HAL Id: tel-02819703
https://hal.inrae.fr/tel-02819703
Submitted on 6 Jun 2020
HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires
canines, modèles de maladies neuromusculaires
Marie Maurer
To cite this version:
Marie Maurer. Caracterisation genetique et fonctionnelle d’affections canines, modèles de maladies neuromusculaires. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, 2010.
Français. �tel-02819703�
THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité Génétique
Ecole doctorale Complexité du Vivant Présentée par
Mlle Marie MAURER Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE
Caractérisation génétique et fonctionnelle d'affections canines, modèles de maladies neuromusculaires
soutenue le 13 décembre 2010
devant le jury composé de : (préciser la qualité de chacun des membres).
M. Pascal Maire Rapporteur
Mme Pascale Quignon-Cadieu Rapporteur M. Dominique Higuet Président Mme Gillian Butler Browne Examinateur
M. Marc Bitoun Examinateur
M. Jean-Panthier Directeur de thèse
M. Laurent Tiret Directeur de thèse
Université Pierre & Marie Curie - Paris 6 Bureau d’accueil, inscription des doctorants Esc G, 2ème étage
15 rue de l’école de médecine 75270-PARIS CEDEX 06
Tél. Secrétariat : 01 44 27 28 10 Fax : 01 44 27 23 95 Tél. pour les étudiants de A à EL : 01 44 27 28 07 Tél. pour les étudiants de EM à MON : 01 44 27 28 05 Tél. pour les étudiants de MOO à Z : 01 44 27 28 02
Les myopathies myotubulaire/centronucléaires chez l'homme constituent un groupe de maladies congénitales rares. Leur étiologie moléculaire a été largement documentée ces dernières années et les protéines impliquées ont toutes un rôle dans la formation, le maintien ou le fonctionnement des tubules T au sein des triades de la cellule musculaire.
Des formes spontanées de myopathies présentant des caractéristiques cliniques similaires aux myopathies humaines ont été décrites chez le Labrador. Grâce à un pedigree français, une mutation causale dans le gène PTPLA a été identifiée et consiste en l'insertion d'un rétrotransposon dans l'exon 2 du gène.
Notre travail a permis de démontrer que ces différentes myopathies du Labrador découlent de la même mutation fondatrice et constituent une maladie unique pour laquelle nous proposons le nom de myopathie centronucléaire du Labrador Retriever.
Afin d’en caractériser les mécanismes physiopathologiques, nous avons décrit le profil d'expression de PTPLA chez le Chien puis chez la Souris. Deux isoformes majeures issues de variants d'épissage ont été identifiées, dont l’expression varie selon les organes et parfois, selon leur étape développementale. De plus, la mutation cause une perturbation de l'épissage dans tous les organes du chien malade.
Afin d'identifier les isoformes effectivement traduites, des anticorps ont été caractérisés. Pan- spécifiques, ils permettront de décrire l'expression de PTPLA et sa localisation sub-cellulaire.
Finalement, des anomalies du réseau de tubules T dans les myofibres de chiens atteints ont été identifiées, confirmant sa qualité en tant que modèle biomédical pour l’étude des maladies homologues humaines.
Mots-clefs : Modèle canin – Myopathie centronucléaire – Physiologie musculaire – Génétique –
Physiologie comparée – Biologie cellulaire
Myotubular/centronuclear myopathies form a group of rare congenital diseases in man. Their molecular etiology has been widely investigated over the last years and proteins involved in those diseases all contribute to formation, maintenance or function of T-tubules in muscle cells triads.
In Labradors, spontaneous myopathies with similar features have been described worldwide.
Thanks to a French pedigree, a causal mutation in the PTPLA gene has been linked with the disease.
It consists in the insertion of a retrotransposon in exon 2 of the gene.
Our work has shown that these various myopathies in Labradors are indeed caused by a single mutation resulting from a founder effect and thus constitute a single disease entity for which we suggest the name of « centronuclear myopathy of the Labrador Retriever ».
In order to better characterize the pathophysiological mechanisms of this disease model, we analyzed the expression pattern of PTPLA in dogs and mice. Two major splice transcripts have been described which are expressed differently in a space and time-dependent manner. In addition, the mutation induced defects in the splicing in every organ sampled in affected dogs.
Pan-specific antibodies have been characterised in order to identify and precisely localize protein isoforms of PTPLA.
Finally, anomalies in the T-tubules network have been described in myofibers from affected dogs, confirming the relevance of this spontaneous model for comparative pathology and ultimately, for preclinical trials.
Keywords : Canine model – Centronuclear myopathy – Muscle physiology – Genetics –
Comparative physiology – Cell biology
- . ' Je tiens à remercier chaleureusement Mme Pascale Quignon Cadieu et M Pascal Maire d avoir
' . .
accepté d être rapporteurs pour mon jury de thèse Je remercie également M Dominique Higuet
' . '
d avoir accepté de présider le jury ainsi que Mme Gillian Butler Browne et M Marc Bitoun d y prendre part.
, .
Je suis reconnaissante aux membres du comité qui a accompagné le déroulement de ma thèse M
, . . ,
Pascal Maire M Frédérique Relaix et M Jocelyn Laporte pour leur intérêt dans mon travail et
, .
leurs suggestions toujours utiles et bienvenues
' - -
J adresse des pensées chaleureuses à Jean Jacques Panthier et Geneviève Aubin Houzelstein de
' .
m avoir chaleureusement accueillie au sein du laboratoire de Génétique Fonctionnelle et Médicale
,
Un grand merci également à Laurent Tiret qui a encadré ma thèse et a su se montrer tout à la fois
, ( ) .
enthousiaste disponible le plus possible et encourageant Si je dois garder de nombreux bons
, .
souvenirs de cette période de thèse beaucoup ont fleuri de nos conversations
, .
