et appliquŽe, 78352 Jouy-en-Josas Cedex
* INRA UnitŽ de Biologie du DŽveloppement 78352 Jouy-en-Josas Cedex
de la reproduction chez les bovins
et leurs applications rŽelles ou potentielles en sŽlection
Dans les annŽes soixante, le recours massif ˆ lÕinsŽmination artificielle a permis dÕorganiser lÕamŽlioration gŽnŽtique des bovins laitiers. De
nouvelles technologies sont apparues depuis, issues du progr•s des
connaissances sur la fŽcondation et le dŽveloppement de lÕembryon. Elles vont certainement contribuer ˆ amŽliorer indirectement la qualitŽ
gŽnŽtique des taureaux dÕinsŽmination. Dans certaines conditions, elles pourraient m•me influencer directement le niveau gŽnŽtique des
femelles dans les Žlevages et donc la rentabilitŽ de ceux-ci.
RŽsumŽ
Cet article dŽcrit les bases de plusieurs biotechnologies de la reproduction chez les bovins : superovulation et transplantation embryonnaire, sexage des embryons, ponction des ovocytes in vivo et fŽcondation in vitro, clonage embryon- naire et clonage somatique. On prŽcise leurs limites techniques actuelles, leurs perspectives dÕamŽlioration et leurs cožts respectifs. Les consŽquences de leur utilisation dans les programmes dÕamŽlioration gŽnŽtique sont analysŽes tant au niveau de la situation actuelle que des perspectives. Il appara”t que la transplan- tation embryonnaire est efficace et rentable dans les programmes de sŽlection bovins. Les perspectives ˆ long terme les plus intŽressantes sont fournies par le clonage si les obstacles techniques sont surmontŽs.
On appelle biotechnologies de lÕembryon lÕensemble des techniques mises au point ˆ partir des connaissances de base acquises sur le dŽveloppement de lÕembryon. Leur essor est rŽcent et encore ˆ bien des Žgards modeste.
Elles se sont dŽveloppŽes chez les mammi- f•res domestiques ˆ partir des annŽes 80, dÕabord dans lÕesp•ce bovine o• la reproduc- tion des animaux Žtait, depuis dŽjˆ trente ans, largement organisŽe autour de lÕinsŽmi- nation artificielle. Chez cette esp•ce, lÕem- bryon a dÕabord ŽtŽ produit exclusivement in vivo apr•s stimulation hormonale des femelles donneuses. Ce mode de production a permis le dŽveloppement de la technologie du transfert dÕembryons associŽe ˆ leur congŽla- tion. Plus rŽcemment, une deuxi•me gŽnŽra- tion de technologies est apparue qui sÕappuie sur la production dÕembryons en culture, apr•s maturation et fŽcondation in vitro dÕovo- cytes prŽlevŽs sur lÕanimal vivant. Les pro- gr•s de nos connaissances sur la physiologie
de lÕembryon de mammif•re permettent main- tenant lÕŽmergence dÕune troisi•me gŽnŽration de techniques. Celles-ci tirent parti de lÕextra- ordinaire plasticitŽ des premiers stades de lÕembryogŽn•se et visent ˆ modifier encore plus en avant les caractŽristiques de lÕem- bryon : le transfert nuclŽaire qui aboutit ˆ la production de clones, et la transgŽn•se qui consiste ˆ introduire un g•ne Žtranger dans les cellules de lÕembryon en sont les illustra- tions.
Pour prŽsenter ces trois gŽnŽrations de technologies, nous avons donc choisi lÕesp•ce bovine comme mod•le. Notre propos est dÕexa- miner quels sont les apports potentiels des biotechnologies de lÕembryon pour lÕŽconomie des productions animales et particuli•rement pour la sŽlection des reproducteurs, sans Žvo- quer les technologies qui modifient les carac- tŽristiques gŽnŽtiques des embryons. Ceci nous a conduit ˆ ne pas traiter de la transgŽ- n•se (voir lÕarticle de L.-M. Houdebine, ce numŽro) et ˆ prŽsenter chaque technologie en deux temps : une description des techniques et de leur efficacitŽ, puis une analyse de leur impact rŽel ou potentiel dans les programmes dÕamŽlioration gŽnŽtique.
1 / Des bases biologiques aux techniques
Les interventions sur lÕembryon de mammi- f•re concernent essentiellement la pŽriode du dŽveloppement qui prŽc•de son implantation
dŽfinitive dans lÕutŽrus. Cette pŽriode dure selon les esp•ces de 4 (souris, lapin) ˆ environ 14 jours (vache). Elle est marquŽe par la mise en activitŽ du noyau zygotique et la rŽalisa- tion des premi•res diffŽrenciations cellulaires.
LÕŽtude des mŽcanismes fondamentaux qui assurent la rŽalisation de ces deux ŽvŽne- ments rŽv•le deux caractŽristiques de la vie au dŽbut du dŽveloppement : le r™le essentiel du gam•te femelle dans le contr™le de la mise en activitŽ du gŽnome zygotique, et la grande plasticitŽ de lÕembryon notamment vis-ˆ-vis du milieu environnant jusquÕau moment de lÕimplantation (Menezo et Renard 1991).
CÕest ˆ partir de ces deux caractŽristiques du dŽbut de lÕembryogen•se que se sont constituŽes et que continuent ˆ se dŽvelopper les biotechnologies de lÕembryon (figure 1).
Historiquement, les premi•res applications des donnŽes de la recherche ont ŽtŽ dŽvelop- pŽes en collectant des embryons dŽveloppŽs in vivo, au stade blastocyste. Dans un deuxi•me temps, mais ˆ partir des annŽes 80 seule- ment, les interventions ont concernŽ les ovo- cytes matures fŽcondŽs in vitro (Brackett et al 1982) puis les ovocytes immatures (Leibfried- Rutledge et al 1987). Cette Žvolution a ŽtŽ rendue possible par les progr•s rŽalisŽs dans la dŽfinition de conditions de culture appro- priŽes (Heyman et Menezo 1987). Elle a per- mis de multiplier les interventions sur les embryons, crŽant une combinatoire de tech- niques intŽgrant toujours plus en avant les donnŽes de base de la biologie du dŽveloppe- ment.
Ces techniques se sont organisŽes autour de trois technologies principales : la transplanta- tion embryonnaire, associant la production et la collecte dÕembryons in vivo et intŽgrant maintenant le plus souvent les possibilitŽs offertes par leur congŽlation ou lÕexamen de leur cellules (sexage) ; le prŽl•vement in vivo dÕovocytes par ponction folliculaire (OPU) suivi de leur maturation, leur fŽcondation in vitro (FIV) puis de la culture des embryons ; enfin le clonage qui ouvre la voie ˆ la multi- plication de gŽnotypes embryonnaires iden- tiques et pourrait demain •tre Žtroitement associŽ ˆ la modification contr™lŽe du gŽnome par transgŽn•se.
2 / Les applications actuelles du transfert dÕembryons
2
.1/ Une activitŽ en constante progression
Le transfert dÕembryons est utilisŽ en pra- tique dans les Žlevages depuis le dŽbut des annŽes 80. Cette technologie a pu voir le jour gr‰ce aux connaissances accumulŽes sur la physiologie de la reproduction des mammi- f•res domestiques, notamment ˆ partir des progr•s dŽcisifs obtenus avec le contr™le hor- monal de la croissance folliculaire (MaulŽon et al 1970) et celui du moment de lÕovulation (Thimonier et al 1975). Le transfert dÕem- bryons, qui sÕest dÕabord dŽveloppŽ par trans- position des mŽthodes chirurgicales proposŽes par la recherche vŽtŽrinaire (Rowson et al 1969), nÕest vŽritablement devenu une pra- tique dÕŽlevage quÕavec la mise au point dÕune mŽthode de transplantation adaptŽe de lÕinsŽ- mination artificielle (IA), consistant ˆ dŽposer lÕembryon au-delˆ du col de lÕutŽrus, par voie vaginale (Renard et al 1977). Avec cette approche, en moyenne 60 % des femelles deviennent gestantes apr•s transfert dÕun embryon et 56 % mettent bas (tableau 1a), un rendement identique ˆ celui de lÕinsŽmination artificielle (52 % apr•s une IA, Boichard et Manfredi 1995).
Le nombre de transplantations dÕembryons bovins conna”t ces derni•res annŽes une pro- gression rŽguli•re en Europe et en France (tableau 2), mais ce nombre reste tr•s faible par rapport ˆ celui des insŽminations artifi- cielles (23 millions en Europe, dont 5 millions en France en 1995 ; Malafosse 1995). Toute- fois, ce nÕest pas tant le nombre de transplan- tations effectuŽes qui donne aujourdÕhui son importance ˆ cette technologie, que la place quÕelle occupe dŽsormais dans la fili•re de la sŽlection bovine : pr•s de 95 % des taureaux laitiers actuellement mis en testage sont en effet issus dÕembryons transplantŽs (le plus souvent congelŽs). Ce chiffre illustre bien lÕim- pact de cette biotechnologie dans la conduite des programmes de sŽlection.
