 2A : un nouvel agent filtrable est libéré .Quelque cellules de la souche 22A à son contact. Acquièrent de nouvelle propriétés ; elles deviennent de cultiver sans tryptophane cet agent filtrable n’est pas détruit par la désoxyribonucléase (Figarella et Calas, 2001).

sa taille, sa constance de sédimentation, sa sensibilité à la chaleur et son inactivation par un sérum antiphage sont autant de caractères identiques à ceux de bactériophage P22 (Figarella et Calas, 2001).

2. Définition

Le troisième mode de transfert de gènes bactériens est la transduction. C’est un fréquent de transfert génétique horizontal dans la nature et il est dû à des virus. (Prescott et al., 2010).

3. Morphologie de phage

Les phages, ou Les bactériophages sont des virus bactériens ; c’est à dire des entités capables d’injecter leur matériel génétique dans une cellule procaryote pour s’y développer à ses dépens. Les phages les plus connus ; et surtout les plus utilisées comme vecteurs de clonage, sont les phages lambda (Beaumont, 2010).

Beaucoup de phages sont simplement constitués d’un acide nucléique enfermé dans une capside protéique (le manteau) .selon le phage .Le génome peut être de l’ADN double brins , de l’ADN simple brin ,de l’ARN double brin, ou de l’ARN simple brin .certains phages sont polyédriques d’autres filamenteux ou pléiomorphes, et certains ont une « queue » par laquelle ils s’attachent à la cellule hôte .Dans de nombreux cas , un phage donné ne peut infecter que les cellules d’un seul genre, d’une seule espèce ou d’une seule souche ( figure 16 ). L’effet de l’infection dépend du phage considéré et de la cellule hôte, dans une certaine mesure, des conditions extérieures les phages virulents se multiplient dans leurs cellules hôtes et les lysent c’est à dire que les cellules hôtes meurent et éclatent, libérant la progéniture du phage. Les phages tempérés peuvent établir une relation stable, non lytique (lysogénie) avec leurs cellules hôtes, d’autre phages encore peuvent se multiplier dans leurs cellules hôtes sans détruire, les phages s’échappant des cellules vivantes Tableau 2 (Singleton,2011).

Figure 16 : structure de phage (Brooker, 2012).

Nom Génome1 Morphologie2 Hote principale

ʎ

ADN double brin linéaire

taille2

Tète isométrique, longue queue, non contractile ; env. 200nm

Escherichia coli

Mu ADN double brin linéaire

taille2

Tète isométrique, longue queue, non contractile ; env. 200nm

Entérobactéries

T4 ADN double brin linéaire

Tète isométrique, queue courte ; env.

150nm

Escherichia coli

F1 ADN simple brin (ccc) Icosaédrique, avec membrane lipidique interne ; env.

60nm

Entérobactéries (seulement les cellules donneuse conjugatives être infectées)

M12 ARN simple brin (ccc) Icosaédrique ; Env.25nm

Entérobactéries (seulement les cellules

donneuses conjugatives) Tableau 2 : Quelque exemples des bactériophages (Singleton, 2011).

4. Types de transduction

4.1. Transduction généralisée

La transduction généralisée est réalisée par certains bactériophages virulents. Après infection d’une cellule, ces bactériophages subissent un cycle complet de réplication. Durant le processus d’infection, le chromosome de l’hôte est dégradé et l’ADN est utilisé comme source de blocs de nucléotides pour synthétiser le génome de phage (Perry et al., 2004).

Occasionnellement, de relativement gros fragment d’ADN génomique restent dans le cytoplasme lorsque les phages forment leur capside. Des erreurs d’encapsidation, peu fréquentes, conduisent à l’incorporation d’ADN bactérien a la place d’ADN phagique. A la fin du cycle d’infection, la cellule se lyse et libère les phages produits .Bien que la grande majorité des capsides contiennent l’ADN de phage et soient de ce fait pleinement capable de se lier a des cellules hôtes pour réaliser de nouveaux cycles infectieux, les rares capsides contenant de l’ADN bactérien vont également se lier a de nouveaux cellules hôtes et injecter dans le cytoplasme leur contenu génomique. Cette interaction entre cellule et phage ne conduit pas à la mort cellulaire car l’ADN introduit ne code pas pour les constituants de particules virales .Cependant la cellule hôte possède alors un fragment d’ADN génomique provenant d’une autre cellule. Ce fragment d’ADN se comporte comme tout fragment d’ADN introduit par un mécanisme d’échange de gêne tel que la transformation. Si le fragment d’ADN introduit présente des homologies avec le chromosome de l’hôte, des évènements de double recombinaison réciproque pourront avoir lieu et conduire à l’intégration de l’ADN transduit dans le chromosome bactérien. Ce processus permit donc le transfert d’ADN d’une bactérie a l’autre (figure 17) (Perry et al., 2004).

Figure 17 : cycle lysogénique d’un bactériophage (Brooker, 2012).

