Résumé :Objectif :Evaluer l’apport diagnostique de trois méthodes d’identification du Plasmodium.
Matériel et méthodes :Etude prospective, sur deux ans, à Libreville (Gabon). Ont été inclus les patients suspects de paludisme. Trois techniques sont réalisées : goutte épaisse (GE), frottis sanguin (FS), Quantitative Buffy Coat (QBC) et ParaSight F (PS).
Résultats :Sur les 418 prélèvements, la GE est positive dans 22,3 %, le FS 95,7 %, le PS 20,1 %, et le QBC 25,1 %. La sensibilité et la spécificité du PS sont respectivement de 86 % et 98 % , et celles du QBC sont respectivement de 100 % et 96 %.
Conclusion : le PS apporte un argument supplémentaire pour l’identification de l’espèce, et permet un diagnostic rétrospectif.
Mots-clés : diagnostic - paludisme - identification plasmidium..
Diagnostic du paludisme par évaluation de trois méthodes d’identification du
plasmodium
Diagnosis of the malaria by assessment of three methods of identification of the
plasmodium
S. El-Hamzaoui, Y. Sekhsokh1, A. Dami, H. L’kasmi, S. El-Machtani, M. Elouanass, A. Zeggwagh
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Abstract :Objective :To value the diagnostic contribution of three methods for identification of the Plasmodium.
Material and methods :Prospective survey, on two years, in Libreville (Gabon).
Have been included patients suspected of malaria. Three techniques are achieved: thick drop (TD), blood smear (BS), Quantitative Buffy Coat (QBC) and ParaSight F (PS) .
Results :On the 418 taking, the GE is positive in 22,3%, the FS 95,7%, the PS 20,1%, and the QBC 25,1%. The sensitivity and the specificity of the PS are respectively 86% and 98%, and those of the QBC are respectively 100%
and 96%.
Conclusion :the PS brings a supplementary argument for the identification of the species, and permits a retrospective diagnosis.
Key-words : diagnosis malaria - identification plasmodium.
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Tiré à part : S. El-Hamzaoui- Service de microbiologie - Hôpital d’Instruction militaire Mohammed V - Rabat -
Introduction
Le paludisme est une maladie infectieuse, meurtrière. Il s’agit d’une érythrocytopathie, due à un protozoaire sanguicole du genre Plasmodium, transmis par la piqûre d’un moustique hématophage : l’anophèle femelle.
Selon les dernières données fournies par l’Organisation Mondiale de la Santé, 40% de la population du globe (deux milliards de personnes) est exposé au risque de paludisme [1]. Pour la majorité des pays de la zone tropicale, l’impact socio-économique est considérable [2]. La présentation souvent atypique de la maladie entraîne un retard diagnostique qui lui-même favorise la survenue des formes graves [3]. La base de la prise en charge de la maladie repose sur un diagnostic de certitude identifiant l’espèce plasmodiale.
Une nouvelle génération de tests s'est développée certains font appel à la fluorescence (test QBC) [4-7], d’autres sont immunoenzymatiques (le test ParaSight F) (PS) [8-12], d'autres encore sont rendus possibles par l'isolement et la purification d'antigènes provenant de divers stades du développement parasitaire et de la production d'anticorps monoclonaux spécifiques de ces antigènes [13-16].
L’objectif de notre étude est d’étudier la validité du test QBC et du test PS en zone d’endémie, au sein d’une population de sujets prémunis et « suspects cliniques » du paludisme maladie.
Matériels et méthodes
L’étude prospective et anonyme s’est déroulée à Libreville (Gabon), durant une période de deux ans, de janvier 1999 à décembre 2001.
Situé entre le 2ème parallèle nord et le 3ème parallèle sud, le Gabon est traversé par l'équateur et occupe une superficie de 260.000 Km2 où vivent 1.014.976 habitants environ. Toutes les régions du Gabon, y compris les villes sont impaludées [17]. Les espèces en cause sont P.falciparum dans 95% des cas, P.ovale et P.malariae se partageant les cinq pour cent restants [18,19]. A Libreville, la transmission du paludisme est permanente à recrudescence saisonnière [20]. Signalées depuis les années cinquante, les chimiorésistances de P.falciparum se sont répandues et, aujourd’hui, elles concernent les amino-4- quinoléines (chloroquine, amodiaquine), les antifoliniques (pyriméthamine, proguanil, cycloguanil), les antifoliques (sulfadoxine, sulfone) et, dans quelques zones d’endémie, les amino-alcools (quinine, méfloquine, halofantrine).
Actuellement, le Gabon est classé dans le groupe III de chimiosensibilité.
