Correction septembre 2000
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître la méthode usuelle utilisée chez Saccharomyces cerevisiae pour déleter des gènes. Cette méthode est décrite dans le cours sur Psi.
Candida albicans est un anamorphe (= forme asexuée) et ne présente pas de téléomorphe (= forme sexuée). De même, elle a une ploïdie variable (souvent des aneuploïdies). Pour simplifier nous considérerons qu'il existe un seul gène CaFTR1 et un seul gène CaFTR2 (les auteurs ont en fait trouvé 3 gènes CaFTR1). Comme ceci n'était pas indiqué dans le cours, je n'ai pas pénalisé lorsqu'un cycle de type haplodiplobiontique était supposé pour cet organisme.
Pour déléter les gènes. Il faut donc construire par PCR ou à l'aide de digestions par des enzymes de restriction suivies de ligation, un plasmide qui comporte une "cassette" contenant un segment d'ADN situé juste en amont du gène et un segment d'ADN situé juste en aval du gène (CaFTR1 ou CaFTR2 en fonction du gène que l'on veut déléter), encadrant un marqueur de sélection. Chez les levures, il s'agit généralement de l'allèle sauvage d'un gène codant pour un enzyme d'une chaîne de biosynthèse d'un acide aminé ou d'un nucléotide. Cette cassette peut grâce à deux crossing-over venir remplacer le gène et donc permettre l'obtention de mutants sans CaFTR1 ou CaFTR2. Vous pouviez aussi faire un schéma !
Une souche pour laquelle le gène choisi est muté est utilisée comme souche receptrice pour la transformation (cette souche ne pousse donc pas sur milieu minimum) avec le plasmide linéarisé en utilisant un enzyme qui coupe à l'extérieur de la cassette. Les transformants poussant sur milieu minimum sont récupérés (d'après l'énoncé du sujet les gènes CaFTR1 et CaFTR2 ne sont pas essentiels, sauf CaFTR1 dans certaines conditions) et l'ADN correspondant aux gènes CaFTR1 et CaFTR2 est analysé par Southern Blot afin de vérifier si les gènes ont été correctement remplacés par la cassette de délétion.
Pour tester les phénotypes, il faut soit étaler des levures sauvages, délétées pour CaFTR1 ou CaFTR2 sur des milieux riches ou pauvres en fer et observer la formation de colonies, soit établir des courbes de croissance pour les mêmes souches dans les mêmes milieux (mais liquides !).
Pour les tests d'infections systémiques, il faut injecter différentes quantités des levures des trois souches dans la cavité générale de souris, laisser incuber et ensuite sacrifier et autopsier les souris en même temps que des souris témoin non injectées (ou injectées avec de l'eau stérile).
Cette méthode expliquée clairement : 10 points
Pour expliquer les résultats, l'hypothèse la plus simple est que CaFTR1 code pour un transporteur à haute affinité du fer alors que CaFTR2 code pour un transporteur à faible affinité qui peut être remplacé par d'autres transporteurs ayant aussi une faible affinité pour le fer (transporteur du cuivre ou du zinc par exemple). CaFTR1 est lui par contre essentiel, car c'est le seul qui a une affinité suffisante pour le fer lorsque celui-ci est en faible concentration.
Pour expliquer les résultats obtenus dans les souris, deux hypothèses. Soit CaFTR1 est directement impliqué dans le processus infectieux (plusieurs modalités possibles !), soit l'intérieur des souris est un milieu pauvre en fer (Candida est un parasite extracellulaire) ce qui implique que CaFTR1 doit être présent pour permettre l'entrée de fer dans les cellules de Candida et initier une
croissance vigoureuse permettant l'infection systémique. Il est vraisemblable que la deuxième hypothèse est la bonne !
Ces hypothèses clairement rédigées : 5 points
Les conséquences sont évidemment l'aspect thérapeutique. Cela passe passe par la recherche d'inhibiteur de CaFTR1, ou de vaccin permettant la production d'anticorps dirigés spécifiquement contre CAFTR1.
Ceci clairement discuté : 5 points