Merci à Stéphane Blot Inès Barthélémy et tout le personnel du laboratoire de neurobiologie Nos
.
échanges sur les chiens myopathes ont souvent été riches et fructueux
, ,
Je voudrais également remercier Jocelyn Laporte Anne Toussaint et Johann Böhm avec qui la collaboration est toujours un plaisir.
I would like to thank Gemma Walmsley and Richard Piercy Besides the great scientific.
, .
collaboration you have been very nice and I had a wonderful time in London My thanks to
.
everybody in the muscle group at the Royal Veterinary College for making me feel welcome
' ' , , , ,
L ouverture d esprit les échanges sur des milliers de sujets scientifiques politiques personnels
' ' .
l écoute dont fait preuve l ensemble des personnes du laboratoire créent une ambiance inestimable
...
Un grand merci à Fanny pour tous ces éclaircissements et discussions sur des sujets scientifiques
' ! , , , , , '
et d autres Merci encore et à Geneviève Giorgia Florence Patricia Rachel de m avoir si bien
« encadrée » autour de la maternité Merci à tous les membres du laboratoire pour leur gentillesse . ,
, '
leur aide leur promptitude à partager aussi bien les points délicats d une manip que les derniers
, , , , ( )
sujets de rigolade Laurent Stéphanie Papy Sophia dont le départ a laissé un bien grand vide et
. , '
Matthieu Une petite pensée pour Carole qui m a accompagnée comme une jumelle pendant une année très riche.
, ' ,
Sans oublier les autres thésards ceux qui m ont précédé et formé aux méandres de la thèse Johanna
, , , , .
et Manu et ceux qui me suivent Cécile Jordan Edouard
, : , . mercredis matins en particulier Charlène avec Johanna vous avez été deux vraies grandes sœurs
, , ,
Mes plus tendres pensées à ma famille toute et entière bien que dispersée et en particulier ma
, , - '
mère pour sa tendresse mon père pour son soutien constant mes grands parents qui m ont inspiré
, ,
tant dans mon parcours scientifique que par leur gentillesse inébranlable ma sœur Mylène une
' , , .
personne formidable que j admire sans cesse mon frère Stéphane mes neveux et nièces
... ' '
Merci aussi à ma seconde famille de m avoir si bien accueillie qu ils sont réellement une seconde famille.
, , ' .
Toute ma gratitude et mon amour à Damien pour hier pour aujourd hui et pour demain Merci de
' , ' , ' , .
m avoir soutenue d avoir eu besoin de mon soutien d être là et de tout partager tous les jours
' , '
Merci enfin au petit bout qui m a accompagné pendant cette dernière partie de thèse de l idée à la
, . ' .
présence chaque jour plus évidente J ai hâte de te rencontrer
à notre enfant.
As dreams are made on; and our little life
Is rounded with a sleep. »
William Shakespeare, The Tempest, Act 4, scene 1.
Résumé Abstract
Remerciements Table des
matières...1
Table des figures...3
Liste des abréviations...4
I Introduction...6
I.1 Physiopathologie musculaire...6
I.1.1 Le muscle strié...6
I.1.1.a Structure du muscle strié squelettique sain...6
I.1.1.b L'appareil contractile...7
Les tubules T...8
Le cytosquelette intermédiaire...10
I.1.1.c Le noyau...11
I.1.1.d L'œsophage, un muscle mixte particulier...13
I.1.2 Les myopathies centronucléaires humaines et les protéines impliquées...15
I.1.2.a La myotubularine (MTM1) et la famille des MTMR...17
Présentation...17
Les affections liées aux MTMs...20
Identité et trafic des membranes...20
Les modèles animaux invalidés pour MTM1...22
I.1.2.b BIN1, la dynamine 2 et la connexion MAD...26
BIN1...26
Dynamine 2...27
La connexion MAD...29
I.2 Intérêt génétique et médical du modèle canin...30
I.2.1 Histoire évolutive : apparition du Chien, création des Races...31
I.2.2 Conséquences sur sa structure génomique...32
I.2.3 Utilisations du modèle canin...35
I.3 Un modèle spontané de myopathie centronucléaire chez le Labrador Retriever...37
I.3.1 Description clinique et histologique...37
I.3.2 PTPLA, muté dans la myopathie centronucléaire du Labrador...38
I.3.2.a Profil d'expression de PTPLA chez les Mammifères...40
I.3.2.b Les homologues de PTPLA dans l'évolution...40
Structure des orthologues et paralogues de PTPLA...40
Fonction des orthologues de PTPLA...42
I.3.2.c Hypothèses fonctionnelles sur le rôle de PTPLA chez les Mammifères...47
Implication de PTPLA dans d'autres maladies ?...47
II Matériel et Méthodes...49
III Résultats...52
III.1 Caractérisation génétique de PTPLAcnm...53
III.1.1 Une origine unique de la mutation...53
III.1.1.a Résumé du travail expérimental...53
III.1.1.b Article 1...53
III.1.2 Profil d'épissage du gène PTPLA chez la souris, le chien sain et le chien CNM...54
III.2.1 Prédictions structurales des isoformes majeures de PTPLA ...57
III.2.2 Caractérisation d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine PTPLA...60
III.2.3 Analyse préliminaire du profil d'expression de PTPLA...66
III.3 Caractérisation physiopathologique...70
III.3.1 Anomalies de tubulation...70
III.3.1.a Article 2...71
III.3.2 L'œsophage, un muscle particulier...72
IV Discussion...79