Les échantillons de sang ont été recueillis sur tube Venoject EDTA (Terumo Europe NV- 3001 Leuven Belgium), pour tous les patients nous avons réalisé une numération de la formule sanguine, un bilan biochimique minimum comportant la glycémie, la cholestérolémie et le dosage des Triglycérides.
1- La goutte épaisse (GE) qui a constitué notre méthode de référence [21] pour la présence de Plasmodium, consiste en l'examen sur une petite surface, moins de 1 cm2, d'une quantité de sang relativement importante (3 à 5 microlitres), ce sang est défibriné, séché puis coloré avant toute analyse. Le seuil de positivité du test est évalué entre 10 et 20 hématies parasitées.
La GE est lue selon la méthodologie habituelle [21].
2- Le frottis sanguin (FS) [21] qui consiste à déposer sur une lame dégraissée, à une extrémité, une petite goutte de sang, qu'on étale à l'aide d'une lame rodée, et qu’on colore au May-Grunwald-Giemsa, a permis la détermination de l'espèce plasmodiale et l'estimation de la densité parasitaire si Plasmodium falciparum était en cause.
3- Le test ParaSight F (PF) (Becton Dickinson Tropical Disease Diagnostic, Sparks, MD, USA) est un test immunoenzymatique pour la détection qualitative de la Proteine Riche en Histidine II (HRP II) sur sang total.
Cette glycoprotéine spécifique du P. falciparum est exposée à la surface du globule rouge parasité et, en même temps activement sécrétée par les formes asexuées du parasite intra cellulaire.
L'ensemble de ces critères a conduit au choix de cette molécule comme un marqueur de l'infection plasmodiale.
Ce test ne nécessite aucun matériel, 50 μl de sang total sont prélevés à l’aide d’un microtube capillaire à partir d'échantillon de sang et mélangés avec trois gouttes de solution hémolysante. Après filtration, le sang hémolysé est transféré dans une cupule. Une bandelette test est mise au contact de l'échantillon. Ces bandelettes de nitrocellulose de couleur blanche de 70 mm de long sur 7 mm de large sont partiellement recouvertes sur 23 mm d'une couche absorbante en fibre de verre. Un anticorps monoclonal d'origine murine réagissant contre l'HRP II est fixé sur toute la largeur de la bandelette à environ 7 mm de la base. Un dépôt d'antigène HRP II situé à 15 mm de la base sur une partie de la largeur sert de témoin réaction. Quand le sang a été absorbé par la bandelette, une goutte du réactif de détection est ajoutée dans la cupule (Liposomes marqués à la sulforodamine B et couplés à des anticorps de lapin dirigés contre l'HRP II).
Après migration du réactif le long de la bandelette, on rajoute deux gouttes du réactif de lavage. La lecture du test est immédiate.
L'apparition d'une mince ligne de couleur rosée sur toute la largeur de la bandelette, caractérise une réaction positive. Le témoin de validation du test est visualisé par
l'apparition d'une mince ligne discontinue de même couleur, située au dessus de la précédente. La présence du seul témoin de réaction signe un test négatif.
Le temps nécessaire à la réalisation de ce test n'excède pas 7 minutes.
Tous les réactifs, y compris des témoins positifs et négatifs, et consommables sont inclus dans la trousse. Tous les réactifs sont prêts à l'usage et stables entre 2°C et 37°C.
4- Le test Quantitative Buffy Coat (QBC) (Becton Dickinson Tropical Disease Diagnostic, Sparks, MD, USA Becton Dickinson), faisant appel à la fluorescence- exploite l'affinité spécifique de l'acridine orange envers les acides nucléiques, pour visualiser les parasites concentrés dans la couche érythrocytaire libre de matériel nucléique.
La lecture se fait à l'aide d'un microscope à fluorescence.
Tous ces tests ont été réalisés et lus par deux personnes différentes :
Sont exclus tous les individus, n’ayant pas eu les quatre analyses à la fois.
Les indices informationnels qui sont la spécificité (Sp), la sensibilité (Sb), la valeur prédictive négative (VPN) et la valeur prédictive positive (VPP) ont été calculés pour le QBC et Le PF. Les résultats sont comparés à l’examen de référence ou gold standard : la GE.
Résultats
Sur une période de deux ans, de janvier 1999 à décembre 2001, nous avons colligé 418 prélèvements, pour la recherche de Plasmodium. L'âge des patients a varié de 16 mois à 81 ans avec une moyenne de 45 ans, 270 d'entre eux sont hospitalisés pour suspicion clinique d’accès palustre (fièvre, frissons, asthénie, diarrhée, nausées, céphalées).