La transplantation dÕembryons est mainte- nant Žtroitement associŽe ˆ la congŽlation, le Transfert nucléaire
"clonage"
Collecte des ovocytes
"Ovum Pick-Up "
Fécondation in vitro
Culture
Transplantation
Superovulation, fécondation et collecte in vivo
Sexage
Congélation
Culture cellulaire
Modifications génétiques Foetus
Gonades
Jeune Adulte Ovocyte
Morula
Blastocyte Zygote Stade de développement
Figure 1. Les principales biotechnologies de l’embryon.
plus souvent au stade blastocyste, par des mŽthodes compatibles avec une dŽcongŽlation rŽalisŽe juste avant la transplantation (Renard et al 1982). En Europe, 47 % des embryons rŽcoltŽs (46 % en France) sont congelŽs avant dÕ•tre transplantŽs (tableau 2).
Un taux moyen de mise bas de 46 % (cf.
tableau 1a) est obtenu quand on ne cong•le que les embryons dÕaspect morphologique nor- mal (qualitŽs 1 et 2) qui reprŽsentent environ 72 % des embryons collectŽs (cf. tableau 1b).
La congŽlation a permis une rŽduction du cožt des interventions puisque le nombre de femelles receveuses quÕil faut prŽparer peut
•tre ajustŽ au nombre dÕembryons collectŽs.
Elle a ouvert la voie aux Žchanges dÕembryons entre Žlevages (de tous pays) et commence ˆ
•tre utilisŽe en complŽment du maintien dÕanimaux vivants pour conserver la diversitŽ gŽnŽtique des races domestiques (Ollivier et Renard 1995).
Le typage gŽnŽtique des embryons avant leur transplantation peut •tre rŽalisŽ en prŽ- levant par micromanipulation 1 ˆ 4 cellules
sur des embryons au stade morula ou jeune blastocyste (J6 et J7). Quand lÕopŽration est effectuŽe par une personne expŽrimentŽe, lÕaptitude de lÕembryon biopsiŽ ˆ se dŽvelop- per ˆ terme apr•s transfert dans une femelle receveuse nÕest pas altŽrŽe. Cette approche a ŽtŽ mise en Ïuvre chez les bovins, essentielle- ment ˆ ce jour pour un diagnostic du sexe de lÕembryon avant son transfert. Le Ç sexage È a pu devenir une rŽalitŽ gr‰ce ˆ lÕisolement de sondes gŽnomiques spŽcifiques du chromo- some Y dont la prŽsence est dŽtectŽe dans le gŽnome des cellules isolŽes dÕembryons m‰les (Leonard et al 1987). Le diagnostic du sexe peut •tre portŽ pour 95 % des embryons biop- siŽs et son exactitude est voisine de 100 %. En moyenne 4 embryons par femelle et par trai- tement ont la qualitŽ morphologique requise (qualitŽ 1) pour supporter une biopsie sans rŽduction de viabilitŽ (53 %) ; avec les autres embryons (qualitŽ 2), le taux de gestation apr•s biopsie est plus faible (34 %). On peut donc considŽrer quÕenviron 60 % des embryons utilisables pour la transplantation
Le nombre de transplantations dÕembryons progresse en France et en Europe.
Pr•s de la moitiŽ sont rŽalisŽes avec des embryons congelŽs.
Tableau 1. Principales caractéristiques du transfert d’embryons bovins produits in vivo.
a - Taux de gestation et estimation du nombre moyen de veaux par femelle donneuse et par traitement.
Type dÕembryon Taux de gestation Taux de mise bas (estimations)
Nombre moyen de veaux (estimations)
Frais estimation 60 % 56 % 5,6(2)x 56 %)= 3,1
CongelŽ estimation 50 % 46 % 5,6(2)x 46 %)= 2,6
Frais et sexŽ 377/833(1)45 % 41 % 0,5 x (5,6(2)x 41 %) = 1,1
SexŽ et congelŽ 26/92(1)28 % 24 % 0,5 x (4(3)x 24 %) = 0,5
(1) DÕapr•s Thibier et Nibart (1995).
(2) Nombre moyen dÕembryons utilisables par traitement.
(3) Nombre moyen dÕembryons de qualitŽ 1 seulement.
b - Nombre moyen (± s.e.) dÕembryons utilisables par femelle et par traitement (Negrao et al 1 997, P. Humblot, donnŽes non publiŽes).
Nombre total 7,8 ± 5,6
Utilisables (%) 5,6 ± 5,2 (72 %) dont : qualitŽ 1 : 4,0 (estimation) ; qualitŽ 2 : 1,6 (estimation) QualitŽ 1 : aucun dŽfaut de morphologie ; qualitŽ 2 : quelques dŽfauts, cellules exclues du dŽveloppement.
c - Distribution des femelles selon le nombre dÕembryons utilisables par traitement (P. Humblot et M. Nibart, commu- nications personnelles).
Nombre dÕembryons 0 moins de 3 3 ˆ 6 plus de 6
% femelles 20 % 10 % 45 % 25 %
Tableau 2. Evolution récente de l’activité de transfert d’embryons bovins en Europe et en France (source : Association Européenne de Transfert Embryonnaire (AETE), 1993-1996).
1993 1994 1995 1996
Nb de femelles collectŽes 121 542(48 %) + 4,7 % 122 557(48 %) + 11,1 % 125 075(48 %) Ð 3,7 % 124 133(48 %)
dont en France 116 680(48 %) 115 890(48 %) 116 680(48 %) 116 657(48 %)
Nb dÕembryons collectŽs 176 470(48 %) 194 589(48 %) 215 046(48 %) 214 293(48 %)
dont en France 150 270(48 %) 155 249(48 %) 160 298(48 %) 156 797(48 %)
Nb dÕembryons transplantŽs 196 470(48 %) + 6,6 % 102 887(48 %) + 9,3 % 112 531(48 %) + 4,8 % 117 942(48 %)
dont congelŽs (%) 146 263 (48 %) 154 485 (53 %) 160 848 (54 %) 155 786 (47 %)
dont nb transplantŽs en France 122 744(48 %) 124 288(48 %) 127 260(48 %) 128 793(48 %)
dont congelŽs (%) 119 915 (44 %) 110 664 (44 %) 112 505 (46 %) 113 105 (46 %)
Stock dÕembryons congelŽs 146 986(48 %) + 2,3 % 148 062(48 %) + 29,0 % 162 008(48 %) Ð 11,9 % 154 586(48 %)
dont en France 114 404(48 %) 114 404(48 %) 119 803(48 %) 112 396(48 %)
dÕembryons peuvent subir une biopsie (Thi- bier et Nibart 1995, Nibart et al 1996). Le nombre moyen de veaux sexŽs que lÕon peut obtenir par femelle donneuse et par traite- ment en associant le diagnostic de sexe nÕest donc en moyenne seulement que de 2,2 soit moins quÕapr•s transplantation dÕembryons non sexŽs (cf. tableau 1a). Le cožt du veau produit en est dÕautant augmentŽ. Enfin, lÕas- sociation avec la congŽlation rŽalisŽe apr•s la biopsie, quoique compatible avec le maintien de la viabilitŽ de lÕembryon se traduit en moyenne par un taux de gestation faible, de lÕordre de 25 %, ce qui constitue une limite supplŽmentaire pour lÕapplication du sexage en Žlevage. Ainsi, malgrŽ lÕengouement quÕa suscitŽ en France le diagnostic de sexe appli- quŽ ces derni•res annŽes ˆ plus de 3 000 embryons bovins (Thibier et Nibart 1995), son intŽr•t Žconomique reste tr•s marginal. Cette approche pourrait dans lÕavenir se rŽvŽler tr•s utile, mais pour caractŽriser simultanŽment la prŽsence de variants allŽliques de plusieurs g•nes, ce qui est techniquement possible ˆ partir dÕun m•me prŽl•vement.
Deux facteurs limitent aujourdÕhui lÕeffica- citŽ de la transplantation : le nombre relative- ment faible dÕembryons que lÕon obtient apr•s un traitement hormonal de superovulation et la variabilitŽ de production entre femelles traitŽes. Aucun progr•s dŽcisif nÕa ŽtŽ rŽalisŽ depuis plus de vingt ans dans ce domaine.
Une femelle donneuse donne en moyenne 7 ˆ 8 embryons par traitement mais seulement 5 ˆ 6 dÕentre eux (embryons de qualitŽ 1 et 2) ont de rŽelles chances de se dŽvelopper ˆ terme apr•s transfert (cf tableau 1b). En outre, 20 ˆ 30 % des femelles traitŽes ne don- nent pas dÕembryons transfŽrables (Greve et al 1995), alors que 25 % produisent plus de 6 embryons ce qui limite les possibilitŽs de planification rigoureuse du nombre de femelles receveuses (tableau 1c). Il en rŽsulte un cožt technique environ 10 fois plus ŽlevŽ que celui de lÕinsŽmination artificielle (Chu- pin 1985). CÕest ce qui explique pourquoi la transplantation dÕembryon nÕest utilisŽe que pour la naissance de veaux dont la valeur gŽnŽtique est ŽlevŽe, permettant ainsi une diffusion efficace des meilleurs gŽnotypes.
2
.2/ Une contribution
ˆ la rŽnovation des schŽmas de sŽlection
La transplantation embryonnaire mise au point chez les bovins depuis la fin des annŽes 70 a crŽŽ incontestablement, depuis le dŽbut des annŽes 1980, des opportunitŽs nouvelles pour la rŽnovation des schŽmas de sŽlection.