IV.1 La myopathie centronucléaire du Labrador Retriever : une affection du muscle squelettique ?...79
IV.2 Quel(s) rôle(s) pour PTPLA et les AGTLC dans le muscle strié ?...82
IV.3 Caractérisation des myopathies centronucléaires du Labrador Retriever : bénéfices zootechniques et médicaux...86
V Bibliographie...88
Annexe I : Histoire évolutive du Chien et des races revisitée par la génomique...I
Annexe II : Une myopathie myotubulaire liée à une mutation perte de fonction dans MTM1 chez le
Labrador Retriever...II
Annexe III : Caractérisation d'une mutation dans l'Arylsulfatase G canine associée à une céroïde-
lipofuscinose neuronale...III
Figure 1 : Organisation du muscle squelettique, de l'échelle macroscopique à l'échelle
ultrastructurale...7
Figure 2 : Représentation schématique du couplage excitation-contraction et des structures associées dans la fibre musculaire...9
Figure 3 : Représentation du réseau des filaments intermédiaires dans la cellule musculaire et leur interaction avec les organelles et les myofibrilles...11
Figure 4 : Illustration de la formation de fibres musculaires (myofibres)...12
Figure 5 : Représentations des myotubularines humaines et hypothèses concernant le rôle des myotubularines inactives...19
Figure 6 : Métabolisme des phosphoinositides et maladies associées...21
Figure 7 : Localisation subcellulaire des phosphoinositides...22
Figure 8 : Caractéristiques histologiques de la souris KO pour Mtm1...23
Figure 9 : Anomalies structurales et fonctionnelles des triades chez le poisson zèbre invalidé pour MTM1...25
Figure 10 : Représentation schématique de la connexion Myotubularine/Amphiphysine 2/Dynamine 2 (MAD)...29
Figure 11 : Structure haplotypique des races de chiens...33
Figure 12 : Exemple de stratégie de cartographie d'un locus lié à un caractère, ici le caractère phénotypique "blanc"...34
Figure 13 : Caractéristiques histologiques de la myopathie centronucléaire du Labrador...38
Figure 14 : L'insertion d'un SINE dans l'exon 2 du gène PTPLA induit un épissage défectueux des transcrits chez le chien homozygote...39
Figure 15 : Alignement des séquences protéiques de PTPLA chez différentes espèces...41
Figure 16 : Arbre phylogénétique des séquences de protéines liées aux PTPL...42
Figure 17 : Description des cycles d'élongation des acides gras et des homologues de PTPLA...45
Figure 18 : PHS1 possède 6 domaines transmembranaires dont les extrémités C-terminale et N- terminale sont orientées vers le cytoplasme...46
Figure 19 : Profil d'épissage spatio-temporel chez la souris et le chien...57
Figure 20 : Description des isoformes de PTPLA amplifiées dans le cœur de chien sain et atteint. .58 Figure 21 : Prédiction de la conformation des isoformes de PTPLA chez le chien (cPTPLA)...60
Figure 22 : Détermination des conditions de dénaturation nécessaires à la visualisation des protéines PTPLA-Myc par immunodétection de Myc ou PTPLA...64
Figure 23 : Test des différents anticorps dirigés contre PTPLA sur des protéines surexprimées en cellules HEK293T...66
Figure 24 : Reconnaissance des différentes isoformes de PTPLA par les anticorps 313 et 314...67
Figure 25 : Test de la spécificité du signal en immunofluorescence sur tissus animaux par compétition de peptide...69
Figure 26 : Comparaison du signal donné sur embryon de souris à E14.5 par les anticorps 313 et 314 avec les signaux obtenus par hybridation in situ...70
Figure 27 : Marquage immunohistochimique des isoformes de chaînes lourdes de myosine et d'une isoforme de SERCA dans l'œsophage d'un chien sain et de deux chiens atteints...76
Figure 28 : Composition des œsophages en muscle lisse et strié...78
Figure 29 : Infiltration de muscles lisses dans la portion médiale de l'œsophage de chiens CNM....79
ADCNM : Myopathie Centronucléaire Autosomique Dominante ADN : Acide Déoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaires
AGTLC : Acides gras à très longue chaîne
ARCNM : Myopathie Centronucléaire Autosomique Récessive ARN : Acide Ribonucléique
ATP : Adénosine Triphosphate BAR : Bin/Amphiphysine/Rvs BIN1 : Bridging Integrator 1
CD34 : Cluster de différenciation 34 CDKA : cyclin-dependent kinase A CMT : Charcot-Marie-Tooth CNM : Myopathie Centronucléaire DHPR : Récepteur à la Dihydropyridine DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO : Diméthylsulfoxide
DNM2 : Dynamine 2 DTT : Dithiothréitol
EDMD : Dystrophie Musculaire d'Emery-Dreifuss EMS : éthyl méthyl sulfonate
FAS : fatty acid synthase
FGF4 : Fibroblast Growth Factor 4 FISH : fluorescent in situ hybridization FYVE : Fab1p, YO1B, Vac1p and EEA1 GED : GTPase effector domain
GFP : Green Fluorescent Protein
GRAM : Glucosyltransferase, Rab-like GTPase Activator and Myotubularins GRMD : Dystrophie Musculaire du Golden Retriever
GTP : Guanosine Triphosphate
HACD : 3-Hydroxyacyl-CoA Deshydratase HEK : Human Embryonic Kidney
HMLR : Myopathie héréditaire du Labrador Retriever
IGBMC : Institut de Génétique, Biologie Moléculaire et Cellulaire IGF1 : Insulin-like Growth Factor 1