Sur les 418 prélèvements, la goutte épaisse s'est révélée positive dans 93 cas, soit 22,3%, les frottis sanguins ont permis d'identifier l'espèce plasmodiale dans 89 cas, soit 95,7% (80 trophozoïtes de P.falciparum, sept Plasmodium ovale et deux frottis avec présence exclusive de gamétocytes de P.falciparum), dans quatre cas, faute d'une
parasitémie suffisante, l'espèce plasmodiale n'a pu être formellement identifiée.
Le test ParaSight F a été trouvé positif dans 84 cas, soit 20,1% correspondant aux 80 trophozoïtes de P.falciparum et à quatre cas où la goutte épaisse était négative. Les tests ParaSight F des sept sujets infestés par P.ovale ont été négatifs (tableau I).
La sensibilité et la spécificité du test ParaSight F ont été respectivement de 86 % et 98 %. Les valeurs prédictives positives et négatives ont été de 91 % et 97 %.
Le test QBC a été positif dans 105 cas, soit 25,1%, incluant les 93 cas rendu positifs par la GE (Tableau II)
La sensibilité et la spécificité du test QBC ont été respectivement de 100 % et 96 %.
Les valeurs prédictives positives et négatives ont été de 88 % et 100 %.
Discussion
Sur une période de deux ans, nous avons utilisé pour outils diagnostiques, la goutte épaisse, le frottis sanguin, le ParaSight F et le test QBC.
Nous avons pu étudier la valeur diagnostique du test ParaSight F et du test QBC en zone d’endémie, évaluer leur faisabilité sur le terrain et les valider au sein d’une population de sujets prémunies et « suspects cliniques » de paludisme maladie.
En ce qui concerne le ParaSight F, nous n'avons pas rencontré de problème de manipulation en particulier en ce qui concerne la stabilité des réactifs exposés à la Tableau I : Répartition des 418 prélèvements selon les
résultats de la goutte épaisse et du test ParaSight F.
ParaSight F G.E POSITIVE G.E NEGATIVE TOTAL
PS. POSITIF 80 4 84
PS. NEGATIF 13* 321 334
TOTAL 93 325 418
GE : Goutte Epaisse
* Présence exclusive de : gamétocytes de Plasmodium falciparum : deux cas, Plasmodium ovale : sept cas et espèce indéterminée : quatre cas.
Tableau II : Répartition des 418 prélèvements selon les résultats de la goutte épaisse et du test QBC.
QBC G.E POSITIVE G.E NEGATIVE TOTAL
QBC . POSITIF 93 12 105
QBC . NEGATIF 0 313 313
TOTAL 93 325 418
QBC : Quantitative Buffy Coat GE : Goutte Epaisse
Tableau III : Répartition des 418 prélèvements selon les résultats du test ParaSight F et du test QBC.
QBC/ ParaSight F PS POSITIVE PS NEGATIVE TOTAL
QBC . POSITIF 84 21 105
QBC . NEGATIF 0 313 313
TOTAL 84 334 418
QBC : Quantitative Buffy Coat
température ambiante du pays (26°C - 35°C). Par contre dans dix cas, nous avons été confronté à un problème d'interprétation : la non apparition du témoin de validation pour des densités supérieures à un pour cent hématies parasitées. Ceci est peut être lié à une captation totale des anticorps couplés au révélateur par de grandes quantités d'HRP II fixées sur la bandelette.
Notre étude confirme les données de la littérature, en ce qui concerne les valeurs diagnostiques du ParaSight F [22, 23].
La mise en évidence de quatre faux positifs peut être en faveur d'un seuil de détection plus bas que la méthode de référence. Cette hypothèse n'est pas corroborée par le travail de Beadle [24]. Mais il peut également s'agir d'authentiques faux positifs comme nous l'avions observé chez deux patients hospitalisés, respectivement pour une pneumopathie et une fracture de la cheville, lesquels nous n'avons aucun doute sur l'absence d'infection palustre.
La constatation dans notre série de quatre faux négatifs lors de densités parasitaires très faibles (inférieurs à dix hématies parasitées par microlitre) où même si l'espèce plasmodiale n'a pas été formellement identifiée, des arguments de fréquence au Gabon [24] plaident pour suspecter au moins P. falciparum.
Nous avions évoqué une réaction croisée soit avec l'une des protéines riche en histidine présente à l'état normal dans le sérum soit dans les cadres pathologiques propres aux deux patients. La présence exclusive de gamétocytes de P.falciparum ne positive pas le PS ce qui va dans le sens d'une sécrétion faible ou nulle d'HRP II par les formes sexuées du parasite. Ce test ne peut donc dépister le réservoir de parasite.
