Rapport de stage de Master 2
Élevage de masse et évaluation sur le terrain de la dispersion, de la longévité et de la
compétitivité de mâles stériles d'Aedes albopictus
Présenté par Solène MARQUINE
Etudiante en Master Biodiversité Ecologie Evolution,
Parcours Emergence des Maladies Parasitaires et Infectieuses (EPI)
Maitre de stage : Charles JEANNIN
Responsables de master : Catherine MOULIA et Laurent GAVOTTE Période de stage : Février 2021- Juin 2021
Résumé :
Vecteur mais aussi source de nuisances, Aedes albopictus (le moustique tigre) s’est largement installé dans le sud de la France. La technique de l’insecte stérile utilisée comme méthode de lutte alternative aux insecticides a démontré son efficacité sur d’autres modèles biologiques et a ainsi motivé un essai contre Aedes albopictus dans le cadre du projet REVOLINC.
Cette technique nécessite de produire en grande quantité l’insecte ciblé. Dans la présente étude la stérilisation est réalisée par une exposition à des rayons ionisants. Les évaluations réalisées sur le protocole d’élevage de masse de la FAO/IAEA avec la souche Ae.albopictus AGROPOLIS ont permis de vérifier ou d’ajuster les paramètres suivants : le taux d’éclosion (64% ± 13%) en relation avec le protocole de séchage et de conservation des œufs, la corrélation entre le nombre et la masse des œufs (y = 0.0065x + 0.2696) et le rendement de différents repas de sang (12,55 œufs/femelle avec Hemotek et 30,55 œufs/femelle avec cobaye). L’amplification de la souche AGROPOLIS à l’EID Méditerranée selon ce protocole a permis d’obtenir des nymphes en 5 jours. Néanmoins celle-ci n’a pas pu aboutir aux quantités nécessaires au projet suite à des mortalités massives dans les insectariums utilisés.
Un protocole de marquage-lâcher-recapture (MLR) sera réalisé avec les moustiques produits au CAA et des réseaux de pièges disposés dans la zone des lâchers (Prades-Le-Lez, France). Cela permettra la collecte de moustiques adultes et d’œufs nécessaire à l’évaluation de la dispersion, de la longévité et de la compétitivité des mâles stériles. Une comparaison des méthodes de lâchers au sol et par drone sera réalisée. L’essai de MLR se déroulera théoriquement au mois de juillet 2021.
Mots clés :
Aedes albopictus, Technique de l’Insecte Stérile (TIS), lutte anti-vectorielle, élevage de masse, Marquage-Lâcher-Recapture (MLR), drone, irradiation
Abstract :
Aedes albopictus (the tiger mosquito) is both a vector and a source of nuisance and has become widely established in the south of France. The sterile insect technique used as an alternative control method to insecticides has demonstrated its effectiveness on other biological models and has thus motivated a trial against Aedes albopictus in the framework of the REVOLINC project.
This technique requires the production of large quantities of the targeted insect. In the present study, sterilization is achieved by exposure to ionizing radiation. The evaluations carried out on the FAO/IAEA mass rearing protocol with the Ae.albopictus AGROPOLIS strain allowed to verify or adjust the following parameters: the hatching rate (64% ± 13%) in relation to the egg drying and preservation protocol, the correlation between the number and mass of eggs (y = 0. 0065x + 0.2696) and the yield of different blood meals (12.55 eggs/female with Hemotek and 30.55 eggs/female with guinea pig). The amplification of the AGROPOLIS strain at EID Méditerranée according to this protocol allowed to obtain pupae in 5 days. Nevertheless, this amplification could not produce the quantities necessary for the project due to massive mortality in the insectariums used.
A mark-release-recapture (MRR) protocol will be carried out with mosquitoes produced at the CAA and trap networks set up in the area of the releases (Prades-Le-Lez, France). This will allow the collection of adult mosquitoes and eggs to assess to the evaluation of dispersal, longevity and competitiveness of sterile males. A comparison of ground and drone release methods will be performed. The MRR trial will theoretically take place in July 2021.
Key words :
Aedes albopictus, Sterile Insect Technique (SIT), vector control, Mass-rearing, Mark-Release-Recapture (MRR), Uncrewed Aerial Vehicle (UAV), irradiation
Abréviations :
BGS : Biogents Sentinel
CAA : Centro Agricoltura Ambiente “Giorgio Nicoli”
CHIKV : virus du chikungunya
CIRAD : Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développement
DENV : virus de la dengue
ERC : European Research Council
FAO : Food and Agriculture Organisation
Gy : gray (unité de dose absorbée)
HCSP : Haut Conseil de Santé Publique
HR : humidité relative
IAEA : International Atomic Energy Agency (Agence Internationale de l'Énergie Atomique en français)
IES : Institut d’Electronique et des Systèmes
IRD : Institut de Recherche et de Développement (sous-entendu de Montpellier)
ISPM : International Standards for Phytosanitary Measures
MOSQUAREL : Mosquito Aerial Release
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
REVOLINC : Revolutionizing Insect Control
RS : Repas Sanguin
SE : erreur standard
TIS : Technique de l’Insecte Stérile
ZIKV : virus zika
Remerciements
Je tiens tout particulièrement à remercier Charles Jeannin qui m’a encadré durant ce stage, a su m’aider dans la rédaction de ce rapport et tout au long de ce projet.
Merci à Yvon Perrin et Nicolas Le Doeuff Le Roy pour les bons moments.
Je remercie aussi Christophe Lagneau et Rémi Cluset pour leur entrain et leur implication vis-à-vis de ce projet conséquent.
Merci à Marie-Laure Setier-Rio, Adeline Larghi, Philippe Tourrier, Magali Grondin et Jean- Baptiste Ferré du pôle “Entomologie et Expérimentation” de m’avoir partagé vos expériences, vos connaissances ainsi que vos techniques aussi bien en laboratoire que sur le terrain. Tout cela a été indispensable tout au long de ce stage.
Au moment où je mets le point final de ce rapport, se termine cette première partie de stage. Mais celui-ci n’est pas terminé et c’est avec plaisir que je continue de travailler à l’EID cet été afin de voir le projet MOSQUAREL aboutir aux lâchers expérimentaux que nous attendons tant.
Merci à Catherine Moulia et Laurent Gavotte pour ces deux années de Master, pour vos enseignements mais aussi pour votre implication même pendant cette période difficile de COVID.
Et évidemment, merci à la promotion EPI 2019-2021 toujours présente pour s’entraider et débattre.
J’espère de tout cœur que nous nous reverrons, autour d’un verre ou pourquoi pas, d’un article scientifique.
Ce travail a été financé par le Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne (accord de subvention n° 682387- REVOLINC ; accord de subvention n° 899888 - MOSQUAREL)
Sommaire : I- Introduction
II- Matériels et méthodes
II-1 Élevage de masse a) Matériel biologique
b) Conditions d’élevage à l’EID Méditerranée c) Régime alimentaire et repas de sang
d) Méthode d’élevage et de sexage e) Protocole d’irradiation
II-2 Protocole de Marquage-Lâcher-Recapture
a) Marquage, transport et lâchers des moustiques sur site
b) Protocole de suivi entomologique sur le site de lâcher de Prades-Le-Lez
II-3 Evaluation des paramètres nécessaires à la mise en place et à la maitrise de l’élevage de masse et essai de marquage
a) Evaluation de la qualité de séchage des œufs b) Corrélation entre nombre et masse des œufs
c) Evaluation de l’impact du brossage sur le taux d’éclosion d) Comparaison de trois régimes alimentaires
e) Comparaison de trois méthodes de repas sanguins
f) Evaluation de l’impact du transport et du marquage de mâles stériles produits au CAA (Italie) g) Statistiques
III- Résultats
III-1 Résultats obtenus
a) Evaluation de la qualité de séchage des œufs b) Corrélation entre nombre et masse des œufs
c) Evaluation de l’impact du brossage sur le taux d’éclosion d) Comparaison de trois régimes alimentaires
e) Comparaison de trois méthodes de repas sanguins
f) Evaluation de l’impact du transport et du marquage de mâles stériles produits au CAA (Italie) g) Résultats généraux sur les essais d’élevage de masse
III-2 Résultats attendus
IV- Discussion
IV-1 Discussion des résultats obtenus IV-2 Discussion des résultats attendus
V- Conclusion
I- Introduction
Les invasions biologiques sont sources de problèmes sanitaires et écologiques dont le nombre ne cesse d’augmenter. Cela a de nombreux effets à la fois directs et indirects sur les écosystèmes (Vacus, 2012).