ISH : in situ hybridization KO : Knock Out
Lox/FRT
MAD : Myotubularine/Amphiphysine 2/Dynamine 2 MHC : Chaîne Lourde de Myosine
MTJ : Jonction Myotendineuse MTM1 : Myotubularine 1 MTMR : Myotubularin-Related
NCBI : National Center for Biotechnology Information
NMJ : Jonction Neuromusculaire
PCR : Polymerase Chain Reaction PH : pleckstrin homology
PHS1 : PTPLA homolog involved in Sphingolipid biosynthesis 1 PIs : phosphatidylinositols
PRD : prolin rich domain
PtdIns3P : Phosphatidylinositol 3 phosphate PtdIns4P : Phosphatidylinositol 4 phosphate
PtdIns(4,5)P
2: Phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate PTEN : Phosphatase and TENsin homolog
PTP/DSP : Protein Tyrosin Phosphatase/ Dual Specificity Protein PTPLA : Protein Tyrosin Phosphatase-Like, member A
PTPLAD : PTPLA Domain-containing
PTPLB : Protein Tyrosin Phosphatase-Like, member B PTPLR : Protein Tyrosin Phosphatase-Like Related qRT-PCR : quantitative Real-Time PCR
RID : Rac-Induced recruitment Domain
RyR : Ryanodine Receptor – Récepteur à la Ryanodine SAGE : Serial Analysis of Gene Expression
SDS : Sodium Dodécyl Sulfate
SERCA : Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase SH3 : src homology 3
SILV : Silver homolog
SINE : Short Interspersed Nuclear Element SNP : Single Nucleotide Polymorphism SUN : Sad1p/UNC-84
Syne : Synaptic Nuclear enveloppe
XLMTM : Myopathie Myotubulaire liée à l'X
I Introduction
I.1 Physiopathologie musculaire I.1.1 Le muscle strié
I.1.1.a Structure du muscle strié squelettique sain
Chez les Mammifères, deux types de muscles diffèrent par leurs aspects histologiques et physiologiques. A l'histologie, les muscles striés ont un aspect rayé qui les distingue des muscles lisses. Les muscles lisses sont les muscles des organes viscéraux, ils permettent par exemple le péristaltisme et la progression du bol alimentaire dans le tractus digestif. Ils sont également présents dans le système vasculaire et sont les acteurs de la vasomotricité.
Le muscle strié est un tissu contractile qui permet aux animaux de se mouvoir, de maintenir leur posture et leur température corporelle. Les muscles striés squelettiques sont innervés par le système corticospinal et effectuent donc les mouvements volontaires, contrairement au muscle cardiaque, muscle strié particulier qui est innervé par le système nerveux autonome.
Les muscles squelettiques ont une organisation structurale répétée aux différents niveaux
d'organisation (Figure 1). Un muscle, délimité par deux ou plusieurs tendons, est entouré d'un
fascia, l'épimysium. Il est constitué de faisceaux de fibres, visibles à l'oeil nu, séparés par le
périmysium. Comme chaque faisceau est composé de multiples fibres, les fibres musculaires,
longues cellules syncitiales entourées de l'endomysium, sont composées de nombreuses
myofibrilles. Celles-ci sont des structures consistant en la répétition de l'élément contractile de base
(Figure 1).
I.1.1.b L'appareil contractile
L'unité contractile, le sarcomère, compose les myofibrilles qui occupent la majorité du volume de la fibre musculaire. En microscopie électronique, il est possible de détailler les bandes sombres et claires qui donnent au muscle l'aspect strié. Les disques Z (de l'allemand zwischen, « entre ») sont les limites des sarcomères. La bande A (anisotropique) sombre représente l'espace occupé par les filaments épais de myosine superposés aux filaments d'actine, à l'exception de la zone H au centre
Figure 1: Organisation du muscle squelettique, de l'échelle
macroscopique à l'échelle ultrastructurale. (Issu de Sciote et al., 2000)
(de l'allemand heller, « plus clair »), dépourvue de filaments d'actine. La bande I (isotropique) claire entoure les disques Z ; on n'y trouve que les fins filaments d'actine (Figure 1). Il existe différentes isoformes des chaînes lourdes de myosine, associées à différentes vitesses de contraction. Elles vont ainsi participer à la détermination du type de fibre. Ainsi, une fibre musculaire de type lent (ou type I) exprime la chaîne lourde de myosine MHC-1 (pour Myosin Heavy Chain, type I). Le type de fibre est par ailleurs déterminé par l'expression d'autres protéines spécifiques, telles que les pompes de réabsorption du calcium dans le réticulum sarcoplasmique (SERCA pour Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase) mais surtout par l'activité oxydative ou glycolytique fournissant l'énergie.
Chaque myofibrille est entourée de mitochondries assurant l'apport énergétique et un apport calcique ainsi que du réseau du réticulum sarcoplasmique, principal réservoir intracellulaire de calcium. Celui-ci forme avec des invaginations de la membrane plasmique, les tubules tranverses ou tubules T, des structures appelées triades qui participent au couplage excitation-contraction. Ces structures sont ancrées le long des sarcomères, au niveau de la transition entre bandes A et I chez les Mammifères. On compte donc deux groupes de triades par sarcomère (Figure 1).