4.2. Transduction spécialisée

La transduction spécialisée nécessite l’incorporation de l’ADN viral dans le chromosome bactérien et n’est donc réalisée que par les virus lysogéniques. Elle a lieu après la formation du prophage, avec l’intégration de l’ADN viral au niveau d’un cite spécifique du chromosome de la cellule hôte. Le prophage se réplique donc pendant plusieurs générations avec le chromosome bactérien, donc il fait partie intégrante (Perry et al., 2004).

Occasionnellement, il peut s exciser et initier un cycle virulent, supposant la réplication de l’ADN viral, l encapsidation et la lyse de la cellule hôte. Cette excision peut être parfois imprécise et entrainer une partie d’ADN chromosomique flanquant l’ADN viral. Cet ADN excisé est alors inclus dans l’ADN viral, il se réplique avec lui et est en capside dans chaque particule virale produite .Après la lyse cellulaire, les bactériophages virulents libérés vont infecter de nouvelles cellules hôtes, conduisant à la réplication virale et a un nouveau cycle virulent. Cependant, comme le bactériophage initial, le virus transduit peut débuter un cycle de lysogénie supposant l’intégration chromosomique de L’ADN viral. Si la cellule hôte présente des séquences homologues aux séquences d’ADN bactérien transduites par le bactériophage, des événements de recombinaison réciproque sont susceptibles de se réaliser, conduisant à l’incorporation stable de ces gènes dans le chromosome bactérien indépendamment de l’établissement d’une lysogénie (Perry et al., 2004).

La transduction spécialisée permet le transfert par des phages de gènes situés (figure 18) (Perry et al., 2004).

Figure 18 : le cycle lytique d’un bactériophage (Brooker, 2012).

4. 3. Conversion lysogénique

Les bactéries lysogénisées par un phage peuvent présenter certaines caractéristiques absentes des cellules non infectées. Cette conversion lysogénique peut être causée par l’expression des gènes du phage par les cellules, ou par l’inactivation des gènes chromosomiques lors de l’intégration du prophage. Par exemple, les souches de Corynebacterium diphtheriae qui provoquent la diphtérie sont lysogenisées par un certain type de phages qui encodent et expriment une toxine puissante. Les souches qui ne portent pas les phages ne peuvent fabriquer la toxine et ne causent pas la diphtérie. Chez staphylococcus aureus, l’integration du phage L54 a entrainé la perte d’une activité de lipase, due à l’inactivation du gène chromosomique correspondant. l’infection phagique peut modifier l’antigène O d’une bactérie hôte, affectant ainsi son sérotype (Singleton, 2011).

Partie expérimentale

Matériel et méthodes

I. Matériel biologique

Les souches utilisées dans notre travail ont été isolées et identifiés au sein du laboratoire de microbiologie à l’hôpital Ibn Zohr par notre collègue Mme Menidjel Nadia dans le cadre de son projet PFE sur les infections nosocomiales à bactéries multi résistantes.

Les souches utilisées présentent des résistantes et des sensibilités variantes au sein du même genre (tableau 3).

II. Culture des bactéries

Les souches conservées dans la gélose de conservation ont été prélevés par piqure centrale et ensemencer par des stries sur des milieux spécifiques (figure 19).

 Les souches de Staphylococcus aureus dans des boites contenant le milieu Chapman.

 Les souches de Klebsiella pneumoniae, d’Escherichia coli et de Pseudomonas aeruginosa, dans des boites contenant le milieu Mac conkey.

 Les souches de Citrobacter koseri et d’Acinetobacter baumanii, dans des boites contenant le milieu gélose nutritive.

Après 24h de revivification des souches sur milieu gélosé, une autre culture est ensemencée sur bouillon nutritif et incuber à 37°c pendant 24h.

Figure 19: l’ensemencement des souches sur des milieux d’isolement spécifiques.

Tableau 3 : les caractères génétiques des souches utilisées.

Ceftriaxone Ertapénéme Cefoxitine

Acide clavulanique + Amoxicilline

Céfotaxime Ampicilline Céfazoline Oxacilline Licomicine Erythromycine Pristinamycine

Citrobacter koseri (R6)

R S R R R R R _ _ _ _

Staphylococcus aureus (S)

_ _ S _ _ _ _ S S S S

Staphylococcus aureus MRSA Klebsiella pneumonia (R4)

R S S S R R R _ _ _ _

Klebsiella pneumonia (R4+I)

R I S S R R R _ _ _ _

Klebsiella pneumonia (R4+I)

R S S I R R R _ _ _ _

Klebsiella pneumonia(R3)

S I S R S R R _ _ _ _

Klebsiella oxytoca (R6)

R R S R R R R _ _ _ _

E.coli (R4) R S S S R R R _ _ _ _

E.coli (R5) R S S R R R R _ _ _ _

Tableau 3 : les caractères génétiques des souches utilisées (suite)

Collistine Amikacine Gmn Ciprofloxacine Tobramycine Imp Fsf Ceftazidime Ticarcilline Tcarcilline Pseudomonas

aeruginosa (R7)

S S R R R R R S R R

Acintobacter baumanii (3I)

S S S S S S - I I I

Acintobacter baumanii (2I)

S S S S S S - S I I

Acintobacter baumanii (R7)

S S R R R R - R R R

R : résistante.

S : sensible.

- : non testé.