Connu sous le nom de “moustique tigre asiatique”, Aedes albopictus est source de nuisance pour les populations mais est aussi vecteur de pathogènes provoquant des maladies telles que la dengue, le chikungunya, la fièvre jaune ou encore le Zika (Vacus, 2012 ; Schaffner et al., 2013).
Cet insecte fait partie de la famille des Culicidae et est originaire d'Asie du sud-est (Vacus, 2012).
Sa grande expansion est due à ses facultés d’adaptation : il est capable d’investir des environnements anthropiques ou naturels et peut piquer différents mammifères mais aussi des reptiles (Delatte, Paupy et al., 2008) ce qui augmente le risque de transmission de zoonoses (Schaffner et al., 2013). Ses œufs sont résistants à la dessiccation notamment durant les périodes où la durée du jour est la plus courte en climat tempéré (Roche et al., 2015). Les adultes ont une durée de vie moyenne de 2 à 3 semaines en milieu naturel et de 3 mois en laboratoire.
Reconnaissable par la ligne d’écailles blanches au centre de son thorax, il tient son nom des rayures en forme d’anneaux présentes sur ses pattes. Son cycle, aquatique aux stades larvaire et nymphal (1 à 4 sur la Figure 1) puis aérien pour le stade imaginal (5 à 8 sur la Figure 1) est d’une durée variable en fonction des conditions de température, de photopériode et d’humidité.
Progressivement introduit au cours des échanges commerciaux, notamment de pneus usés (Delatte, Paupy et al., 2008 ; Delatte, Dehecq et al., 2008, Vacus, 2012) qui lui ont permis d’étendre son aire de répartition et de ce fait, les risques sanitaires qui lui sont associés, il est désormais présent dans une centaine de pays et tous les continents (hors Antarctique) (Vacus, 2012). Cela en fait une des espèces les plus invasives au monde selon le “Invasive Species Specialist Group”. En France métropolitaine, il est présent sur la moitié du territoire (Vega-Rua et al., 2013) et l’on recense depuis quelques années des cas autochtones de dengue, de chikungunya et de zika (Ruche et al., 2010 ; Vega-Rua et al., 2013 ; Roche et al., 2015, Giron et al., 2019).
Figure 1 : Cycle de vie d’Aedes albopictus. Source : Institut Pasteur
L e
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C’est un vecteur d’arbovirus, c'est-à-dire de virus dont la transmission biologique et active est réalisée par un arthropode hématophage d’un hôte vertébré donneur à un autre hôte vertébré réceptif. En laboratoire, la compétence vectorielle d’Aedes albopictus a été démontrée pour près de 22 arbovirus (Gratz, 2004 ; Schaffner et al., 2013). Cela souligne bien les risques que comporte son expansion même si la compétence vectorielle diffère de la capacité vectorielle observée dans la nature. En effet, la capacité vectorielle est spécifique à une population donnée dans un contexte naturel défini (Schaffner et al., 2013).
La dengue (DENV) est considérée comme ré-émergente selon l’OMS. Elle est essentiellement présente en zone intertropicale notamment en Asie et Amérique du sud avec au total plus de 50 millions de cas par an (Delatte, Dehecq et al. 2008). Sa recrudescence pourrait être due à l’apparition de moustiques résistants aux insecticides mais aussi à l’expansion démographique mondiale notamment en milieu urbain. Cette maladie menace près de la moitié de la population mondiale (Delatte, Paupy et al., 2008).
Le chikungunya (CHIKV), est moins répandu que la dengue, il était considéré comme une arbovirose mineure mais de récents événements ont provoqué un regain d'intérêt (Delatte, Paupy et al., 2008 ; Schaffner et al., 2013). Il a été à l’origine de graves épidémies dans l’Océan Indien, en Inde et en Afrique de 2004 à 2007 (Rezza et al., 2007 ; Delatte, Paupy et al., 2008 ; Vega-Rua et al., 2013). En 2007, il fait son apparition en Europe en provoquant une flambée épidémique en Italie (Rezza et al., 2007
; Schaffner et al., 2013).
Ces maladies ainsi que la fièvre jaune et le virus Zika font l’objet d’une forte surveillance et sont soumises à déclaration obligatoire.
En absence de vaccin (Schaffner et al., 2013), les outils pour réduire l’incidence de ces maladies ciblent les insectes vecteurs. Il s’agit d’une part de la mobilisation sociale qui vise à réduire la multiplication des gîtes larvaires anthropiques situés quasi exclusivement en zone urbaine et péri domiciliaire. D’autre part, l’utilisation d’insecticides (chimiques ou biologiques) ciblant les adultes et/ou les larves sont plutôt utilisés de manière curative en cas d’épidémie ou de cas groupés d’arboviroses.
Figure 2 : Distribution mondiale du Chikungunya (turquoise), de la Dengue (rouge) ainsi que des coïnfections (violet). La répartition des principaux vecteurs (Aedes aegypti et albopictus) de ces maladies est illustrée en bas à droite. Source : Furuya-Kanamori et al., 2016.
Néanmoins ces méthodes et outils présentent des limites telles qu’une efficacité limitée, des impacts environnementaux non négligeables et peuvent engendrer des résistances aux insecticides. Des techniques innovantes, alternatives ou complémentaires font actuellement l’objet d’évaluations. Parmi ces techniques, la technique de piégeage de masse (Barrera et al., 2014) et la technique de l’insecte stérile (TIS) plus respectueuses de l’environnement, font l’objet de nombreux essais.
La technique de l'insecte stérile (TIS) est une méthode de lutte biologique apparentée à la lutte génétique, appelée aussi « lutte autocide », qui a été mise au point afin de limiter des populations d'insectes posant des problèmes agronomiques ou sanitaires voire de les éliminer dans une région donnée (Bouyer, Culbert et al., 2020). Elle est en cours d’expérimentation sur différents territoires pour Aedes aegypti et Aedes albopictus : en Europe avec la France et l’Espagne mais aussi en Chine (Zhang et al., 2016) et au Brésil. En Afrique, l’utilisation de cette technique s’est avérée être un succès contre les glossines (Vreysen et al., 2014).
Le projet « REVOLINC » dont fait partie « MOSQUAREL », financé par l’ERC (European Research Council) et porté par le CIRAD, vise à développer cette méthode de lutte contre trois modèles d’espèces d’intérêt agronomique ou médical, notamment les moustiques du genre Aedes. Le sous-projet MOSQUAREL plus particulièrement a pour objectif d’étudier la compétitivité des moustiques mâles stériles lâchés par voie aérienne via des drones miniaturisés (< 900 g) comparativement à la méthode classique de lâchers au sol et ce, sur trois sites : l’Ile de la Réunion, Valence en Espagne et la région montpelliéraine. Concernant ce dernier site, la réalisation de l’expérimentation est assurée par l’Entente Interdépartementale pour la Démoustication du littoral Méditerranéen.
L’EID Méditerranée est un opérateur public agissant dans la gestion de la nuisance qu’occasionnent les moustiques des zones humides du littoral languedocien depuis 1958. Depuis l’arrivée d’Aedes albopictus en France métropolitaine cet opérateur est également impliqué dans la lutte contre ce moustique nuisant et vecteur.