Les tubules T
Les tubules T permettent de propager le potentiel d'action au coeur des fibres musculaires, au plus
près des structures contractiles. Des protéines sensibles au voltage, les récepteurs aux
dihydropyridines (DHPR), canaux calciques de type L, provoquent à la fois un flux de calcium
entrant dans la fibre musculaire et l'ouverture des récepteurs à la ryanodine (RyR), libérant les
stocks de calcium du réticulum sarcoplasmique. Le calcium, en se fixant sur la troponine de
l'appareil contractile, provoque la contraction (Figure 2). Il est ensuite activement re-transféré dans
le réticulum sarcoplasmique par les pompes SERCA (sarco/endoplasmic reticulum calcium
transporting ATPase) dont l'isoforme dépend du type de fibre musculaire (rapide ou lente).
Durant le développement, les tubules T s'organisent progressivement en suivant une séquence d'évènements définis. Chez la souris, les tubules T sont d'abord orientés de manière longitudinale à la fibre avant d'acquérir leur motif transversal, le long des sarcomères, selon des étapes séquentielles. Les tubules T commencent par s'ancrer au réticulum sarcoplasmique, puis les canaux RyR sont incorporés dans ces triades. Alors seulement la triade s'aligne au sarcomère puis acquiert sa position transversale (Takekura et al., 2001).
Durant le développement post-natal du muscle de rat, les fibres musculaires s'allongent par synthèse de protéines des sarcomères à l'extrémité des myofibrilles, au niveau des jonctions myo-tendineuses (MTJ). Les tubules T en position longitudinale disparaissent plus tôt au centre de la fibre qu'aux MTJ, indiquant que la maturation du système membranaire à l'extrémité des fibres s'achève plus tard qu'au centre (Yamashita et al., 2007).
Figure 2: Représentation schématique du couplage excitation-
contraction et des structures associées dans la fibre
musculaire. DHP : dihydropyridine. (modifié de Jurkat-Rott et
Lehmann-Horn, 2005).
Le cytosquelette intermédiaire
Les myofibrilles qui sont alignées entre elles, le réseau des tubules T et du réticulum sarcoplasmique, les mitochondries et enfin le sarcolemme qui doit soutenir et transmettre la force contractile développée par les myofibrilles sont essentiels à la fonction de la cellule musculaire, notamment à travers leur disposition hautement structurée. Des structures répétées particulières au sarcolemme, les costamères, miment les stries des sarcomères et participent à cette organisation. On y trouve notamment le complexe dystroglycane, composé de protéines liées à la dystrophine, qui fait le lien entre le cytosquelette de la cellule et la matrice extracellulaire.
Le cytosquelette, en particulier celui composé des filaments intermédiaires et des protéines associées, est sans doute l'intégrateur de ces structures. La desmine est une protéine de filament intermédiaire spécifique au muscle strié. Elle représente l'un des marqueurs les plus précoces de la myogènèse dans le cœur et les somites. De nombreuses autres protéines de filament intermédiaire, non spécifique au muscle, y sont également exprimées : la synémine, la paranémine, la syncoiline, les kératines 8 et 19. Certaines protéines de filaments intermédiaires, telles la vimentine, la nestine et la kératine 18, sont exprimées transitoirement pendant le développement. Ces protéines sont localisées autour des disques Z des myofibrilles et la plupart se retrouvent au niveau des costamères, jouant sans doute un rôle dans le bon alignement des structures et des organelles de la cellule musculaire.
Comme illustration du rôle intégrateur des filaments intermédiaires dans la fibre musculaire, nous pouvons citer un modèle murin invalidé pour la desmine. Les animaux knock out n'exprimant plus la desmine présentent des anomalies cardiaques et musculaires. Dans ces muscles, on observe une désorganisation de l'alignement latéral des myofibrilles, une altération de leur liaison au sarcolemme, une désorganisation des costamères, des anomalies du nombre et de l'emplacement des mitochondries ainsi qu'une altération de la forme et de la position du noyau (Capetanaki et al., 1997
; O'Neill et al., 2002 ; revus dans Capetanaki et al., 2007).
Des mutations dans les gènes codant pour ces filaments ou pour les protéines associées provoquent
des affections musculaires chez l'homme. Il existe en effet des myopathies appelées myopathies
liées à la desmine, classées dans le groupe des myopathies myofibrillaires. Certains patients
souffrant d'une myopathie d'Emery-Dreifuss ont des mutations dans les gènes de l'émerine ou de la
lamine A/C. La plectine peut également produire un phénotype de myopathie évolutive lorsqu'elle
est mutée.
I.1.1.c Le noyau
La cellule musculaire est polynucléée, car formée par fusion de nombreux myoblastes, cellules précurseurs des cellules musculaires. Durant le développement, les myoblastes prolifèrent, puis s'alignent et fusionnent pour donner un myotube, syncytium allongé dont les noyaux sont placés au centre. Ce myotube se différencie alors en myofibre et les noyaux se localisent sous la membrane plasmique (Figure 4). Sur des modèles in vitro, il a été montré que le mouvement et le placement
Figure 3: Représentation du réseau des filaments intermédiaires dans la cellule
musculaire et leur interaction avec les organelles et les myofibrilles. FIs :
Filaments Intermédiaires. RS : Réticulum Sarcoplasmique (d'après Capetanaki et
al., 2007)
central des noyaux durant la fusion des myoblastes et la différenciation des myotubes est dépendant du réseau des microtubules et de moteurs moléculaires associés (V. Gache, communication au XIII Colloque Myogènèse, 2010). Certains noyaux de la fibre musculaire se spécialisent : ils sont positionnés sous la jonction neuromusculaire (NMJ) et il a été proposé qu'ils soient spécialisé pour maintenir les composants post-synaptiques de la NMJ. Les autres noyaux sont régulièrement répartis tout au long de la fibre. Les mécanismes dirigeant la position et l'ancrage des deux types de noyaux sont encore mal connus.