Les résultats démontrent que l'utilisation exclusive en zone endémie du test ParaSight F chez des sujets prémunis, suspects clinique de paludisme aurait entraîné la prescription inappropriée de quatre traitements (4/418 soit 1% des cas) et une abstention injustifiée de thérapeutique antimalarique dans 13 cas (13/418 soit 3% des cas). Ce nombre doit être relativisé s'agissant deux fois de gamétocytes seuls, sept fois de Plasmodium ovale et quatre fois d'espèces non identifiées en raison d'une parasitémie trop faible.
La goutte épaisse reste la technique de référence, et ne coûte pas cher pour un laboratoire de routine, le seuil de positivité est évalué entre 10 et 20 hématies parasitées par microlitre (HPM). Cet avantage est contrebalancé par de nombreux inconvénients liés autant à la réalisation technique qu'à l'interprétation de l'examen. Ainsi, avant de colorer une goutte épaisse il faut soit la laisser sécher 24 heures à température ambiante ou au moins 2 heures sous air chaud d'un séchoir, ou 10 minutes dans un micro-onde, mais cette durée est peu compatible avec l'urgence de l'examen.
Les inconvénients majeurs apparaissent au moment de la lecture, en effet la morphologie des plasmodiums est modifiée et les hématies parasitées - dont la morphologie est très utile au diagnostic d'espèce - sont lysées et leur numération n'est pas réalisable. Seule une évaluation très grossière de la parasitémie faisant appel à un rapport parasite / Leucocyte est envisageable. Ainsi, bien que la goutte épaisse apparaît comme une technique d'enrichissement anciennement connue, elle reste une technique utilisée dans le cadre de l'urgence essentiellement dans les zones d'endémie où le technicien est habitué de la lire et elle peut répondre à la question posée par le biologiste : "L'examen met-il en évidence un Plasmodium ?"
Le ParaSight F procure au biologiste chargé du diagnostic du Paludisme un argument supplémentaire pour l'identification d'espèce. Il permet un diagnostic rétrospectif. La disparition de l'HRPII étant plus lente que celle de la parasitémie. Ces deux caractéristiques en font un test précieux pour le diagnostic des formes pauci parasitaires, rencontrées de plus en plus souvent chez les patients au retour de zone d'endémie palustre [25] soumis à une chimioprophylaxie [26], ou chez les sujets ayant pris une automédication avant la consultation. La positivité du test est un argument important pour adapter la thérapeutique.
Ce test ne nécessite aucun matériel, il est donc parfaitement adapté aux structures de soins périphériques ne disposant pas d'un microscope, il représente une possibilité pour ne plus traiter à l'aveugle une suspicion d'accès palustre et d'adapter la thérapeutique à P. falciparum si l'extension de la chimiorésistance l'exigeait pour ces critères, ce test répond par ailleurs aux exigences du groupe de travail de l'OMS qui a fait du diagnostic précis de l'affection un objectif prioritaire. On assiste actuellement à une extension de ce test aux autres espèces plasmodiales par exemple ICT Malaria P.f/P.v
En ce qui concerne le QBC, moyennant un apprentissage facile et de courte durée pour un laborantin ayant une bonne connaissance des images de microscopie classique, la spécificité est proche de 100 %.
L'utilisation du test QBC malaria pour le diagnostic du paludisme est pleinement justifiée dans les centres traitant les cas de paludisme importés. Cependant, bien qu'il ait une sensibilité équivalente à celle de la goutte épaisse, bien qu'il soit de réalisation et lecture rapides, il a d'énormes limites :
- nécessité d'un complément d'équipement
- un coût en consommable supérieur à la goutte épaisse - et un diagnostic d'espèce plasmodiale incorrect dans près de 10 % des cas
Donc en zone d'endémie le QBC test n'apporte pas une grande amélioration,
mais il se justifie dans les centres de référence, et lors
des enquêtes épidémiologiques où sont pratiqués les tests de résistance médicamenteuse in vivo préconisés par OMS.
Les qualités du test font qu'il peut être appliqué à d'autres parasitoses sanguicoles comme la trypanosomiase, la filariose ou la babésiose.
En se basant sur tout ce qui précède, nous pouvons conclure que le ParaSight F, malgré ses limites, peut constituer une alternative aux méthodes de référence que sont le frottis sanguin et la goutte épaisse.
Il apporte un progrès manifeste en termes de validité et de rapidité.
Son intérêt, dans les enquêtes épidémiologiques et le diagnostic rétrospectif ont été démontré et il est maintenant difficile de s'en priver dans ces cadres précis.
alors que le test QBC, bien qu’il apporte un plus en terme de sensibilité et de rapidité, il est actuellement de plus en plus abandonné de part sa lourdeur technique.
Conclusion
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