Ce rapport présente les travaux réalisés dans ce cadre : d’une part la mise en place d’un essai de production de masse de moustiques mâles stériles à l’EID Méditerranée, et d’autre part la réalisation du protocole de marquage-lâcher-recapture afin de récolter des données sur la compétitivité des mâles stériles, leur longévité et leur dispersion.
Les questions scientifiques autour de cette problématique sont multiples :
- La mise en place de méthodes standardisées d'élevage de masse, d'irradiation et de séparation des sexes est-elle réalisable à l’EID Méditerranée ?
- L’utilisation de drones pour effectuer des lâchers de mâles stériles est-elle une bonne alternative aux méthodes de lâcher au sol en termes d’efficacité et de coût ?
- Les mâles stériles relâchés ont-ils une dispersion et une longévité similaires aux mâles sauvages afin d’assurer leur compétitivité face à ces derniers ?
- La TIS appliquée à Aedes albopictus peut-elle être une méthode efficace dans le contexte montpelliérain ?
Ce rapport présente la première partie de mon stage (février à juin) où toutes ces questions ne seront pas traitées, les lâchers de mâles stériles ayant lieu durant les mois de juillet et août.
II- Matériels et méthodes II- 1 Élevage de masse
La TIS a pour principe de relâcher dans l’environnement des mâles stériles dans un ratio très supérieur (5 à 10) au nombre de mâles présents afin qu’ils s’accouplent avec les femelles sauvages qui ainsi produiront des œufs stériles (Bouyer et Lefrançois, 2014). Cette technique nécessite donc d’élever une grande quantité de ces insectes mais aussi de les séparer en fonction de leur sexe. Ce sexage est possible grâce à la différence de taille entre les nymphes mâles et les nymphes femelles.
Afin de produire un nombre connu et homogène d’individus dans un temps donné, il est nécessaire de maitriser le régime alimentaire des larves, la synchronisation de l’éclosion et la densité larvaire. Les expériences qui sont associées à ces paramètres sont développés en partie II-3.
a) Matériel biologique
Les essais d’élevage de masse sont réalisés sur deux souches d’Aedes albopictus. D’une part la souche Spam, élevée en insectarium au sein du laboratoire de l’EID Méditerranée à Montpellier. Cette souche en partie autogène et sténogame est issue d’une population collectée dans les Alpes-Maritimes et maintenue en élevage depuis 2007. Cette souche a été utilisée lors des premiers essais d’élevages en février et mars 2021.
D’autre part la souche AGROPOLIS élevée en insectarium au sein du laboratoire de l’IRD à Montpellier. Cette souche en partie autogène et sténogame est issue d’une population collectée à Montpellier et maintenue en élevage depuis 2015. Cette souche est élevée à l’EID depuis avril 2021.
Cette souche a également été envoyée au “Centro Agricoltura Ambiente” (CAA) Giorgio Nicoli en Italie pour y être produite en masse grâce au programme européen INFRAVEC 2. Ce programme propose différents matériels biologiques en liaison avec les maladies vectorielles. La production des 40 000 mâles stériles nécessaires au projet Mosquarel sera assurée par le CAA afin de garantir la faisabilité du protocole de Marquage-Lâcher-Recapture.
La souche AGROPOLIS est élevée au CAA selon le guide de l’IAEA et les mâles seront irradiés avec des rayons gamma au stade nymphal à la dose de 35 Gy, utile pour induire une stérilité d'environ 99
% (Balestrino et al. 2010).
Après l'émergence, les mâles irradiés seront livrés conformément aux Normes internationales pour les mesures phytosanitaires (ISPM). Des colis avec un triple emballage seront utilisés, et les mâles seront transportés par DHL ou Fedex dans des boites isothermes contenant des accumulateurs de froid à changement de phase permettant de maintenir la température entre 10 et 12°C pendant plus de 24h.
b) Conditions d’élevage à l’EID Méditerranée
Les adultes ainsi que les nymphes et les larves sont élevés dans des insectariums distincts.
L'insectarium dédié au développement larvaire est à une température de 30±1°C, une humidité relative de 70±10 % (Mamai et al., 2020) et une photopériode de 16h jour/8h nuit. La température ambiante permet de maintenir la température de l’eau des plateaux d’élevage à 28°C. L’ensemble de ces paramètres sont contrôlés et enregistrés à l’aide de sondes de température ainsi que de leur application associée Testo.
L’ensemble de l’élevage et des essais sont réalisés avec de l’eau osmosée, utilisée à la température de l’insectarium. Les différentes tailles de plateaux utilisées pour les larves sont présentées dans l’annexe 1.
L’ensemble de l’élevage et des essais sont réalisés à une densité larvaire de 3,6 larves / cm2 (Zhang et al., 2017).
Les nymphes et les adultes sont maintenus dans un insectarium à 27±1°C avec une humidité de 75±10% et une photopériode de 16h jour/8h nuit. Des cages recouvertes de moustiquaire de 40x40x40 cm sont utilisées pour les moustiques adultes.
c) Régime alimentaire et repas de sang
Différents régimes alimentaires ont été testés pour l’élevage de larves d’Aedes (David et al., 2012 ; Bimbilé et al., 2019). Afin d’optimiser la production, le régime proposé par le guide de l’IAEA a été retenu. Il est composé d’une solution à 4% des éléments suivants (Maiga et al., 2020) : de la farine de thon à 50%, de la poudre d’insecte à 36% (PGS Innova, 2kg) et de la levure de bière à 14% (Yeast Brewers, Sigma, 1kg). Les différents ingrédients sont broyés et mélangés à l’aide d’un mortier.
L’utilisation d’un broyeur (Planetary balls meals, modèle PM100 (Maiga et al., 2020)) est aussi possible.
La nourriture est broyée mensuellement grâce à l'estimation des besoins journaliers établis en fonction du nombre de plateaux ainsi que de leur taille.
Les adultes sont nourris à l’aide d’un coton (Coltene, ROEKO Parotisroll) disposé dans un pilulier (50mL) contenant une solution de sucrose à 10%. Les repas de sang nécessaires à la production des œufs sont réalisés sur cobaye endormi ou avec des dispositifs artificiels. D’une part le dispositif Hemotek (Hemotek membrane feeding, PS6 power unit) permettant de chauffer des nourrices (“feeders”) avec 3 ml de sang par nourrice et d’autre part un boyau de collagène (Edicas, Collagen edible casing, Spain) contenant 60 à 125mL de sang préalablement chauffé à 42°C au bain marie (Maiga et al., 2020 ; Maiga et al., 2017). Le sang utilisé pour ces deux méthodes est du sang de mouton défibriné (BCL).
Un repas de sang est proposé aux femelles 1 à 2 fois par semaine.
d) Méthode d’élevage et de sexage
Le séchage des papiers de ponte se fait pendant 36 à 72h en insectarium dans des boîtes fermées non hermétiquement, les œufs sont ensuite stockés dans des enveloppes (Maiga et al., 2020). Ils sont stockés durant 1 à 2 semaines avant de les utiliser, afin de permettre leur embryogenèse (Vacus, 2012).
Les œufs sont détachés des papiers de pontes par brossage à l’aide d’un pinceau. Le poids des œufs à mettre à éclore est estimé par l’équation suivante : (y = 0,007x + 3,0134) où x correspond au nombre d'œufs et y la masse des œufs (en mg) (Zheng et al., 2015 ; Maiga et al., 2020).