En effet, malgrŽ les handicaps dus au nombre relativement faible dÕembryons utilisables par traitement, et malgrŽ le fait quÕune partie des femelles donneuses ne produit aucun embryon, la technique contribue ˆ augmenter de plus de 70 % la prolificitŽ des femelles qui rŽpondent le mieux au traitement. Elle per- met aussi de rŽduire notablement lÕintervalle de gŽnŽration puisque les collectes prŽcoces
dÕembryons sont possibles sur des gŽnisses de 15 mois. Ainsi, alors quÕavec la reproduction naturelle, une vache a produit en moyenne 3 veaux ˆ lÕ‰ge de 6 ans, ce m•me rŽsultat peut •tre obtenu d•s lÕ‰ge de 2 ans avec la transplantation. La transplantation embryon- naire peut donc •tre mise ˆ profit pour inten- sifier la sŽlection des m•res des taureaux dÕinsŽmination. En effet, le rajeunissement des m•res permet de tirer parti plus rapide- ment du meilleur niveau gŽnŽtique moyen des jeunes gŽnŽrations. LÕamŽlioration de la proli- ficitŽ permet de sŽlectionner les m•res plus intensŽment pour assurer les besoins de renouvellement (figure 2). Au total, ces deux facteurs contribuent ˆ augmenter le progr•s gŽnŽtique annuel de lÕordre de 20 ˆ 30 % pour un crit•re comme la production laiti•re (Nicholas et Smith 1983, Colleau 1985, Meu- wissen 1990, Nicholas 1996) et dÕune propor- tion encore supŽrieure en ce qui concerne les programmes de sŽlection des bovins allaitants (Colleau et Elsen 1988). Les parties du pro- gramme de sŽlection concernant les m‰les sont alors inchangŽes, notamment le contr™le de la descendance (testage).
Nicholas et Smith (1983) ont proposŽ dÕutili- ser la transplantation embryonnaire en apportant des modifications aux schŽmas de sŽlection classiques : sŽlection des reproduc- teurs dans des troupeaux spŽcialisŽs et sŽlec- tion des taureaux ˆ lÕ‰ge de 4 ans et non plus de 6 ans, ˆ partir des performances de leurs
Génisses 18 mois
Taureaux d'insémination
6 ans
Veaux issus de transfert d'embryons
Femelles Mâles
élevage en ferme
élevage en station
fin de 1ère lactation
à 3 ans
Mise en testage Tri des veaux de 1 an
Collecte d'embryons Transplantation
X
Fin du testage 6 ans
Figure 2. Programme de sélection utilisant la transplantation embryonnaire chez les bovins laitiers.
collatŽrales (demi-sÏurs et pleines-sÏurs). En fait, ceci nÕest justifiŽ que si le contr™le de per- formances en ferme est peu fiable ou sÕil existe un traitement prŽfŽrentiel des femelles (par exemple utilisation non dŽclarŽe dÕhor- mones) ce qui est encore peu frŽquent dans les pays dŽveloppŽs (Lohuis 1995).
LÕefficacitŽ de lÕutilisation de la transplanta- tion embryonnaire a dÕabord ŽtŽ ŽtudiŽe quand la sŽlection porte sur des caract•res hŽritables et dÕexpression non tardive comme la production laiti•re. Les schŽmas de sŽlec- tion utilisant de jeunes m•res ˆ taureaux sont Žgalement efficaces quand la sŽlection porte sur des caract•res dÕexpression tardive comme la longŽvitŽ, caract•re potentiellement impor- tant Žconomiquement mais moins hŽritable que la production laiti•re, (Colleau et Phocas 1994). La raison est que les reproductrices sont sŽlectionnŽes pour de tels crit•res non dÕapr•s leurs propres performances (Ç censu- rŽes È, cÕest-ˆ-dire inconnues), mais dÕapr•s les caractŽristiques moyennes (taux de rŽformes constatŽs) de leurs tr•s nombreuses demi- sÏurs paternelles. On remarquera que la nŽcessitŽ de sŽlectionner sur de tels crit•res est un argument de plus pour ne pas aban- donner le testage sur descendance des tau- reaux.
LÕutilisation accŽlŽrŽe de la transplantation embryonnaire en complŽment de procŽdures classiques est actuellement la mŽthode la plus gŽnŽrale. On peut lÕobserver dans les pro- grammes de sŽlection mis en Ïuvre au Dane- mark, en France, en Allemagne et aux Pays- Bas (20 ˆ 30 % des taureaux laitiers sont issus de femelles jeunes). Les rŽsultats pra- tiques obtenus en France ont ŽtŽ conformes ˆ ce qui Žtait attendu (Colleau 1993). Concr•te- ment, on a observŽ que les index sur descen- dance de taureaux Holstein produits en France ˆ partir de jeunes m•res Žtaient Žqui- valents ˆ ceux de taureaux Holstein importŽs des USA (pays ayant le meilleur niveau gŽnŽ- tique laitier pour cette race) mais issus de m•res plus ‰gŽes.
Le rendement Žconomique des sommes investies collectivement dans le transfert embryonnaire pour lÕamŽlioration des tau-
reaux dÕinsŽmination est nettement positif alors que cela nÕest pas le cas pour un Žleveur individuel utilisant cette technique (Colleau 1993). Cette question sera prŽsentŽe plus en dŽtail au paragraphe 4.3.b.
2
.3/ La place actuelle du sexage des embryons
Le sexage des embryons nÕest pas utile dans le cadre de schŽmas o• les m•res de taureaux dÕinsŽmination ont bŽnŽficiŽ dÕun raccourcis- sement maximum de lÕintervalle de gŽnŽra- tion. La carri•re des m‰les dŽpendant de la connaissance de la lactation de leur m•re gŽnŽtique (figure 2), il faut attendre environ 6 mois avant de pouvoir dŽcider de leur utili- sation. Le recours systŽmatique ˆ de jeunes donneuses (sans sexage) serait alors associŽ ˆ des cožts importants, car il faudrait Žlever tous les jeunes m‰les pendant la pŽriode dÕat- tente des rŽsultats de leur m•re. Des Žtudes thŽoriques (tableau 3, Colleau 1991) montrent que m•me en tenant compte du surcožt tech- nique liŽ au sexage des embryons, on a intŽr•t ˆ utiliser des donneuses plus ‰gŽes, sŽlection- nŽes dÕapr•s leurs premi•res lactations, et ˆ sexer leurs embryons de fa•on ˆ produire exactement le nombre de m‰les ˆ mettre au testage. En effet, la rŽduction relative des cožts totaux (transfert dÕembryons et frais dÕŽlevage des jeunes obtenus) est bien plus importante que la rŽduction de progr•s gŽnŽ- tique provenant du rŽallongement de lÕinter- valle de gŽnŽration.
AujourdÕhui, le diagnostic du sexe de lÕem- bryon est tr•s peu utilisŽ dans les schŽmas dÕamŽlioration gŽnŽtique. Le cožt du veau produit reste dissuasif, et le fait que seule- ment 60 % des embryons jugŽs aptes ˆ la transplantation puissent •tre Ç sexŽs È consti- tue une perte Žconomique non nŽgligeable. En race Holstein par exemple, dans laquelle 30 % environ des taureaux sont issus dÕembryons importŽs (congelŽs mais non sexŽs) les sŽlec- tionneurs prŽf•rent utiliser tous les embryons, les jeunes m‰les Žtant mis en tes- tage et les femelles superovulŽes. Le recours au diagnostic de sexe des embryons permet-
La collecte prŽcoce dÕembryons et le nombre plus ŽlevŽ de veaux produits, et donc testŽs, permettent une sŽlection plus efficace.
Tableau 3. Bilan génétique et bilan économique du sexage d’embryons chez les bovins laitiers. Bilan génétique = % d’augmentation du progrès génétique annuel par rapport au schéma classique ; bilan économique = kF par taureau mis en testage. (J.-J. Colleau 1 994, non publié).
Type de schŽma
Cožt (kF /taureau)
Cožt total en %
Progr•s gŽnŽtique annuel TE Station en %
0-1 an
Station 0-6 ans Total
Classique 0 30 250 280 0 0
(rŽfŽrence) (rŽfŽrence) Transfert embryonnaire (TE)
- donneuses : gŽnisses, pas de sexage,
20 embryons produits par taureau en testage 20 120 250 390 + 40 % + 20 % - donneuses : vaches en 2elactation,
10 embryons femelles (sexŽs) produits
par taureau en testage 30 30 250 310 + 11 % + 17 %
trait toutefois de valoriser dÕautres biotechno- logies comme le clonage de lÕembryon (Hey- man et al1996).
3 / La production dÕembryons in vitro
3
.1/ Un nouveau dŽveloppement pour le transfert dÕembryons
Trois Žtapes jalonnent la longue pŽriode qui a permis ˆ la production dÕembryons bovins in vitro de pouvoir •tre considŽrŽe comme une biotechnologie parvenue ˆ maturitŽ : la dŽfini- tion de milieux synthŽtiques adaptŽs aux besoins mŽtaboliques de lÕembryon bovin au dŽbut de son dŽveloppement (Menezo 1976) ; les premiers succ•s dans la mise en Ïuvre des techniques de fŽcondation in vitro, (FIV) ini- tialement ˆ partir dÕovocytes collectŽs in vivo (Brackett et al 1982), puis eux-m•mes pro- duits in vitro par ponctions dÕovaires rŽcupŽ- rŽs en abattoir (Leibfried-Rutledge et al1987)
; enfin, le dŽveloppement dÕune mŽthode de rŽcolte des ovocytes sur animal vivant par ponction ŽchoguidŽe des follicules ovariens (Pieterse et al1988). Cette mŽthode, dite OPU pour Ç Ovum Pick Up È, est directement dŽri- vŽe de celle utilisŽe en routine en clinique humaine.