Le noyau est structuré par la lamina, composé des lamines A, B et C, filaments intermédiaires qui tapissent la face interne de l'enveloppe nucléaire. Les lamines sont en contact avec les réseaux de cytosquelette externes au noyau par des protéines associées : l'émerine et les protéines Synes (pour Synaptic Nuclear envelope, aussi appelées nesprines) dans la membrane interne de l'enveloppe, interagissent avec les lamines. Les protéines Synes interagissent à leur tour avec les protéines SUNs de la membrane externe, qui se lient dans le cytoplasme avec les cytosquelettes d'actine et de filaments intermédiaires (Figure 3). Chez des modèles de souris produisant un variant de Syne-1 avec un effet dominant négatif, les noyaux sous-synaptiques ne sont pas correctement localisés sous la NMJ. Chez des modèles ayant cette fois un variant de Syne-1 auquel il manque le domaine d'interaction avec les SUNs, les noyaux non synaptiques sont également affectés, s'agrègent et se centralisent dans la fibre musculaire (Grady et al., 2005 ; Zhang et al., 2007b). L'ancrage du noyau au cytosquelette à travers les protéines spécialisées de l'enveloppe nucléaire semble donc nécessaire
Figure 4: Illustration de la formation de fibres musculaires (myofibres) : les myoblastes
prolifèrent, s'alignent, puis fusionnent pour donner un syncytium dont les noyaux se
regroupent en position centrale (myotube). A ce stade commence la synthèse des protéines de
l'appareil contractile. Au cours de la différenciation, les noyaux sont ensuite repositionnés le
long du sarcolemme, par un mécanisme encore mal connu.
à sa bonne localisation.
Par ailleurs, des mutations dans ces protéines conduisent à de nombreuses pathologies musculaires chez l'homme : dystrophies musculaires d'Emery-Dreifuss (EDMD) et laminopathies sont liées à des mutations de l'émerine et de la lamine A/C. Des variants dans les Syne-1 et -2 ont également été séquencés chez des patients atteints d'EDMD, indiquant que la rupture des interactions lamines/émerine/Syne est critique dans le mécanisme physiopathologique (Zhang et al., 2007a).
I.1.1.d L'œsophage, un muscle mixte particulier
L'œsophage constitue la partie orale, jusqu'à l'estomac, du tractus digestif avec lequel il partage une même organisation histologique. De la lumière du tube vers l'extérieur, il est formé d'une muqueuse, d'une musculaire-muqueuse, d'une sous-muqueuse, d'une musculeuse et d'une tunique externe. La musculeuse est constituée d'une couche externe avec des cellules musculaires orientées longitudinalement et d'une couche interne avec des cellules musculaires orientées de façon circulaire. La particularité de la musculeuse de l'œsophage est d'être composée d'une fraction variable de cellules musculaires striées dans sa partie antérieure, le reste ayant une musculeuse de type lisse. L'importance de la partie striée varie selon les espèces animales et l'âge. Les amphibiens, reptiles et oiseaux ont un œsophage entièrement lisse, tandis que chez les Mammifères, la variabilité est importante. Chez la souris, le ragondin, le chien et le chat, l'œsophage est entièrement strié et le muscle lisse n'apparaît qu'au niveau du sphincter cardial de l'estomac. Par ailleurs, la transition entre la partie striée et la partie lisse peut être courte ou il peut y avoir des zones présentant à la fois des cellules musculaires lisses et des cellules musculaires striées. Cela a été rapporté chez des espèces de viverridés, de primates et de cétacés (Shiina et al., 2005). Chez l'homme, la première moitié de l'œsophage serait composée majoritairement de muscles striés, avec la présence de cellules de muscle lisse. Cependant, la variabilité entre individus est importante, en terme de pourcentage de muscle lisse dans cette partie de l'œsophage (Katori et al., 2010) et pour la proportion d'œsophage strié (Meyer et al., 1986 ; Wörl et al., 2009).
Chez la souris et l'homme, plusieurs études ont montré que l'œsophage est d'abord composé
uniquement de fibres lisses, progressivement remplacées par des fibres striées au cours du
développement pré et post-natal. Initialement, il a été supposé que les cellules musculaires lisses
subissaient une trans-différenciation (Patapoutian et al., 1995). Cette hypothèse était supportée par
le fait que l'origine du muscle strié dans l'œsophage était méconnue, contrairement aux muscles
squelettiques provenant des précurseurs myogéniques des somites et que l'on n'observait pas de
cellules lisses en apoptose. Cependant, des marquages phénotypiques des lignées musculaires lisses par des marqueurs LacZ ou GFP (Green Fluorescent Protein) ont montrés que les cellules musculaires striés de l'œsophage avait une origine différente, encore inconnue (Rishniw et al., 2003). En 2005, une étude fait l'hypothèse que l'absence d'observation d'apoptose des cellules lisses était lié à des problèmes d'échantillonage trop espacé. Leur approche d'échantillonage plus résolu consistait à analyser par microscopie électronique toute la longueur de l'œsophage de souris à P4. A ce stade, la transition entre muscle lisse et strié progressant le long de l'œsophage de manière craniocaudale est telle qu'il est possible de trouver tous les stades de cette transition. Cette méthode a dévoilé la présence de nombreuses cellules lisses en apoptose, ainsi que des cellules mésenchymales pouvant être les précurseurs des cellules musculaires striées (Wörl et Neuhuber, 2005).