L’éclosion des œufs est réalisée dans des bocaux de 500 ou 1000 ml contenant du bouillon d’éclosion. Celui-ci est composé de 0,25g de bouillon nutritif (Nutrient Broth, Sigma-Aldrich, 1kg) et de 0,05g de levure de bière (Yeast Brewers, Sigma-Aldrich, 1kg) pour 700mL d’eau osmosée. Un nombre d’œufs estimé par pesée est introduit dans le bocal puis fermé et stocké dans l’insectarium durant 20h. Il est nécessaire de limiter les déplacements des bocaux afin d’avoir le taux d’oxygène le plus bas à l'intérieur (Maiga et al., 2020). Les bocaux sont vidés dans les plateaux d'élevage puis complétés avec de l’eau osmosée. Les larves sont ensuite nourries selon un planning journalier.
Une estimation du taux d’éclosion est calculée à chaque génération afin d’ajuster le nombre d'œufs à utiliser pour maintenir une densité homogène de 3,6 larves /cm2. Un taux d’éclosion moyen par papier de ponte est estimé grâce à 3 lots de 100 œufs distribués dans 40mL de solution pour éclosion chacun, dans des tubes à centrifuger de 50mL. Après 20h dans la solution dans les conditions d’insectarium, les larves vivantes sont comptées sous loupe binoculaire. Cette étape est réalisée avant chaque mise à éclosion du reste du papier testé.
La séparation des larves, des nymphes mâles et des nymphes femelles se fait par leur taille (Bellini, Puggioli, et al., 2018) avec un trieur Fay-Morlan (Figure 3), entre les jours 6 et 9 post éclosion (Maiga et al., 2020 ; Mamai et al., 2020) [Annexe 3]. Les larves sont remises en plateaux dans leur insectarium initial tandis que les nymphes sont placées en cage dans le second insectarium.
e) Protocole d’irradiation
La stérilisation des nymphes mâles pourra être réalisée à l’Institut d’Electronique et des Systèmes (IES) de Montpellier qui est en mesure de proposer cette prestation. La stérilisation sera réalisée à l’aide d’un irradiateur à rayons X à une dose de 35 Gy (Parker et Mehta, 2007 ; Bellini et al. 2013 ; Du et al., 2019 ; Bouyer, Culbert et al., 2020, Gouagna et al., 2020).
II-2 Protocole de Marquage-Lâcher-Recapture
a) Marquage, transport et lâchers des moustiques sur site
Des lots de 1000 nymphes mâles stériles sont placés dans des cages de 30x30x30 cm. Après émergence, les moustiques sont endormis à 5°C au frigo pendant 15 minutes. Les lots de 1 000 mâles endormis sont ensuite transférés dans des tubes en plastique de 100 ml contenant 5 mg de poudre phosphorescente (Dayglo©). Les tubes sont roulés pendant 10 secondes ce qui correspond à environ 20 rotations afin d’assurer une coloration homogène des individus (Bouyer, Balestrino et al., 2020). Cette dose permet de colorer tous les individus tout en minimisant la mortalité (Bouyer, Balestrino et al., 2020 ; Culbert et al., 2020). Après marquage, les tubes sont placés dans une glacière afin de les maintenir endormis à une température de 7°C jusqu’au site de lâcher. Ces données sont enregistrées avec un Testo® placé dans les boites isothermes.
Des lâchers seront réalisés au sol ainsi que par drone afin de comparer les deux méthodes. Le drone utilisé pour ces lâchers a été développé au sein du projet REVOLINC et est conforme aux règles de la Commission européenne pour une utilisation professionnelle en milieu urbain. En fonction des méthodes semaines de lâcher, les moustiques seront marqués de différentes couleurs. Les lâchers ont lieu aux heures fraiches de la journée afin de garantir les meilleures conditions pour les moustiques lâchés. La température et l’humidité relative sur le site seront enregistrés tout au long de l’étude à l’aide d’un Testo®.
Figure 3 : Schéma légendé et exemple d’utilisation d’un trieur de nymphes Fay-Morlan.
Source : Maiga et al., 2020
b) Protocole de suivi entomologique sur le site de lâcher à Prades-Le-Lez
La demande d’autorisation relative à cette expérimentation envoyée par l’EID Méditerranée et le CIRAD en préfecture de l’Hérault le 01/04/2021 est en cours d’instruction. Les lâchers seront réalisés à partir de juillet 2021 une fois que l’arrêté préfectoral autorisant cette expérimentation sera publié.
Les lâchers sont réalisés sur une zone située dans un quartier pavillonnaire de 10 hectares dans la commune de Prades-Le-Lez (34730, Occitanie, France). 10 000 mâles stériles sont lâchés par semaine pendant 4 semaines consécutives. Deux types de pièges sont employés à une densité de 3 pièges / Ha afin de vérifier l’efficacité du marquage-lâcher-recapture (MLR) Les captures sont réalisées deux semaines avant les lâchers et jusqu'à deux semaines après le dernier lâcher :
- 30 pièges pondoirs, constitué d’un seau noir rempli d’eau et d’un papier de ponte, sont placés dans la zone de lâcher et relevés de manière hebdomadaire, et 10 autres dans la zone témoin. Ces pièges permettent de dénombrer les œufs pondus par piège, par semaine et le taux de stérilité dans les zones témoin et de lâcher. Pour faciliter la mise à éclosion mais aussi pour optimiser le nombre d’œufs récupérés, le papier de pontes est disposé sur les parois du seau. Les papiers seront stockés une semaine avant leur mise à éclosion. Ces éclosions seront réalisées dans la solution d’éclosion évoquée précédemment.
Après 24h les œufs sont dénombrés pour chaque papier de ponte, les œufs non éclos sont disséqués pour déterminer la présence/absence d'embryons. Les œufs éclos sont considérés comme fertiles, il en est de même pour les œufs non éclos contenant un embryon. Les œufs abimés et ceux non éclos ne présentant pas d’embryons sont considérés comme stériles.
- 30 pièges à succion (BG-Sentinel®) sont disposés dans la zone de lâcher. Ils sont en fonctionnement pendant 3 jours chaque semaine afin de réaliser un suivi des moustiques adultes. Du CO2 est dégagé à une quantité de 0,4kg/j de 06h à 22h. Les mâles capturés sont observés sous loupe binoculaire avec éclairage classique mais aussi sous lumière UV pour déterminer s’il s’agit de mâles stériles marqués ou de mâles sauvages. Les femelles sont elles aussi comptabilisées.
La compétitivité des mâles est établie grâce à l’indice de Fried (Fried, 1971 ; Bouyer, Culbert et al., 2020
; Bouyer et Vreysen, 2020) par rapport à la fertilité des femelles, suivant cette formule :
Ha représente la fertilité naturelle des femelles sauvages.
Ee représente la fertilité observée des mâles.
R représente le ratio de mâles stériles par rapport aux mâles sauvages.
Ici la fertilité des mâles élevés en laboratoire est négligeable car ils ont été irradiés.
La taille de la population sauvage est déduite du nombre connu de mâles stériles qui a été relâché et recapturé.
Le taux de recapture est calculé en utilisant un test de comparaison z (Bouyer, Culbert et al., 2020).
Le test de rang de Kruskall-Wallis est utilisé pour comparer les données globales de mortalité et de dispersion (Bouyer, Culbert et al., 2020)
La distance moyenne effectuée peut être calculée grâce des anneaux d’un rayon défini au préalable, avec au moins un piège par anneau avec le centre comme point de lâchés :
DME = (Somme (ERx distance) pour tous les anneaux) / Nombre total de ER Avec : Distance = (rayon intérieur + rayon ext) / 2
ER = Nombre de recapture dans l’anneau x CF) / Nombre de pièges dans l’anneau CF = (aire de l’anneau / aire total de piégeage) x nombre total de pièges
La probabilité́ quotidienne de survie est calculée par le résultat de l’antilog de la pente de la droite de régression du nombre total de mâles capturés dans tous les pièges par jour, transformé en log (x + 1). Les survies des deux types de mâles (stériles et non stériles) sont comparées par la comparaison des pentes des droites de régression par un test de Student.