La collecte est rŽalisŽe ˆ lÕaide dÕune aiguille introduite par le vagin sur lÕanimal debout et sous simple tranquillisant et anes- thŽsie locale. LÕopŽration peut •tre rŽpŽtŽe une ˆ deux fois par semaine pendant plu- sieurs mois (jusquÕˆ cinq) sans affecter appa- remment la fertilitŽ ultŽrieure des animaux (Nibart et Marquant-Leguienne 1995). Cette technique prŽsente deux avantages par rap- port ˆ la collecte dÕembryons in vivo. Tout dÕabord, elle permet de produire des blasto- cystes ˆ partir de femelles considŽrŽes comme infertiles ou nÕayant pas rŽpondu ˆ des traite-
ments de superovulation, donc de maintenir lÕensemble du pool de g•nes formŽ par les ani- maux engagŽs dans un programme de sŽlec- tion (ou de conservation) gŽnŽtique. Ensuite, elle peut •tre employŽe tout au long des trois premiers mois de la gestation (gŽnisses ou vaches), donc ne pas interfŽrer avec la conduite de la reproduction des animaux au sein dÕun troupeau. En pratique, les sessions dÕOPU sont aujourdÕhui rŽalisŽes soit une fois par semaine avec des animaux superovulŽs, soit deux fois par semaine, sans superovula- tion. Dans tous les cas, le nombre dÕovocytes et donc dÕembryons viables produits par col- lecte est tr•s variable dÕun animal ˆ lÕautre (et aussi dÕune Žquipe ˆ lÕautre). Un bilan de la production dÕembryons est prŽsentŽ au tableau 4 pour des animaux de diffŽrents sta- tuts physiologiques.
En moyenne, on peut considŽrer que la technologie de lÕOPU permet de produire 0,7 ˆ 2 blastocystes par session. Pour des vaches laiti•res en production, des sessions bihebdo- madaires de prŽl•vement, pendant 4 mois consŽcutifs, permettent dÕobtenir en moyenne 40 blastocystes transplantables par an, cer- tains animaux pouvant en produire plus de 120 (Merton, communication personnelle).
Les m•mes performances sont obtenues avec des femelles rŽputŽes infertiles pour les- quelles le rythme dÕune collecte par semaine est Žtendu sur la plus grande partie de lÕan- nŽe (Hasler et al 1995). Enfin, avec des gŽnisses collectŽes pendant deux mois en dŽbut de gestation, on obtient en moyenne 20 blastocystes. Ces donnŽes constituent une base pour estimer le potentiel dÕune technolo- gie encore rŽcente, mais en plein dŽveloppe- ment (tableau 5). Avec un taux de gestation ˆ terme de 50 %, une vache laiti•re donnera en moyenne 20 veaux par an, soit 5 fois plus que ne le permet la collecte in vivo apr•s traite- ment hormonal des femelles. Une gŽnisse pourra •tre la m•re gŽnŽtique de dix veaux avant la fin de sa premi•re gestation. La ma”- trise compl•te de cette technique passe
Tableau 4. Production d’embryons in vitro après récolte des ovocytes (OPU) ; principales données physiologiques.
RŽfŽrence Type dÕanimaux (n)
Sessions de prŽl•vement Nombre moyen dÕembryons transfŽrables produits par femelle FrŽquence Nb moyen par
femelle (Žcarts)
par session (Žcarts)
total (Žcarts) Hasler et al Žchecs production 1 par semaine 22,6 0,73(2) 41,3(2) 1995 dÕembryons 8 mois par an(1) (6 - 31)(1) (0,33 - 1,86) (7 - 97)
in vivo(n = 6)
Den Daas et al vaches laiti•res 2 par semaine 29,9 1,33 37,4
(non publiŽ) (n = 63) 4 mois par an (3 - 91) (0,33 - 2,67) (1 - 128)
Donnay et al gŽnisses 2 par semaine 16 1,6 20
1996 (n = 6) pendant 2 mois (8 - 35)
INRA 1997 gŽnisses 2 par semaine 12 2,04 24
(non publiŽ) (n = 5) pendant 1,5 mois (0,5 - 3,16) (6 -37)
(1) Estimation.
(2) Calcul pour une annŽe ˆ partir dÕun travail conduit sur 2,5 ans.
aujourdÕhui par une comprŽhension fine des effets ˆ long terme que peuvent exercer les milieux de culture sur le dŽveloppement du fÏtus voire du jeune une fois nŽ. En effet il a ŽtŽ montrŽ rŽcemment chez les bovins (mais aussi chez les ovins) que certaines conditions de fŽcondation et de culture in vitro, encore mal connues, pouvaient, occasionnellement,
•tre responsables de la naissance de veaux viables mais de poids anormalement ŽlevŽ (Behboodi et al1995), ou m•me de dŽviations du sex-ratio en faveur des m‰les (Xu et al 1992), ce dernier effet nÕŽtant toutefois pas systŽmatiquement observŽ (Keefer et al1994, Grisard et al1995).
3
.2/ Cožt de lÕembryon produit par OPU/FIV
Les premi•res estimations faisaient Žtat dÕun cožt du veau produit apr•s OPU-FIV dÕenviron le double de celui dÕun veau issu dÕembryon produit in vivo (Nibart et Mar- quant-Leguienne 1995) et soulignaient lÕim- portance du cožt de main dÕÏuvre pour cette technique. Toutefois, une organisation en sta- tion spŽcialisŽe pour la production et lÕutilisa- tion dÕembryons exclusivement produits in vitropermet de tirer le meilleur parti des pos- sibilitŽs de cette technique. Sur la base des donnŽes Žtablies dans le cadre dÕun pro- gramme mis en place depuis un an en station expŽrimentale (Domaine expŽrimental INRA de Bressonvilliers) et ˆ raison de deux ses- sions dÕOPU/FIV par semaine sur des sŽries de 5 animaux, il ressort que le prix de revient du veau issu dÕOPU-FIV est seulement 1,2 fois celui du veau issu de transplantation embryonnaire classique (Y. Heyman et al, en prŽparation). Cette estimation prend en compte le cožt de main dÕÏuvre (40 % environ du cožt total), mais pas celui de lÕamortisse- ment des installations dont une utilisation optimale est obtenue en associant lÕactivitŽ dÕOPU-FIV ˆ celle du clonage (voir plus loin).
Le volume dÕactivitŽ annuel est dŽterminant, et une rŽduction du cožt de 30 ˆ 40 % peut m•me •tre envisagŽe ˆ partir dÕune produc- tion rŽguli•re dÕembryons tout au long de lÕan- nŽe en augmentant le nombre de sessions dÕOPU/FIV par semaine.
3
.3/ Les consŽquences pour la sŽlection
La technique de lÕOPU-FIV prŽsente trois intŽr•ts principaux pour la sŽlection. A raison de deux sessions dÕOPU par semaine et dÕen- viron 1,5 embryon transfŽrable par session, le nombre de veaux qui peut •tre obtenu par unitŽ de temps est pratiquement multipliŽ par 4 par rapport au nombre de veaux pro- duits apr•s superovulation et collecte clas- sique. Il devient donc possible dÕaugmenter encore la pression de sŽlection sur les m•res ˆ taureaux.
Le deuxi•me intŽr•t est dÕamŽliorer lÕeffica- citŽ de la sŽlection m•me en raisonnant ˆ niveau constant de prolificitŽ. En effet, lÕOPU- FIV permet de rŽaliser des Ç accouplements in vitroÈ et donc de mieux planifier le choix des reproducteurs m‰les (ˆ la limite ovocyte par ovocyte). On peut en particulier augmenter considŽrablement le nombre de m‰les accou- plŽs ˆ une m•me femelle, nombre qui nÕest pas tr•s ŽlevŽ en superovulation classique (Žgal au maximum au nombre de collectes).
Ceci a pour effet dÕamŽliorer la prŽcision des index de sŽlection (meilleure Ç connexion È entre reproducteurs) et surtout de diminuer la parentŽ moyenne entre les produits de la gŽnŽration suivante, ceux-ci ayant plus rare- ment leurs deux parents communs. De ce fait, le taux de consanguinitŽ ˆ long terme est diminuŽ et avec lui le risque de voir appa- ra”tre une fixation fortuite de g•nes ˆ effets dŽfavorables. Woolliams (1989) montre dŽjˆ, avec la superovulation classique, quÕon a tout intŽr•t ˆ changer de taureau ˆ chaque col- lecte.
Un troisi•me intŽr•t potentiel de lÕOPU-FIV est quÕil devient possible dÕobtenir des descen- dants des femelles qui ne rŽpondent pas ˆ la superovulation. On ne dispose toutefois pas encore de donnŽes suffisantes sur les perfor- mances de telles femelles pour la production dÕembryons in vitro.
En cumulant tous les effets positifs de lÕOPU-FIV pour la sŽlection (et en anticipant sur son intŽr•t potentiel), Leitch et al (1995) trouvent que le rythme de progr•s gŽnŽtique annuel avec un schŽma OPU-FIV est supŽ-
LÕassociation de la ponction ovocytaire in vivo et de la
fŽcondation in vitro permettrait dÕobtenir en moyenne 5 veaux par donneuse et par mois.