Cependant, les mécanismes dirigeant cette transition restent globalement méconnus. Un élément de régulation a néanmoins été avancé. En effet, l'invalidation chez la souris du gène Pax7, marqueur des cellules souches du muscle, cause un retard et une diminution de cette transition. Par ailleurs, ce retard s'avère dose-dépendant, étant moins important chez les hétérozygotes Pax7+/- que chez les homozygotes Pax7-/-. Pax7 aurait donc un rôle dans la détermination de la taille de la portion striée de l'œsophage (Wörl et al., 2009).
La composition de l'œsophage en terme de type de fibres striées est également très variable selon les espèces. Chez des espèces telles que le rat, le cochon d'inde et le lapin, il semble n'y avoir que des fibres rapides, de type II, tandis que certaines espèces de primates n'auraient au contraire que des fibres de type I. Chez le macaque et l'homme, l'œsophage consisterait en un mélange de fibres de type I et II (revus dans Mascarello et al., 1984). Chez les carnivores que sont le chien et le chat, le type de fibre prédominant apparaît très particulier, avec des caractéristiques histochimiques communes aux fibres de type I et II. Les auteurs de l'étude proposent qu'il s'agit d'un nouveau type de fibre, qu'ils appellent type IIœs (Mascarello et al., 1984).
Le muscle strié squelettique est un organe essentiel chez les Mammifères, dont la fonction est
étroitement corrélée à sa structure complexe. Il existe donc un grand nombre de pathologies
héréditaires liées au muscle, qui se retrouve spontanément chez les animaux domestiques ou que
l'on peut induire chez des espèces de laboratoire. Le cas des myopathies centronucléaires est l'un
d'eux, se présentant chez l'homme et chez le chien.
I.1.2 Les myopathies centronucléaires humaines et les protéines impliquées
Les myopathies congénitales font partie des affections neuromusculaires et se traduisent cliniquement par une faiblesse, une atrophie et une hypotonie musculaires (North, 2008 ; Sharma et al., 2009). Elles sont opposées aux dystrophies musculaires par l'absence, à l'histologie, de signes de nécrose, d'inflammation ou d'importante régénération musculaire. Parmi les myopathies congénitales, on distingue des groupes établis selon des caractéristiques histopathologiques particulières :
–Les myopathies à accumulation de protéines, telles que la myopathie à némaline ; –Les myopathies à cores, comme la myopathie à central core ;
–Les myopathies à noyaux centralisés (myotubulaire et centronucléaires) ; –Les myopathies congénitales avec disproportion des fibres.
La caractérisation génétique de ces maladies a permis d'en faciliter le diagnostic et de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Il en ressort que ces maladies peuvent être génétiquement hétérogènes, c'est à dire qu'une forme homogène de myopathie peut être liée à des mutations dans différents gènes ou inversement, que des mutations dans un seul gène peut causer différentes maladies. De cette manière, le gène du récepteur à la ryanodine, RYR1, est trouvé muté dans des cas de myopathie centronucléaire (Jungbluth et al., 2007 ; Wilmshurst et al., 2010), ainsi que pour des cas de myopathies à central core (McCarthy et al., 2000) et de myopathies à multiminicore (Guis et al., 2004). A l'inverse, les myopathies myotubulaire/centronucléaires décrites ci-dessous ont des mutations dans plusieurs gènes impliquées dans les différentes familles de patients atteints de formes cliniques ou histopathologiques proches.
Le groupe nosologique des myopathies myotubulaire/centronucléaires se caractérise
histologiquement par la localisation anormale au centre des fibres musculaires des noyaux en
chapelet. Pour rappel, les noyaux d'une fibre normale sont localisés en périphérie sous la membrane
plasmique et jamais au centre. Historiquement, la première myopathie de ce groupe, décrite en
1966, a été qualifiée de myopathie myotubulaire en référence aux myotubes. Les myotubes sont les
myofibres embryonnaires ou en régénération dont les noyaux sont placés en position centrale (Spiro
et al., 1966). Comme il était impossible de déterminer si les fibres aux noyaux centralisés étaient
effectivement demeurées au stade développemental du myotube ou si la centralisation du noyau
était un processus plus tardif causant le déplacement du noyau correctement positionné vers le
centre de la fibre, le terme de myopathie centronucléaire a été proposé (Sher et al., 1967). Le mécanisme de centralisation des noyaux dans ces myopathies est encore mal défini, mais intervient tardivement dans les myopathies centronucléaires. Dans la région périnucléaire de ces noyaux centralisés, on ne trouve pas de matériel contractile, mais des aggrégations de mitochondries (Wallgren-Pettersson et al., 1995). Une nouvelle caractéristique histologique a été décrite ces dernières années dans certaines myopathies centronucléaires et consiste en la présence de fibres dites « à collier ». Ces fibres présentent à l'histologie une zone altérée, circulaire, à distance constante de la membrane. Cette zone est basophile, elle consiste en une agrégation de myofibrilles positionnées obliquement, de mitochondries, de réticulum sarcoplasmique et de granules de glycogène (Bevilacqua et al., 2009 ; Liewluck et al., 2010).
Au sein du groupe, les différentes formes ont été classées selon leur mode de transmission et les caractéristiques cliniques et histologiques. La description moléculaire, intervenue plus tard, a conforté en grande partie cette catégorisation.