Figure 4 : Vue aérienne de Prades Le Lez (34730, Occitanie, France), la zone de lâcher se trouve dans le cercle rouge et la zone témoin dans le cercle vert. Source : EID Méditerranée
II-3 Evaluation des paramètres nécessaires à la mise en place et à la maitrise de l’élevage de masse et essai de marquage
a) Evaluation de la qualité de séchage des œufs
Les papiers de ponte de la souche SPAM sont séchés directement sur cage d’élevage. Les papiers de pontes de la souche AGROPOLIS sont séchés selon la méthode explicitée en partie II-1 d). Des tests de taux d’éclosion seront réalisés avec les souches SPAM et AGROPOLIS ce qui rend compte de la qualité de séchage pour chaque méthode.
b) Corrélation entre nombre et masse des œufs
Des œufs sont comptés par papier de ponte ou par lot de papiers, brossés puis transférés dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL et enfin pesés à l’aide d’une balance de précision (Kern ACS 320, 0.1mg).
Une droite de régression linéaire est construite sous XLstat, la droite d'équation sous la forme suivante : (y=ax+b) où x correspond au nombre d'œufs et y la masse des œufs (en mg) (Zheng et al., 2015
; Maiga et al., 2020).
c) Evaluation de l’impact du brossage sur le taux d’éclosion
Pour tester l’effet du brossage, 2 tests de taux d’éclosion sont réalisés en parallèle sur le même papier de ponte. Le premier est réalisé avec un brossage puis comptage des œufs en boite de Pétri avant d'être transféré en tube à centrifuger. Pour le second, le comptage se fait sur le papier de ponte, ce dernier est ensuite directement introduit dans le tube contenant la solution.
Le taux d’éclosion est calculé comme expliqué dans la partie II-1 d).
d) Comparaison de 3 régimes alimentaires
Le régime alimentaire recommandée par l’IAEA (détail en partie II-1 c)) sera comparé à ce même régime alimentaire dilué à 50% ainsi qu’au régime alimentaire utilisé en routine à l’EID Méditerranée (NOVO Prawn JBL).
Des comparaisons sont réalisées sur la durée totale de développement (de l’éclosion à l’émergence), la synchronicité d’apparition des stades larvaires, de nymphose et d’émergence ainsi que le sex ratio au cours du temps.
Pour effectuer cette comparaison, on utilise des lots de 100 larves (L1) qui sont disposées dans des petits plateaux 16×16×6.8cm (Annexe 1). 4 réplicas sont réalisés pour chaque modalité.
Un suivi journalier est effectué. Le sexage des nymphes est réalisé au trieur de nymphe.
e) Comparaison de trois méthodes de repas sanguins
Afin de comparer le nombre d’œufs pondus entre les cages et les différentes méthodes de repas de sang, une estimation de la densité de femelle est réalisée un jour après chaque repas sanguin.
Cette estimation est réalisée par la méthode de comptage des individus adultes inspirée du protocole de Maiga et al. réalisé en 2019.
Une feuille A4 est découpée de 5 carrés de 5.7 cm chacun (32,5 cm2). Dix comptages sont effectués dans les carrés par face sur les 5 faces de la cage (sol exclu). Chaque comptage répertorie le nombre de femelles et de mâles. Une densité moyenne est calculée à partir des 50 réplicas puis ramenée à la surface totale de la cage.
Figure 5 : Feuille de comptage sur une cage de 40x40x40cm.
Les œufs des papiers de ponte sont comptés sous loupe binoculaire après séchage. Le nombre d’œufs est pondéré par la densité moyenne des femelles dans la cage considérée.
Les types de repas sanguin (RS) comparés sont : le cobaye, l’Hemotek et le boudin de sang. La durée des repas de sang avec le cobaye, l’Hemotek et le boudin de sang sont respectivement de 45 minutes à 1 heure, de 4 à 6 heures et de 1 h entrecoupée d'étapes de réchauffage au bain-marie.
L’analyse statistique décrite pour cette expérience ne prend pas en compte le boudin de sang pour des raisons explicitées dans la partie discussion.
f) Evaluation de l’impact du transport et du marquage de mâles stériles produits au CAA (Italie)
Les 15 000 moustiques envoyés en caisse réfrigérée sont réceptionnés puis transférés en laboratoire confiné à une température ambiante de 15°C afin de procéder à leur réveil.
Ils sont dispersés de la façon suivante avant leur réveil :
- 12 000 individus sont répartis dans 6 cages (40x40x40) de 2 000 individus chacune.
- Les 3 lots restants sont marqués selon le protocole et placés dans trois cages distinctes Après réveil les différentes cages sont transférées dans l’insectarium dédié aux moustiques adultes.
Le suivi consiste en la récupération des individus morts dans les cages, à leur comptage mais aussi à la différenciation mâle/femelle. La discrimination mâles/femelles permet d’obtenir le taux de contamination par les femelles qui doit être le plus faible possible au moment des lâchers (- de 1%). Le suivi est assuré jusqu’à mortalité complète dans les cages.
g) Statistiques
Le test W de Shapiro-Wilk est utilisé pour tester la normalité des données. L’égalité des variances est testée par le test F de Fisher.
Si la normalité des données ainsi que l’égalité des variances est vérifiée, un test t de Student (paramétrique) pour comparer deux moyennes est réalisé. Si ces paramètres ne sont pas vérifiés un test U de Mann- Whitney (non paramétrique) est réalisé afin d’établir si les médianes de chacun des groupes de données sont proches.
Le coefficient de corrélation de Pearson (paramétrique) est utilisé afin de mesurer la corrélation linéaire entre 2 variables. Les données seront traitées avec le logiciel XLstat.
Figure 6 Photo d’un lot de 1000 moustiques du CAA encore
endormis avant marquage Figure 7 : Photo d’Aedes albopictus mâle du CAA marqué
III- Résultats :
III-1 Résultats obtenus
a) Evaluation de la qualité de séchage des œufs
La méthode de séchage et de conservation appliquée aux œufs de la souche AGROPOLIS a permis d’obtenir un taux d’éclosion moyen de 64% ± 13%. L’autre méthode de séchage et de conservation appliqué aux œufs de la souche SPAM a permis d’obtenir un taux d’éclosion moyen de 53% ± 23%.
Le test de Shapiro-Wilk a permis de vérifier la normalité des données avec p-value SPAM = 0,057 et p-value AGROPOLIS = 0,912. Cependant l’égalité des variances n’a pas été vérifiée (F = 3,06, p-value
= 0,006). Le test de Mann-Whitney suggère qu’il n’y a pas de différences entre les deux médianes donc les deux distributions sont égales (U = 241, p-value = 0,222).
b) Corrélation entre nombre et masse des œufs
Un total de 94 802 œufs repartis sur 18 papiers de ponte a été dénombré puis pesés.
Une relation linéaire significative a été obtenue entre le poids et le nombre d'œufs avec y = 0.0065x + 0.2696. Le coefficient de corrélation de Pearson est égal 0.99 et p-value <0.0001. La p-value étant strictement inférieur à α= 0.05, cette corrélation est significative.
Figure 8 : Box plots du taux d’éclosion obtenu avec les souches SPAM et AGROPOLIS
c) Evaluation de l'impact du brossage sur le taux d'éclosion
Avec brossage des œufs on obtient un taux d’éclosion moyen de 54,71 ( σ= 10,36).
Sans brossage des œufs on obtient un taux d’éclosion moyen de 60,22% ( σ= 9,632).
Les 2 variables suivent une loi normale, avec brossage et sans brossage avec respectivement W = 0.912, p-value = 0.256 et W = 0.857, p-value = 0.052.
Le test de Fisher a permis de vérifier l'égalité des variances avec F= 1.19 et p-value = 0.8.
Les résultats obtenus par le test t de Student suggèrent que le brossage des œufs n’implique pas de modification du taux d’éclosion avec t = -1.29, p-value = 0.212 et α = 0.05.