Tableau 5. Estimation du nombre moyen de veaux produits par femelle donneuse et par an après récolte des ovocytes et fécondation in vitro (OPU/FIV) ; comparaison avec la production d’embryons in vivo.
OPU/FIV Collecte in vivo
Statut physiologique
Vaches en production GŽnisses Vaches/gŽnisses Collectes
- frŽquence 2 par semaine 2 par semaine 2 collectes
pendant 4 mois pendant 2 mois + superovulation
- nombre total par an 32 16 2
Nombre dÕembryons transfŽrables par an 40 20 11
% de femelles donnant plus de 3 embryons 100 % 100 % 70 %
Taux moyen de gestation 50 % 50 % 56 %
Nombre de veaux attendus 20 10 4
rieur de 10 ˆ 30 % ˆ celui dÕun schŽma avec superovulation et fŽcondation in vivo, les don- neuses ayant le m•me ‰ge dans les deux cas.
LÕOPU-FIV permet aussi de diminuer lÕ‰ge des donneuses par rapport ˆ la production dÕembryons in vivo car il est possible dÕeffec- tuer des ponctions rŽpŽtŽes dÕovocytes d•s lÕ‰ge de 9 mois. Ceci pourrait •tre considŽrŽ comme un avantage pour la rŽduction de lÕin- tervalle de gŽnŽration dans un programme de sŽlection. Mais m•me en admettant que de tels ovocytes aient des probabilitŽs de fŽcon- dation non diminuŽs, ce qui fait encore lÕobjet de donnŽes contradictoires (Revel et al 1995, Lazzari et al1996), lÕeffet dÕun tel raccourcis- sement de lÕintervalle de gŽnŽration serait nul sur le progr•s gŽnŽtique annuel. En effet, les descendants na”traient beaucoup trop t™t par rapport ˆ la connaissance des performances de la donneuse (lactation notamment) et celle- ci serait donc insuffisamment sŽlectionnŽe, parce quÕŽvaluŽe avec une prŽcision trop faible.
LÕOPU-FIV est incontestablement une tech- nique dont peuvent bŽnŽficier les schŽmas dÕamŽlioration gŽnŽtique des reproducteurs. Il importe maintenant de dŽfinir les conditions de mise en Ïuvre pour son dŽveloppement, notamment en ce qui concerne les normes techniques et sanitaires ˆ respecter lors des sessions de ponction. Il reste aussi ˆ confir- mer quÕune organisation efficace dÕun Ç atelier È de production dÕembryons in vitro permet bien de ramener le cožt du veau ˆ celui que lÕon obtient aujourdÕhui en transplantation embryonnaire classique. Mais il faudra pour cela amŽliorer les mŽthodes de congŽlation de ces embryons, dont les taux de survie apr•s dŽcongŽlation sont aujourdÕhui encore large- ment infŽrieurs ˆ ceux des embryons produits in vivo.
4 / Les perspectives
dÕapplication des techniques de clonage
4
.1/ Une technologie en pleine Žvolution
Cloner signifie reproduire ˆ lÕidentique, en plusieurs exemplaires. CÕest, en biologie, le contraire de la reproduction sexuŽe qui per- met la naissance dÕorganismes gŽnŽtiquement diffŽrents. Le clonage chez les mammif•res a dÕabord ŽtŽ rŽalisŽ par une simple division dÕun embryon ˆ un stade prŽcoce de son dŽve- loppement (Willadsen 1979, Ozil et al 1982).
Cette technique ne permet dÕobtenir que deux individus gŽnŽtiquement identiques, mais ˆ une frŽquence ŽlevŽe puisque un embryon manipulŽ sur quatre, voire sur deux, donne naissance ˆ une paire de jumeaux (ChesnŽ et al1987). La bissection de lÕembryon est main- tenant surtout utilisŽe en expŽrimentation animale (Romeyer et al 1993, McKeever et al 1994).
Le terme de clone est de fait employŽ aujourdÕhui pour dŽsigner un animal produit par la technique dite de Ç transfert nuclŽaire È. Cette technique, utilisŽe de longue date chez les amphibiens pour des tentatives de reprogrammation de lÕactivitŽ de noyaux somatiques (Gurdon et al 1975, DiBerardino et al 1986), consiste ˆ fusionner une cellule donneuse de noyau avec un ovocyte receveur prŽalablement ŽnuclŽŽ. Les premiers succ•s obtenus chez les mammif•res il y a une dizaine dÕannŽes avec des noyaux de jeunes embryons ovins (Willadsen 1986) puis bovins (Prather et al1987) ont maintenant ŽtŽ Žten- dus ˆ plusieurs esp•ces (voir pour revues rŽcentes Loi et al 1994, Heyman et Renard 1996). La technique de transfert de noyaux dÕembryons a connu, au dŽbut des annŽes 90 chez les bovins, un engouement commercial.
Plusieurs compagnies privŽes ont, ˆ cette Žpoque, fait na”tre plusieurs centaines de veaux dont un clone Ç record È de 11 animaux.
LÕanalyse des rŽsultats publiŽs (Bondioli et al 1990, Willadsen et al1991) montre toutefois une tr•s grande variabilitŽ ˆ la fois dans le taux de dŽveloppement des embryons recons- tituŽs (0 ˆ 40 %) et dans les taux de gestation apr•s transfert (0 ˆ 30 %). Ceci explique lar- gement le relatif dŽsintŽr•t quÕa connu le clo- nage ultŽrieurement en dŽpit des progr•s de la recherche. Les annonces rŽcentes et large- ment mŽdiatisŽes de la naissance dÕun clone de deux agneaux issus de cellules cultivŽes (Campbell et al 1996), puis dÕun mouton reconstituŽ ˆ partir dÕun noyau issu de cel- lules somatiques adultes maintenues en cul- ture pendant plusieurs semaines (Wilmut et al1997) attestent bien de lÕŽvolution en cours.
Les possibilitŽs offertes par le clonage peu- vent •tre estimŽes ˆ partir de deux para- m•tres : le nombre de jeunes nŽs par rapport au nombre dÕembryons reconstituŽs et la pro- babilitŽ dÕobtention dÕun clone de taille don- nŽe ˆ partir dÕun gŽnotype donnŽ. Le premier param•tre (tableau 6) mesure directement lÕefficacitŽ de la technique. AujourdÕhui, en moyenne 10 % des embryons reconstituŽs ˆ partir de noyaux dÕembryons peuvent donner naissance ˆ un veau. Ce taux a ŽtŽ multipliŽ par plus de deux en quelques annŽes et se rapproche de celui de la fŽcondation in vitro (environ 15 %, Hasler et al1995). Le taux de naissance obtenu avec des noyaux de cellules cultivŽes est certes encore tr•s faible (0,3 % avec des cellules adultes) ; beaucoup dÕem- bryons reconstituŽs ont leur dŽveloppement qui sÕarr•te d•s le stade 8-16 cellules, au moment o• leur gŽnome devient transcrip- tionnellement actif. Avec ceux qui poursuivent leur dŽveloppement, on observe souvent apr•s transplantation des mortalitŽs fÏtales tar- dives. Toutefois, dans certaines conditions expŽrimentales actuellement en cours de dŽfi- nition, il appara”t que des noyaux issus de cel- lules somatiques cultivŽes peuvent donner un taux de blastocystes ŽlevŽ (plus de 30 % ˆ par- tir de cellules fÏtales par exemple) ce qui rŽv•le un pouvoir important de reprogramma- tion de lÕactivitŽ des g•nes par le cytoplasme de lÕÏuf. Une meilleure connaissance des ŽvŽ-
nements fondamentaux qui prŽsident ˆ lÕorga- nisation du noyau et contr™lent lÕacc•s des fac- teurs impliquŽs dans lÕexpression des g•nes reste ˆ acquŽrir, notamment pour prŽvenir les mortalitŽs embryonnaires ŽlevŽes que lÕon constate apr•s transplantation. Il appara”t nŽanmoins justifiŽ, au vu de ces rŽsultats, de prŽvoir que la technique sera ma”trisŽe avec un succ•s proche de celui de lÕOPU-FIV.
Les taux de multiplication apr•s clonage dif- f•rent selon la source de cellules utilisŽes et aussi entre sŽries expŽrimentales. Le tableau 7 donne une estimation de la distribution du nombre de veaux produits par embryon don- neur au stade morula (40 ˆ 60 cellules envi- ron) et permet donc de prŽciser quelle est la probabilitŽ, aujourdÕhui, dÕobtenir un clone dÕanimaux ˆ partir dÕun gŽnotype donnŽ. Dans cette expŽrience, une partie des embryons issus de transfert de noyaux a ŽtŽ rŽutilisŽe pour un deuxi•me cycle de transfert nuclŽaire (reclonage), les progr•s rŽalisŽs dans la ma”- trise de la technique autorisant un tel recy- clage (un seul toutefois) sans diminution signi- ficative du rendement (Ectors et al 1995, Le
Bourhis et al1996). Cette approche rŽv•le que, en moyenne, 6 embryons sur 10 seulement seraient susceptibles de donner un clone de 2 ˆ 5 individus. Ceci sugg•re que les noyaux donneurs pourraient, selon leur gŽnotype, manifester des diffŽrences dÕaptitude ˆ •tre (correctement) reprogrammŽs. Ces diffŽrences se manifestent aussi avec des cultures pri- maires de cellules somatiques fÏtales (mou- ton, Campbell et al1996 ; vache, Vignon et al, donnŽes non publiŽes). A ce jour, ce type de noyau nÕa permis que la naissance occasion- nelle dÕun clone de deux agneaux (Campbell et al1996). Il est donc encore trop t™t pour dire si les cellules somatiques en culture, cellules fÏtales ou adultes, pourront effectivement permettre de multiplier tous les gŽnotypes voulus. Cette hypoth•se nÕest toutefois pas dŽraisonnable puisque les noyaux de cellules (fÏtales) ovines maintenues en culture pen- dant plusieurs semaines se rŽv•lent capables de conduire avec une frŽquence ŽlevŽe le dŽbut du dŽveloppement.