Figure 9 : Droite de régression linéaire de la masse des œufs (mg) par rapport à leur nombre. Les données brutes sont présentées en Annexe 2
Figure 10 : Box plots des taux d’éclosion obtenus avec et sans brossage. Les données de cette figure
représentent la médiane ± écart-type. Les points noirs représentent le maximum ainsi que le minimum. La moyenne est représentée par la croix rouge.
d) Comparaison de trois régimes alimentaires
Les premières nymphes ont été observées dans tous les plateaux IAEA (2% et 4%) dès le jour 6. Les premières nymphes dans les plateaux au NOVO ont été observées aux jours 6 pour la moitié des plateaux et au jour 7 pour l’autre moitié.
100 % de mortalité des nymphes a été observée dans un plateau nourris à l’IAEA 4% et un à l’IAEA 2%.
Ces 2 plateaux ont été exclus de l’analyse. La cause de la mortalité n’est pas connue
Le nombre moyen d’individus total comptabilisés au 12ème jour est de 98±7 individus.
La nymphose s’est déroulée jusqu’au jour 9 pour les plateaux nourris à l’IAEA 4% alors qu’elle n'était toujours pas achevée au 12ème jour pour les plateaux à l’IAEA 2% et au NOVO.
Figure 11 : Photo présentant la mortalité obtenue dans un plateau nourris avec la diète IAEA 2%
Figure 12 : Effectif cumulé croissant du nombre de nymphes en fonction du temps. Les données brutes sont
e) Comparaison de trois méthodes de repas sanguins
Le repas sanguin (RS) sur cobaye a fourni de meilleurs résultats avec un nombre moyen d'œufs par femelle égal à 30.55 œufs ( σ= 12.60). Le RS avec l’hemotek permet d’obtenir une moyenne de 12.26 œufs ( σ= 5.94) par femelle. Le RS avec le boudin de sang permet d’obtenir une moyenne de 2,01 œufs par femelle.
Selon le test W de Shapiro-Wilk, les données suivent une loi normale avec W = 0.908 et p-value = 0.231 Selon le test F de Fisher, les variances obtenues avec les données Hemotek et cobayes sont comparables avec un rapport de 0,222 et une p-value = 0,245 ainsi on peut appliquer le test t de Student pour la comparaison des moyennes. Le test t donne pour résultat une différence dans les moyennes obtenues avec une p-value = 0,025. Les résultats obtenus par le test t de Student suggèrent que le nombre d'œufs pondu par femelle avec le cobaye est significativement supérieur à celui obtenu avec l’Hemotek.
f) Evaluation de l’impact du transport et du marquage de males stériles produits au CAA (Italie)
La mortalité due au transport observée 24h après la réception des moustiques est de 4,4% (σ = 2.0 et SE = 0.8%).
La mortalité cumulée du transport et du marquage observée 24h après la réception des moustiques est de 14.1% (σ = 2.6 et SE = 1.5%).
Un total de 10 953 moustiques mâles a été comptabilisé contre 15 000 attendus soit 26.98% de moins que prévu. Chaque lot de 2000 individus théorique contient en moyenne 74% des individus prévus (SE = 2.19). Chaque lot de 1000 individus théorique contient en moyenne 69% des individus prévus (SE = 1.6) Le taux de contamination par des moustiques femelles est de 0.47% soit 52 moustiques femelles sur le total récupéré.
Le taux de marquage des individus est de 100%.
Une forte mortalité est observée entre les jours 3 et 7 pour certaines cages puis entre les jours 7 et 9 pour le reste des cages. La durée de vie maximale que nous avons observée est de 19 jours après réception.
Figure 13 : Box plots présentant le nombre d'œufs pondu par femelle. Les données de cette figure représentent la médiane ± écart-type ainsi que la moyenne (croix rouge). Les données brutes sont présentées en Annexe 4.
Figure 14 : Taux de survie en fonction du temps (en jours). Les données brutes sont présentées en Annexe 5.
g) Résultats généraux sur les essais d’élevage de masse
3 essais ont été réalisés avec la souche SPAM, les 2 premiers avec des plateaux moyens et le dernier essai avec des petits plateaux. Les 2 premiers essais ont abouti à 100% de mortalité sur 5 et 6 plateaux respectivement. Le dernier essai a donné 91% de réussite avec 20 sur 22 plateaux arrivés à émergence sans mortalité. Parmi tous les paramètres testés, aucun ne s’est démarqué pour expliquer la mortalité observée.
Concernant la souche AGROPOLIS sur 15 grands plateaux, 5 de ces plateaux ne sont jamais arrivés à émergence soit 33%. 10 de ces plateaux sont arrivés à émergence des adultes (67%), cependant une mortalité précoce des adultes a été observée dans 90% des cas. 1 seul plateau (soit 10%) a donné de bons résultats avec une durée de vie des adultes de 39 jours à partir de la dernière émergence. D’autres cages sont en cours d'élevage et ne sont pas prises en compte.
L'apparition des premières nymphes s’est systématiquement déroulée 5 jours après éclosion des oeufs. On comptabilise des nymphes dans les plateaux en moyenne pendant 7 jours avec un minimum de 4 jours et un maximum de 8 jours après apparition de la première nymphe pour arriver à émergence complète des adultes. L’émergence des adultes se déroule entre 24 et 48h après nymphose.
Ainsi le cycle de développement obtenu est d’une durée minimale de 6 jours de l'œuf mature à l’imago.
Les grands plateaux d'élevage fournis par l’IAEA n’ont pas été testés.
III-2 Résultats attendus :
Les résultats concernant les expériences de stérilisation et de lâchers par l’utilisation du drone ne seront disponibles qu’après expérimentation durant l’été. Cependant des pistes de résultats sont disponibles dans la bibliographie.
Il est attendu d’obtenir une stérilisation n’altérant pas la compétitivité des mâles dans leur milieu naturel, en termes de longévité mais aussi de dispersion. Concernant le drone, il est attendu qu’il soit une meilleure alternative aux techniques de lâchers depuis le sol en termes d'efficacité, avec une dispersion moyenne des mâles supérieure à 100m autour du point de lâcher contre 80m depuis le sol (Bouyer, Culbert et al., 2020)
Il est également attendu d’obtenir un nombre d'œufs stériles croissant au fur et à mesure que les lâchers auront lieu dans la zone d’étude avec chaque semaine l’ajout de nouveaux mâles stériles dans la population sauvage.
IV- Discussion :
IV-1 Discussion des résultats obtenus
Les deux méthodes de séchage des papiers ont donné des résultats similaires d’un point de vue statistique. La méthode de séchage utilisée en routine à l’EID consiste en un séchage rapide des papiers et une conservation à l’air libre. Celle-ci a tout de même montré une plus faible efficacité en moyenne que celle appliquée pour la souche AGROPOLIS et préconisée par Maiga et al. (2020). En effet, on observe un écart type plus important pour la méthode utilisée en routine à l’EID. Ces résultats confirment que le taux d’éclosion est fortement lié à la qualité de séchage et de conservation des papiers de ponte.
Néanmoins, peu importe la méthode, nos essais n’ont pas permis d’atteindre une moyenne supérieur 90 % obtenus par Maiga et al. (2020), Zheng et al. (2015) ou encore Iyaloo and Facknath (2017). Certains résultats faibles peuvent s’expliquer par l’utilisation de papiers conservés avec une humidité ambiante trop élevée et trop longtemps provoquant l’éclosion d’une proportion d’œufs directement sur le papier.
Dans la publication de Monteiro et al., (2007), le taux d’éclosion s’est montré très dépendant de la température de l’eau ce qui n’a pas été évalué dans cette étude. Or l’insectarium utilisé pour la souche SPAM et AGROPOLIS n’était pas dans les mêmes conditions de température tout au long de l’expérimentation, ce qui a pu fausser les résultats.