Compte tenu du nombre ŽlevŽ de noyaux somatiques de m•me gŽnotype (au moins plu-
La production de clones par
transfert de noyaux a actuellement un rendement faible.
AmŽliorer cette technique nŽcessite de mieux conna”tre le fonctionnement des facteurs
impliquŽs dans les relations noyau- cytoplasme et lÕexpression des g•nes au cours du dŽveloppement.
Tableau 6. Potentialités de développement des embryons issus de transfert nucléaire : rendement actuel de la technique (taux de jeunes nés par embryon reconstitué).
Nb dÕembryons reconstituŽs 152 840 239 385 172 277
Nb de blastocystes obtenus (%) 47 (30,9) 161 (19,1) 42 (17,5) 126 (32,7) 47 (27,3) 29 (10,4)
Nb transplantŽs 45 125 34 87 40 29
Nb de jeunes nŽs 15 (32,6) 27 (21,6) 8 (23,5) 4 (4,6) 3 (7,5) 1 (3,4)
Rendement(2) 10,0 % 4,1 % 4,1 % 1,5 % 2,0 % 0,3 %
Esp•ce Source de noyaux
RŽfŽrence
Bovin embryons 32-64c
Heyman et Renard 1996
Bovin embryons 16-32c
Bondioli 1993
Bovin c. embry.(1) Sims et First
1993
Ovin
c. embry.(1) c. fÏtale (1) c. adulte(1) Wilmut et al 1997
(1) Origine des cellules cultivŽes.
(2) (% blastocytes obtenus) x (% de jeunes nŽs).
Tableau 7. Potentialités de développement des embryons issus de transfert nucléaire. Distribution du nombre de veaux nés par embryon donneur de noyaux (Y. Heyman et al, données non publiées).
Embryon Nb de blastocystes
transplantŽs total gestantes mettant bas
Nb de receveuses Nb de veaux nŽs
A 36 18 7 4 4
B 7 4 2 1 1
C 13 12 7 6 6
D 5 5 1 0 0
E 6 5 3 1 1
F 8 6 3 1 1
G 14 7 5 4 5
H 7 7 4 3 3
I 9 5 3 2 2
J 3 2 2 2 3
K 10 6 3 2 3
L 10 5 2 0 0
M 18 9 3 2 2
Total 13 146 91 45 28 31
Nombre moyen (± s.e.) de blastocystes transplantŽs par embryon donneur 11,2 ± 8,5 Taux de mise bas apr•s transfert dÕembryons clonŽs 28/91 = 30,8 % ProbabilitŽ pour un embryon de donner un clone de 2 ˆ 5 veaux 8/13 = 61,5 %
sieurs milliers) qui peuvent •tre utilisŽs comme source de noyaux donneurs m•me apr•s une courte pŽriode de culture, on peut considŽrer que le rendement de 10 % obtenu aujourdÕhui avec les noyaux embryonnaires (nombre de veaux nŽs par rapport aux nombre dÕembryons reconstituŽs) suffirait pour que chaque gŽnotype puisse •tre utilisŽ avec le potentiel de multiplication dŽsirŽ. Le clonage de noyaux permettrait alors de diffuser un gŽnotype dŽjˆ bien caractŽrisŽ (clonage a pos- teriori) ou nouvellement crŽŽ par transgŽn•se, lors de la pŽriode de culture (cellules fÏtales ou embryonnaires). Seule la premi•re perspec- tive a ŽtŽ prise en compte dans cet article pour examiner les voies dÕapplication en sŽlection.
LÕutilisation de noyaux de cellules soma- tiques cultivŽes devrait donc ˆ terme contri- buer ˆ diminuer le cožt du clonage et per- mettre de fixer a priori, pour chaque gŽnotype, la taille du clone puisque la source de noyau deviendrait pour chaque gŽnotype abondante et ne serait donc plus un facteur limitant.
4
.2/ Cožt technique du clonage
Bien que le clonage soit encore largement une biotechnologie au stade de la recherche, il importe de commencer ˆ estimer son cožt pour anticiper sur les premiers dŽbuts dÕappli- cation. Aucune donnŽe nÕest actuellement dis- ponible sur ce sujet et seule une extrapolation ˆ partir du cožt dans un contexte dÕactivitŽ de recherche peut •tre envisagŽ. Les chiffres prŽ- sentŽs ci-dessous sÕappuient donc sur les rŽsultats acquis avec le clonage embryonnaire depuis trois ans, dans le cadre du programme conduit dans les installations de lÕINRA.
Sur la base dÕune activitŽ ˆ temps plein organisŽe ˆ partir dÕun atelier de production dÕembryons in vitro impliquŽ Žgalement dans un programme OPU-FIV, on peut, apr•s deux sessions de clonage ˆ partir de 4 embryons donneurs (sexŽs), reconstituer en moyenne 60 embryons qui donneront 20 blastocystes transplantŽs et finalement obtenir 6 veaux.
En prenant en compte tous les frais de fonc- tionnement et ceux de main dÕÏuvre (ˆ lÕex- ception toutefois de ceux liŽs ˆ lÕamortisse- ment des installations) le cožt du veau produit ˆ partir dÕun transfert de noyaux est 1,8 fois celui du veau issu dÕune transplanta- tion dÕembryon classique (Y. Heyman et al, en prŽparation).
4
.3/ Des voies dÕutilisation variŽes
Les applications qui vont •tre prŽsentŽes ne sont que potentielles dans le sens o• elles exi- gent que les techniques de base aient ŽtŽ suf- fisamment ma”trisŽes. Il faut pour cela au minimum garantir lÕefficacitŽ des techniques pour Žviter les alŽas trop importants lors de leur mise en Ïuvre ˆ grande Žchelle. LÕobten- tion dÕune naissance pour seulement 4 ˆ 5 embryons reconstituŽs nous para”t ˆ la fois un seuil ˆ atteindre et un objectif qui ne para”t plus aujourdÕhui irrŽaliste. Cette condition
reste toutefois sŽv•re dans le contexte scienti- fique et technique actuel et il importe de continuer ˆ donner une prioritŽ ˆ lÕacquisition de donnŽes scientifiques fondamentales visant ˆ beaucoup mieux comprendre la biolo- gie du dŽveloppement des embryons et les mŽcanismes liŽs ˆ la reprogrammation nuclŽaire. Ce prŽalable Žtant posŽ, nous avons tentŽ de dresser le bilan des bŽnŽfices et risques liŽs aux applications possibles dont la liste appara”t tr•s diversifiŽe.
a / AmŽlioration de la connaissance de la valeur gŽnŽtique
des reproducteurs
Exemple en production laiti•re (figure 3) La transplantation embryonnaire est utili- sŽe dans les schŽmas de sŽlection des bovins laitiers dans le cadre de lÕaccouplement de donneuses dÕŽlite avec des m‰les dÕŽlite. Le clonage dÕembryons femelles ainsi produits donnerait naissance ˆ des groupes de femelles gŽnŽtiquement identiques parmi lesquelles pourraient •tre choisies les futures donneuses destinŽes ˆ assurer la poursuite du pro- gramme dÕamŽlioration gŽnŽtique. Si lÕon consid•re la quantitŽ de lait produite par annŽe (coefficient dÕhŽritabilitŽ h2= 0,25), les calculs montrent que la prŽcision avec laquelle pourrait •tre estimŽe la valeur gŽnŽ- tique dÕun clone de seulement 5 femelles serait la m•me que pour un taureau ŽvaluŽ dÕapr•s les lactations de 25 de ses filles. LÕaug- mentation substantielle de la prŽcision par rapport ˆ celle obtenue ˆ partir dÕun animal seul est liŽe dÕune part ˆ la rŽpŽtition des
pères à taureaux donneuses
clones d'embryons
clones 1, 2 ... 200
congélation transfert
sélection sur performances clones 1, 2,... 10
décongélation et reclonage pour diffusion chez les éleveurs (clones 1, 2,.... 10)
X
...
1 2 3 200
...
1 2 3 200
Figure 3. Utilisation collective de clones femelles chez les bovins laitiers.
mesures de performances sur un m•me gŽno- type, et dÕautre part, au fait que les effets de milieu affectant les mesures sont indŽpen- dants dÕun individu ˆ lÕautre quand ceux-ci sont placŽs dans des Žlevages diffŽrents.
La prise en compte de ces effets dans des calculs de simulation (Colleau 1992, De BÏr et al1994, J.-J. Colleau 1997, non publiŽ) montre que le recours au clonage permet dÕaugmenter les progr•s gŽnŽtiques obtenus dans les pro- grammes de sŽlection intensifs qui font dŽjˆ appel ˆ la transplantation embryonnaire, m•me si le nombre total dÕembryons transfŽrŽs au sein de chaque programme reste inchangŽ (tableau 8). Dans cette simulation, seules les m•res ˆ taureaux sont clonŽes.
On constate que lÕefficacitŽ du clonage dŽpend des modalitŽs dans lesquelles il est effectuŽ : elle est maximale quand il est pos- sible de faire un clonage somatique de cellules de veau de 9 mois. A ce moment en effet, la lactation de la m•re est connue et lÕon peut donc continuer ˆ utiliser de jeunes m•res.
Quand le clonage somatique ne peut •tre fait que sur des cellules fÏtales, la lactation en cours de la m•re ne peut pas •tre bien connue (cela dŽpend en toute rigueur de lÕ‰ge du fÏtus). Il devient alors nŽcessaire dÕeffectuer ce clonage un cycle de reproduction plus tard, une fois cette lactation connue, ce qui am•ne ˆ allonger lÕintervalle de gŽnŽration et ˆ perdre alors une grande partie de lÕefficacitŽ gŽnŽtique du clonage.
Exemple en production de viande
La prise en compte dans les objectifs de sŽlection des bovins ˆ viande des crit•res de rendement et de qualitŽ de la carcasse, ainsi que des crit•res de qualitŽ de la viande conduit normalement aujourdÕhui ˆ tester les reproducteurs m‰les sur leur descendance.
Le recours au clonage permet alors dÕenvi- sager dÕabattre et dÕeffectuer directement des mesures sur les carcasses des clones du repro- ducteur et non plus sur celles de ses descen- dants. Au total, on utilisera moins dÕanimaux, mais leur cožt individuel de production sera plus ŽlevŽ. Si on souhaite maintenir le m•me cožt total pour lÕensemble du schŽma, on devra utiliser moins de clones que de descen- dants du reproducteur. Mais la prŽcision des index de sŽlection ne pourra •tre augmentŽe que si le cožt du clonage nÕest pas trop ŽlevŽ, car il y aurait trop peu de clones. On peut montrer, que pour un caract•re dont le coeffi- cient dÕhŽritabilitŽ est Žgal ˆ 0,4, la prŽcision des index de sŽlection est amŽliorŽe tant que le surcožt individuel liŽ au clonage nÕest pas supŽrieur ˆ 500 %. Ceci a beaucoup de chance dÕ•tre vŽrifiŽ si le cožt de base (cožt total dÕun animal normal jusquÕˆ son abattage) est ŽlevŽ, notamment ˆ cause dÕune durŽe dÕen- graissement importante.
b / Diffusion de gŽnotypes dÕŽlite bien connus
Deux situations peuvent •tre envisagŽes : - le gŽnotype est exprimŽ par un seul indi- vidu dont les performances sont connues.
LÕobjectif est de diffuser des g•nes intŽres- sants pour des caract•res dÕexpression tardive comme ceux impliquŽs dans la rŽsistance ˆ des maladies ou dans la longŽvitŽ. Le clonage envisagŽ est alors le clonage somatique ˆ par- tir de noyaux de cellules prŽlevŽes sur lÕani- mal adulte une fois connues ses performances
;
- le gŽnotype est exprimŽ par plusieurs indi- vidus. LÕobjectif est dÕutiliser les clones issus dÕaccouplements entre animaux dÕŽlite non pour le programme de sŽlection, mais pour la diffusion chez les Žleveurs. Dans le cadre du programme de sŽlection il nÕest pas nŽcessaire de recourir au clonage somatique, et le clo- nage dÕembryons peut suffire, mais la sŽlec- tion des clones pour la diffusion doit •tre ˆ la fois sŽv•re et prŽcise. Une fois les clones dÕŽlite produits et leurs performances connues, une diffusion ultŽrieure pourra •tre rŽalisŽe par clonage somatique, mais on peut aussi envisager le recours au clonage embryonnaire ˆ partir dÕembryons clonŽs prŽalablement congelŽs (clonage de 2egŽnŽra- tion) dans lÕattente des rŽsultats de lÕŽvalua- tion gŽnŽtique.
Le niveau dÕefficacitŽ Žconomique de la transplantation embryonnaire, en tant que technique est alors nettement amŽliorŽ (De BÏr et Arendonk 1994). Le tableau 9 prŽsente le rŽsultat de simulations (Colleau 1993) concernant le transfert ˆ la ferme de tels embryons. Le remplacement dÕembryons ordi- naires (issus du 1 % supŽrieur des vaches simples) par des embryons correspondant aux 10 % supŽrieurs des clones testŽs sur 5 vaches, entra”ne un meilleur niveau gŽnŽ- tique des gŽnisses nŽes de transfert. La simu- lation gŽnŽtique montre alors une augmenta- tion tr•s sensible (+ 64 %) des recettes liŽes ˆ la transplantation embryonnaire. Dans lÕhy- poth•se o• le prix de revient de lÕembryon clonŽ serait le m•me que celui de lÕembryon produit in vivo, le bilan financier au bout de 10 ans dÕune activitŽ continue de transfert ˆ la ferme (1 gŽnisse nŽe de transfert chaque annŽe) serait nŽgatif (Ð 14 %), mais toutefois bien moins que celui rŽsultant de lÕutilisation de la transplantation embryonnaire classique (Ð 50 %). Une rŽduction des prix de revient de la transplantation gr‰ce au clonage aurait un impact important puisque une baisse de 50 %
LÕutilisation du clonage permettrait dÕaugmenter les progr•s gŽnŽtiques obtenus avec les schŽmas de sŽlection utilisant dŽjˆ le transfert dÕembryons.
Tableau 8. Impact du clonage sur le progrès génétique annuel chez les bovins laitiers par rapport à un schéma utilisant le transfert d’embryons (TE) produits par des femelles de 2 ans.
Origine des noyaux donneurs
Age des femelles donneuses
Nb de veaux par clone(1)
Progr•s gŽnŽtique annuel par rapport ˆ un schŽma avec TE
Embryons 4 ans 3 + 5 %
5 + 10 %
Fibroblastes fÏtaux 4 ans 3 Ð 3 %
5 + 1 %
Fibroblastes de veaux 2 ans 3 + 21 %
5 + 27 %
(1) Chaque gŽnotype utilisŽ est supposŽ donner un clone de taille constante.
des cožts permettrait dÕobtenir un bilan financier largement positif (+ 74 %).
c / Diffusion de clones Ç terminaux È Il sÕagit ici dÕanimaux qui ne sont pas utili- sŽs ultŽrieurement pour la reproduction, mais engagŽs par exemple dans des syst•mes de production de viande exigeant une qualitŽ uniforme et une rŽgularitŽ dÕapprovisionne- ment de marchŽs tr•s ciblŽs (syst•me ˆ la base des labels de production). Le testage puis la sŽlection de clones dans une lignŽe termi- nale ˆ seule fin de diffusion (et non de sŽlec- tion intra lignŽe) permettrait de satisfaire ˆ ces exigences, en diminuant la variabilitŽ de qualitŽ du produit offert au consommateur (cette variabilitŽ nÕŽtant toutefois pas suppri- mŽe ˆ cause de lÕinfluence des facteurs de variation non gŽnŽtiques toujours prŽsents).
Les cožts induits par ce mode de production devront alors •tre confrontŽs aux prix que les consommateurs seraient pr•ts ˆ payer, une fois constatŽes la supŽrioritŽ et la rŽgularitŽ de la qualitŽ.
d / Gestion gŽnŽtique
Une des objections ou inquiŽtudes frŽquem- ment ŽvoquŽes ˆ propos du clonage est le risque de disparition plus rapide de la varia- bilitŽ gŽnŽtique. Comme mentionnŽ prŽcŽ- demment, le clonage envisagŽ pour la crŽation du progr•s gŽnŽtique ˆ partir dÕaccouplements raisonnŽs entre animaux dÕŽlite a peu dÕeffet sur la perte de g•nes. Par simulation, on a montrŽ (Colleau 1992) que cet effet dŽfavo- rable, hypothŽtique, Žtait largement infŽrieur ˆ celui, bien rŽel aujourdÕhui, qui rŽsulte de lÕutilisation massive dÕun petit nombre de m‰les dÕinsŽmination artificielle.
Pour les autres applications qui pourraient faire appel ˆ un grand nombre de clones, des prŽcautions devront •tre envisagŽes, et un encadrement de la technologie fixant les r•gles dÕutilisation ˆ large Žchelle des clones testŽs sera nŽcessaire, surtout si le cožt de mise en Ïuvre technique diminue. Quelques pistes peuvent dŽjˆ •tre ŽbauchŽes. Un clo- nage limitŽ ˆ 50-100 exemplaires pour les ani-
maux utilisŽs en reproduction para”t raison- nable, alors quÕil y aurait peu dÕinconvŽnient ˆ dŽpasser cette limite pour les clones Ç termi- naux È. Le bilan technico-Žconomique prŽ- sentŽ ci-dessus tient compte de cet aspect puisquÕil suppose que les clones diffusŽs appartiennent aux 10 % les meilleurs de la population des clones et non au tout meilleur clone, ce qui veut dire quÕil y en a plusieurs pour maintenir une diversitŽ des gŽnotypes dÕŽlite. LÕutilisation abusive de certains clones devrait •tre dŽcouragŽe par une lŽgislation internationale (en toute rigueur, le probl•me se pose dŽjˆ pour la semence). Ainsi, il ne parait pas opportun dÕajouter au stock de semences de taureaux dÕinsŽmination celui de leurs clones plus jeunes qui seraient produits au fur et ˆ mesure des rŽsultats du testage.