Nous avons également rencontré de mauvaises synchronisations d’éclosion provoquant des développements larvaires non homogènes et ainsi un surdosage de nourriture. Une autre méthode d’éclosion consiste à déposer les œufs dans une eau préalablement désoxygéné à l’aide d’un dessiccateur et d’une pompe à vide. Cette méthode semble donner de bons résultats de synchronisation (Comm. Pers.
Marie Rossignol (IRD)), il serait intéressant de pouvoir comparer cette méthode avec la méthode utilisée lors de nos expérimentations
Une forte corrélation entre le poids et le nombre d'œufs a été observée. Nous obtenons une pente (a) de 0,0065 très similaire à celle obtenue sur Aedes albopictus par Zheng et al (0,007). L’ordonnée à l’origine obtenue est très proche de zéro (0,27) et diffère de celle obtenue sur Aedes albopictus par Zheng et al (3,01). Compte tenu des variables étudiées (nombre et masse), il semble logique que l’ordonnée à l’origine tende vers zéro. Ces légères différences obtenues peuvent être expliqués par des biais de comptage et de manipulations des papiers de ponte mais également par des souches différentes d’Aedes albopictus. Il est aussi possible que nos papiers contenant souvent des œufs éclos ait fait baisser la masse totale du papier. Dans leur publication, le taux d’éclosion se trouvent autour de 90% alors que nous avons utilisé des papiers de ponte avec une moyenne de 64%. Il serait intéressant de comparer ces deux équations afin de vérifier si leurs différences sont dues ou non à des fluctuations d’échantillonnage. Cette nouvelle équation peut être utilisée pour l’élevage de masse de cette souche à l’EID Méditerranée. Celle- ci pourra être affinée et confirmée par des échantillonnages complémentaires.
Concernant l’effet du brossage, il y a eu confirmation des propos énoncés dans la publication de Zheng et al. (2015). Mais les étapes de transferts constituent un biais sur les résultats.
De plus, les œufs qui sont détachés de leur papier ont tendance à se retrouver à la surface de l’eau voir sur la face interne du récipient utilisé, donc au-dessus du niveau de l’eau, malgré les précautions prises. Cela peut expliquer potentiellement le taux d’éclosion plus faible sur certaines manipulations.
L’expérience sur le régime alimentaire a permis de confirmer les bénéfices attendus du régime alimentaire préconisé par la FAO/IAEA (Maiga et al., 2020) En effet, les larves nourries avec le régime alimentaire IAEA à 4% ont montré un développement plus synchronisé et rapide.
La nymphose obtenue à J6 au cours de cette expérience (contre J5 au cours des autres expériences) est certainement dûe à un défaut de régulation de température de l’insectarium qui a eu lieu à J3 et J4 entrainant un ralentissement du développement larvaire. Cependant selon les études de Yamada et al (2019) ainsi que celle de Iyaloo and Facknath (2017), l’émergence au jour 6 est tout de même une durée de développement très courte.
Selon Yamada et al. (2019) la stérilité induite est de 99% chez les nymphes âgées de 10 à 24h contre 93% pour les nymphes 45 à 50h. Avec la nourriture proposée par l’IAEA à 4%, une grande partie des nymphes males apparaissent en moins de 24h. Cette diète semble donc présenter de nombreux avantages pour l’emploi de la TIS.
Concernant la comparaison des méthodes de repas sanguin, le cobaye permet d’obtenir le plus grand nombre d’œufs par femelle avec 30,5 œufs en moyenne contre 12,3 avec le système Hemotek. Ce résultat confirme la plus forte appétence des femelles pour un animal dégageant du CO2, de la chaleur et différentes phéromones. Il est aussi possible qu’individuellement chaque femelle ait pondu autant d'œufs mais que sur le nombre total de femelles, un nombre inferieur se soient gorgées avec les méthodes artificielles.
Les essais avec le boudin de sang utilisé n’ont pas été concluants avec seulement 2 œufs par femelle en moyenne. La faible attractivité du boudin de sang peut s’expliquer par la chute de température de ce dernier au cours du temps. Enfin, les passages réguliers au bain-marie sont chronophages. Une comparaison de la production d’œufs par femelle entre Hemotek et boudin de sang a été faite par Iyaloo and Facknath (2017). Ils obtiennent aussi de meilleurs résultats avec Hemotek avec 16 œufs/femelle contre 8 œufs/ femelle avec boudin de sang. La valeur que nous avons obtenue (12,3 œufs par femelle) semble valide compte tenu de leur résultat (16 œufs/femelle).
L’utilisation de repas de sang artificiel est encouragée à l’EID Méditerranée pour le bien-être animal. De plus, l’utilisation de cobaye nécessite la maintenance d’une animalerie et du personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Le recours à de nombreux repas sanguins nécessaires à un élevage de masse rend l’utilisation d’une méthode artificielle incontournable. L’Hemotek semble être une bonne alternative artificielle car la production d'œufs est conséquente. Son rendement plus faible peut être compensé par l’augmentation de la fréquence des repas sanguins.
La méthode de comptage des adultes utilisée pour pondérer le nombre d’œufs pondus par femelle ne permet pas un comptage absolu car les individus volants et au sol ne sont pas comptés. De plus, certains s’envolent à la pose de la feuille permettant le comptage. Celle-ci permet de comparer les cages entre elles.
Cette expérience s’est basée sur la publication de Maiga et al. (2019) qui ont effectué leurs comptages avec des zones tracées sur le voile de la cage, ce qui évite que les individus ne s’envolent.
Une façon de rendre cette expérience sur le nombre d'œufs par femelles plus fiable serait de faire une récolte des papiers de ponte chaque jour pour avoir plus de données. De plus, un comptage aurait dû être réalisé avant chaque repas sanguin afin d’avoir toujours le nombre de femelles le plus proche de la réalité.
La mortalité de 4% à 24h due à l’endormissement et au transport des mâles stériles produits au CAA est acceptable. Une augmentation de 10% de mortalité a été observée pour les lots de moustiques marqués. Le marquage des moustiques du CAA a été fait avec 10 mg de poudre contre 5 mg préconisé par la FAO/IAEA. Dans la publication de Culbert et al. (2020) ils obtiennent une mortalité comprise entre
poudre explique donc la mortalité observée. Cependant rien n’explique la mortalité soudaine qui est apparue ensuite et qui a touché toutes les cages. Les taux de survie observés pour ces mâles stériles sont anormalement bas. A 14 jours, les taux de survie auraient dû être de 90% pour les moustiques non marqués et de 75% pour les moustiques marqués avec 10mg (Culbert et al., 2020). La cause reste inconnue. Il s’agit potentiellement de la même cause qui est à l’origine avec la mortalité touchant les moustiques adultes élevés à l’EID.
Un total de 11 000 moustiques a été comptabilisé contre 15 000 attendus. Une partie de cette différence peut s’expliquer par les moustiques en trop mauvais état pour être prélevés et comptabilisés et par l’approximation faite lors de la réalisation des lots de nymphe au CAA. Une partie de cette différence reste néanmoins inexpliquée.
Concernant l’amplification de la souche AGROPOLIS et son élevage en masse, des résultats encourageants ont été obtenus. Néanmoins, de fortes mortalités ont freiné de manière très significative son amplification.
Les conditions extrêmes de l’élevage de masse des larves permettant une forte productivité sur un temps court sont la température de l’eau (28°C), les quantités journalières de nourriture ajustées au nombre de larve et la faible hauteur d’eau. Une sous ou surestimation du nombre d’individus (par mauvaise évaluation du nombre d’œufs et/ou du taux d’éclosion et/ou par mauvaise synchronisation d’éclosion) peut avoir des conséquences :
- Un surnombre peut ralentir le développement des individus par manque de nourriture.