La mise en place de cet encadrement rejoin- dra les tentatives actuelles que m•nent plu- sieurs organismes internationaux pour rŽgle- menter une activitŽ Žconomique trop libŽrale qui ne respecte pas les ressources gŽnŽtiques.
En ce qui concerne les petites populations qui suivent un programme de sauvegarde, on peut penser quÕau point de vue technique, le clonage somatique de chaque membre de la population en vue de son inŽvitable remplace- ment est la solution idŽale sans perte alŽa- toire de g•nes (ˆ lÕoccasion des mŽioses) et tout en Žvitant la Ç mort sociale È de la popu- lation que reprŽsente sa seule conservation sous forme de gam•tes ou dÕembryons conge- lŽs. Cependant, cette solution risque fort dÕ•tre financi•rement insupportable soit aux collectivitŽs nationales soit aux petites collec- tivitŽs dÕŽleveurs directement concernŽes.
4
.4/ Clonage et expŽrimentation
Certains th•mes de recherches am•nent ˆ travailler sur un petit nombre dÕanimaux parce que le cožt des mesures impliquŽes dans le protocole (qui sÕajoutent au cožt dÕen- tretien) est ŽlevŽ. Que peut apporter le clo- nage dans ces conditions ?
a / DŽtection dÕeffets liŽs ˆ un Ç traitement È
Un traitement correspond ˆ une modalitŽ expŽrimentale (niveau dÕalimentation, ‰ge, ...) dont on souhaite mesurer lÕeffet sur la moyenne et/ou la variabilitŽ de caractŽris- tiques ou performances donnŽes dÕun groupe dÕanimaux. LÕefficacitŽ statistique de lÕutilisa- tion dÕanimaux clonŽs se mesure alors par le nombre Žquivalent dÕanimaux non clonŽs qui seraient nŽcessaires pour obtenir la m•me Ç puissance È de dŽtection dÕun effet liŽ au trai- tement. La Ç puissance È est une notion statis- tique qui correspond ˆ la probabilitŽ de dŽcla- rer significatif un effet quand celui-ci existe bien. Un exemple est prŽsentŽ dans le tableau 10. Pour un caract•re dÕhŽritabilitŽ ŽlevŽ (h2= 0,5) pour lequel la variabilitŽ (variance) intra traitements serait ŽlevŽe et de m•me ordre de grandeur que la variabilitŽ inter traitement, lÕutilisation de 10 clones rŽpliquŽs ˆ 3 exem- plaires (30 animaux) serait aussi efficace que Tableau 9. Impact économique de l’utilisation dans un troupeau de clones
testés et sélectionnés. Hypothèse : chaque année une génisse est produite par transplantation embryonnaire (TE).
Recettes cumulŽes (kF) Cožts cumulŽs (kF) AnnŽe
TE classique TE avec clones TE classique 50 % TE classique
0 0 0 4 2
2 0 0 12 6
4 1,7 2,9 20 10
6 6,0 10,5 28 14
8 12,4 22,2 36 18
10 22,1 38,2 44 22
Exemple : bilan financier ˆ lÕannŽe 10 r 100 ×((recettes Ð cožt)/cožt)
TE classique r (100 ×((22,1 Ð 44)/44) = Ð 50 %
Cožt du clone = cožt TE classique r (100 ×((38,2 Ð 44)/44) = Ð 14 % Cožt du clone = 50 % cožt TE classique r (100 ×((38,2 Ð 22)/22) = + 74 %
celle de 30 x 1,78 = 53 animaux normaux (gŽnŽtiquement indŽpendants). Dans ce cas, le clonage peut contribuer ˆ lÕefficacitŽ de dis- positif expŽrimental si son cožt spŽcifique ne reprŽsente pas plus de 78 % du cožt expŽri- mental dÕun animal normal. Le m•me raison- nement peut •tre appliquŽ ˆ des crit•res dÕhŽ- ritabilitŽ faible (h2= 0,1). Il appara”t alors que lÕutilisation de clones est surtout intŽressante pour les caract•res tr•s hŽritables (J.-J. Col- leau 1995, non publiŽ).
b / Mesure de la variabilitŽ gŽnŽtique additive
A effectifs totaux (N) constants, il est plus efficace dÕestimer le coefficient dÕhŽritabilitŽ du caract•re ˆ partir de clones quÕˆ partir de groupes de demi-fr•res (paternels par exemple). En effet, la variance dÕŽchantillon- nage est avec les clones quatre fois plus faible quÕavec les groupes de demi-fr•res. Cepen- dant, elle est encore tr•s substantielle quand N est assez faible, ce qui est souvent le cas dans les expŽrimentations. Par exemple, si h2= 0,5 et N = 100, lÕintervalle de confiance est 0,1-0,9 : ce qui est encore beaucoup trop imprŽcis. Il ne convient donc pas de considŽ- rer que le clonage permettrait dÕobtenir des estimŽes fiables de param•tres gŽnŽtiques de crit•res obtenus lors dÕexpŽrimentations tr•s spŽcifiques.
5 / Synergie
avec les biotechnologies de la connaissance du gŽnome
Actuellement, la recherche mondiale en gŽnŽtique est tr•s active dans deux domaines.
DÕune part, la constitution de cartes gŽnŽ- tiques balisant le gŽnome gr‰ce ˆ des rŽgions ˆ polymorphisme ŽlevŽ (marqueurs molŽcu- laires de type microsatellite), dÕautre part, la dŽtection de g•nes ˆ effets individuels impor- tants dits QTL (quantitative trait loci, voir lÕarticle de D. Boichard et al, ce numŽro).
Cette dŽtection est obtenue en Žtudiant les relations entre les performances et les gŽno- types pour des marqueurs voisins de ces QTL.
On peut donc espŽrer disposer ˆ long terme de mŽthodes de sŽlection assistŽe par mar- queurs (Colleau et Boichard 1997), pour lequelles les biotechnologies du gŽnome et de la reproduction bŽnŽficieront mutuellement lÕune de lÕautre. La connaissance des gŽno- types marqueurs (et des performances des ascendants ou apparentŽs qui ont transmis ces marqueurs) permet dÕaffiner le choix des reproducteurs m‰les et femelles dÕŽlite impli- quŽs dans les opŽrations de reproduction intensive (transfert embryonnaire et accou- plements raisonnŽs). Les produits issus de ces reproducteurs peuvent •tre triŽs plus efficace- ment en intŽgrant la connaissance de leur
gŽnome marqueur. Inversement, les tech- niques de reproduction permettent de diffuser efficacement les gŽnotypes favorables. A lÕex- tr•me, le clonage permettrait de multiplier un gŽnotype (connu via le marquage molŽculaire) correspondant ˆ une association tr•s rare de g•nes favorables ˆ plusieurs loci et/ou pour plusieurs caract•res.
Conclusion
Les biotechnologies de lÕembryon sont dans le droit prolongement de la dŽmarche enta- mŽe lors de lÕapparition de lÕinsŽmination arti- ficielle : lÕhomme enrichit ses connaissances sur le fonctionnement des •tres vivants puis tente de le modifier ˆ son profit. Ces technolo- gies sont beaucoup plus complexes, plus exi- geantes sur le plan technique et plus což- teuses que lÕinsŽmination artificielle.
Cependant, elle permettent de corriger les faibles capacitŽs reproductives des femelles de certaines esp•ces, notamment lÕesp•ce bovine, ouvrant ainsi la voie ˆ toute une sŽrie dÕappli- cations en sŽlection et en Žlevage.
Le plein Žpanouissement de ces potentiali- tŽs nŽcessite encore un double effort. DÕune part, les cožts affŽrents aux techniques devront •tre impŽrativement diminuŽs ce qui ne pourra •tre rŽalisŽ quÕˆ partir dÕune meilleure comprŽhension des phŽnom•nes biologiques impliquŽs. Par ailleurs, il convien- dra de raisonner de mani•re plus rigoureuse quÕactuellement le devenir ˆ long terme des populations sŽlectionnŽes, notamment pour ne pas rŽduire inutilement leur variabilitŽ gŽnŽtique. Ce risque, dŽjˆ bien mis en Žvi- dence avec le dŽveloppement de lÕinsŽmina- tion artificielle, sÕaccro”t avec lÕaugmentation du pouvoir de diffusion des reproducteurs que permettent les biotechnologies. Dans ce domaine, qui met en jeu lÕavenir de ressources gŽnŽtiques, le laissez-faire ne pourra seul prŽ- valoir et il importe de susciter d•s maintenant une prise de conscience internationale des nouveaux enjeux mais aussi des nouveaux risques quÕil nous faudra apprendre ˆ ma”tri- ser.
10 3 1,04 1,78
30 5 6 1,08 1,85
1 30 1,10 1,89
20 3 1,08 1,90
60 10 6 1,09 1,93
2 30 1,10 1,94
Tableau 10. Efficacité statistique d’un animal cloné par rapport à un animal classique pour la détection d’un effet traitement expérimental. On a fait l’hypothèse, dans cet exemple, que la variance intra-traitement était égale à la variance entre traitements.
Nb total dÕanimaux
en expŽrimentation Nb de clones
Nb de rŽpliques
par clone
h2= 0,1 h2= 0,5
h2= variance gŽnŽtique/variance intra-traitement.