- Un sous-effectif entraîne une surdose de nourriture pouvant entrainer une dégradation du milieu et provoquer de la mortalité Ce type de mortalité a été observée dans la publication de Damiens et al.
(2012) avec un taux de survie passant de 90% à 55% en doublant les doses de nourriture.
Ces conditions pourraient être à l’origine de développement de bactéries ou de champignons entomopathogène expliquant les mortalités observées.
Une autre cause possible serait une contamination par un biocide. Des biocides sont stockés et utilisés au laboratoire, tels que la deltaméthrine ou le pyriproxyfène. Concernant ce dernier, il fait partie des biocides connus affectant les nymphes et les adultes. Ce biocide est un inhibiteur de croissance, analogue de l’hormone juvénile, provoquant des inhibitions du développement, des troubles du comportements mais aussi des baisses de fertilité des adultes (Darriet et al., 2007). A plus de 0,00033mg/l il cause plus de 90% de mortalité sur les nymphes d’Ae. aegypti (Darriet et Corbel, 2006). Si des adultes émergent, il entraînera leur mortalité à partir de 0,0002 mg/l et peut aussi être transporté par les femelles lors de l’oviposition ce qui a pour conséquence de contaminer le gîte larvaire (Darriet et Corbel, 2006).
Des échantillons de larves, d’adultes et d’eau ont été conservés afin de faire des recherches de biocide ou d’agent pathogènes.
Par principe de précaution la souche AGROPOLIS est aussi en élevage de routine dans un autre insectarium depuis son arrivée à l’EID Méditerranée.
D’un point de vue logistique il est possible d’obtenir une production élevée dans les insectariums de l’EID Méditerranée sans utiliser les plateaux d’élevage de l’IAEA ainsi que le rack associé. Cependant cela prend plus de place et de temps, sans rack, chaque plateau doit être manipulé indépendamment.
L’utilisation d’un rack contenant 50 plateaux d’élevage de masse permet d’élever 175 000 larves d’Anopheles arabiensis (à 2 larves/cm2) en simultané ce qui correspond à 315 000 larves Ae. albopictus (à 3,6 larves/cm2) (Balestrino et al. 2012). Dans notre insectarium dédié, il est théoriquement possible d’avoir 24 plateaux contenant 6000 larves soit 144 000 au total.
IV-2 Discussion des résultats attendus
Des essais préliminaires en Italie ont montré qu'une libération hebdomadaire de 900 à 1600 mâles stérilisés par hectare induit un niveau de stérilité significatif dans les populations locales d’Ae. albopictus (Bellini et al., 2013). Les 1000 mâles stériles / ha lâchés dans le cadre de ce projet pourraient permettre d’obtenir des résultats similaires. Néanmoins le niveau de stérilité va dépendre de la densité de moustiques sauvages. Les lâchers prévus initialement à partir du 1er juin 2021 sont reportés aux mois de juillet et août, mois durant lesquelles les populations locales d’Ae. Albopictus présentent les plus fortes densités. La forte densité de mâles sauvages à cette période risque de réduire l’efficacité des lâchers.
Il est également attendu d’obtenir une stérilisation n’altérant pas la compétitivité des mâles dans leur milieu naturel car la dose sera de 35 Gy. Cette valeur est mentionnée comme celle présentant le plus fort taux de réussite de stérilisation (99%) en assurant une compétitivité optimale (Balestrino et al. 2017).
En laboratoire, l'insémination des femelles est un succès dans 80% des cas, que le mâle soit stérile ou non (Oliva et al., 2013). De plus, les femelles soumises à cette dose ne sont plus en capacité de pondre (Bond et al., 2019). Cependant ces femelles pourront tout de même se mettre à la recherche d’un repas sanguin et peuvent donc transmettre des maladies. Même avec un faible taux d’erreur dans l’étape de séparation des sexes (moins de 1%) les diverses méthodes utilisées que ce soit par des tamis (Balestrino et al. 2010) ou un trieur de nymphe devront être améliorées si la TIS est mise en place à plus grande échelle (Alphey et al. 2010 ; HCSP 2018).
Les types de pièges utilisés pour cet essai sont les mêmes que ceux utilisés par Bellini et al. (2013) mais aussi dans le guide de la FAO/IAEA sur le marquage-lâcher-recapture en 2020.
Il existe pourtant un biais à l’utilisation des pièges pondoirs. Leur mode de fonctionnement est l’imitation d’un gîte, ainsi selon le nombre de gîtes alentour les femelles peuvent avoir une préférence pour un autre gîte. De plus, environ 1,88% des œufs pondus par des femelles sauvages ayant été fécondées par des mâles stériles seront en fait fertiles (Bond et al., 2019) mais cette donnée ne sera pas vérifiable sur le terrain.
Le drone permet une dispersion supérieure aux méthodes de lâchers au sol. Cependant le taux de recapture associé est plus faible que celui obtenu avec les lâchers au sol (Bouyer, Culbert et al., 2020).
Néanmoins, il pourrait être une meilleure alternative aux techniques de lâchers depuis le sol, en termes de coût mais aussi d'efficacité (Bouyer, Culbert et al., 2020).
L’analyse des données récoltées se basent sur des conditions (Bouyer, Balestrino et al. 2020) qui peuvent ne pas être entièrement vérifiées et peuvent donc constituer donc des biais :
- Les mâles stériles marqués ont un taux de survie et de capture égale à celui des mâles sauvages.
- La population est fermée, c'est-à-dire qu’aucun nouvel individu n’entre ni ne sort de la zone.
- Le délai est suffisant entre le lâcher et la recapture afin de permettre une dispersion au hasard des mâles stériles.
- Une faible densité de mâle sauvage.
Un dernier point concerne l’acceptation de la méthode par les riverains et plus généralement par la population et la communication qui y est associée. Ces éléments doivent être pris en compte pour garantir la réussite d’un tel projet. A La Réunion une enquête de l’IRD a montré que seul 34% des habitants avaient déjà entendu parlé de la technique de la TIS. 2 personnes sur 3 ont eu une réaction positive en prenant connaissance de son fonctionnement. En métropole, les enjeux n’étant pas les mêmes (nuisance plutôt que lutte anti vectorielle) ces chiffres pourraient être différents.
Le projet n’étant pas finalisé, il reste encore de nombreux questionnements autour des lâchers expérimentaux et de leurs résultats. Certains biais n’ont donc pas encore été identifiés.
V- Conclusion :
Les différentes évaluations réalisées sur la méthode d’élevage de masse ont permis de calibrer et de standardiser celle-ci. Le régime alimentaire des larves et les conditions d’élevage permettent un développement accéléré et une nymphose plus synchrone nécessaire à la production massive de mâles.
Cette méthode est chronophage et nécessite beaucoup de rigueur comparée à un élevage de routine.
Certaines évaluations réalisées vont permettre d’optimiser la méthode d’élevage actuellement utilisée à l’EID Méditerranée (protocole de séchage et de conservation des œufs, comparaison de méthode de repas sanguins). Compte tenu du problème de mortalité massive rencontré dans l’insectarium, l’amplification de la souche Ae.albopictus AGROPOLIS n’a pas pu être réalisée comme prévu. La collaboration avec le CAA va donc permettre la production nécessaire aux lâchers prévus à Prades-Le-Lez durant les mois de juillet et août.
Concernant la problématique du moustique tigre dans la région montpelliéraine, la TIS pourrait être une méthode complémentaire aux méthodes de lutte anti-vectorielle actuelles. Néanmoins, dans le cas du sud de la métropole, il est légitime de remettre en question la validité des conditions de réussite : une population fermée et une faible densité au moment des lâchers. Avant de passer en phase opérationnelle, une étude de faisabilité sera nécessaire
Ce projet et l’ensemble des essai relatifs à la TIS appliquée aux moustiques contribueront à enrichir les connaissances sur le sujet et potentiellement des solutions.
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