La forme la plus sévère, récessive et liée au chromosome X, est appelée myopathie myotubulaire (X-Linked MTM ou XLMTM). Le gène impliqué est celui de la myotubularine, MTM1 (Laporte et al., 1996). Elle se déclare en période périnatale. Le foetus a des mouvements réduits dans l'utérus et fréquemment, il y a un polyhydramnios. Les nouveaux-nés atteints souffrent d'une hypotonie sévère, présentent souvent des difficultés de déglutition rendant difficile l'alimentation et dans la majorité des cas nécessitent une assistance respiratoire. Comme dans l'ensemble des myopathies centronucléaires, le niveau de créatine kinase est normal ou seulement légèrement élevé, ce qui indique une absence de lésion tissulaire et notamment musculaire. L'espérance de vie est souvent inférieure à deux ans, les enfants succombant à une détresse respiratoire, à l'exception de cas plus bénins, pouvant atteindre l'enfance, l'adolescence, voire l'âge adulte (Wallgren-Pettersson et al., 1995). A l'histologie, les fibres aux noyaux centralisés ont une morphologie très proche des myotubes. La prédominance des fibres de type I, souvent plus hypotrophiques que les autres, peut évoquer une myopathie congénitale avec disproportion des fibres.
La myopathie centronucléaire autosomique dominante (ADCNM) est principalement due à une
mutation dans le gène de la Dynamine 2, DNM2 (Bitoun et al., 2005). Elle est d'apparition tardive
et de phénotype moins sévère que la myotubulaire. Les symptômes se déclarent de l'enfance à l'âge
adulte, le plus souvent au cours de l'adolescence ou chez le jeune adulte. Cette forme est peu
progressive (Wallgren-Pettersson et al., 1995).
La myopathie centronucléaire de transmission autosomique récessive (ARCNM) est souvent attribuée à une mutation dans le gène de l'Amphiphysine2, BIN1 (Nicot et al., 2007) et dans certains cas dans le gène de la myotubularin-related 14 MTMR14 (hJUMPY ; Tosch et al., 2006). Elle est considérée au niveau clinique comme intermédiaire entre la forme liée à l'X et la forme dominante.
Les cas de forme récessive se déclarent généralement plus tôt, dans l'enfance. Elle est également peu progressive.
Plusieurs cas de myopathies congénitales avec centralisation des noyaux se sont révélées liées à des mutations dans le gène du récepteur à la Ryanodine, RyR1. Selon les familles de patients, la transmission est de type autosomique récessive, parfois dominante avec une expression variable de la maladie selon les individus. La sévérité varie également entre les patients, couvrant des phénotypes équivalents à celui de la XLMTM, ou peu marqués comme celui de l'ADCNM (Jungbluth et al., 2007 ; Wilmshurst et al., 2010)
I.1.2.a La myotubularine (MTM1) et la famille des MTMR Présentation
La protéine MTM1 possède un domaine consensus protéine tyrosine phosphatase HCX
2GX
2R qui montre in vitro une double spécificité d'acide aminé (PTP/DSP) pour les phosphotyrosine et phosphosérine (Laporte et al., 1998). Cependant, l'efficacité de MTM1 pour déphosphoryler les substrats protéiques est très faible in vitro et in vivo chez la levure ; par ailleurs, son site catalytique est proche de celui de Sac1p, une phosphoinositide phosphatase de la levure et ses caractéristiques enzymatiques proches de celles de PTEN (Phosphatase and TENsin homolog), une autre phosphoinositide phosphatase (Blondeau et al., 2000 ; Taylor et al., 2000). Il a en effet été montré in vivo que MTM1 est elle-même une 3'-phosphoinositide phosphatase, dont les substrats sont le phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) et le phosphatidylinositol 3,5-diphosphate (PtdIns(3,5)P
2) (Taylor et al., 2000 ; Blondeau et al., 2000 ; Schaletzky et al., 2003 ; Tronchère et al., 2004).
Les phosphoinositides sont des seconds messagers et de véritables étiquettes membranaires impliquées dans l'identité des organelles, le trafic des membranes et la signalisation cellulaire (décrit plus bas) (Toker et al., 2002).
Par la suite, des protéines apparentées à la myotubularine, appelées MTMR (Myotubularin-related)
ont été décrites, au nombre de 14 et numérotées MTMR1 à MTMR14. Certaines ont conservé un domaine PTP/DSP actif, d'autres ont des variations de ce domaine qui le rendent inactif (Figure 5).
Toutes les protéines ont un domaine RID (Rac-Induced recruitment Domain) nécessaire à leur recrutement à la membrane plasmique par la Rac GTPase activée, ainsi qu'un domaine Glucosyltransferase, Rab-like GTPase Activator and Myotubularins (GRAM) qui se retrouve dans les protéines impliquées dans les processus membranaires. Ce domaine GRAM pourrait aussi se lier aux phosphoinositides. La structure de MTMR2 ayant été étudiée par crystallographie, ce domaine GRAM a révélé avoir une structure proche de celui du domaine PH qui lie les phosphoinositides (Begley et al., 2003). Il est donc parfois annoté domaine PH-GRAM. En plus, certaines MTMR possèdent un domaine supplémentaire de liaison aux phosphoinositides : pleckstrin homology (PH) ou Fab1p, YO1B, Vac1p and EEA1 (FYVE).
Les myotubularines inactives ont été conservées au cours de l'évolution, ce qui suggère qu'elles ont une importance physiologique. Initialement, il a été supposé qu'elles constitueraient des compétiteurs aux MTMs actives (anti-phosphatases) en piégeant le substrat (Cui et al., 1998 ; Hunter, 1998 ; Figure 5). Cependant, plusieurs interactions documentées entre des myotubularines actives et inactives, via leur domaine coiled coil (Robinson et al., 2005), n'affectent pas l'activité phosphatase, suggérant d'autres effets résultant de ces interactions. Certaines MTMRs inactives permettent l'adressage de MTMRs actives à une autre localisation cellulaire ; c'est le cas des interactions MTMR2-MTMR5 et MTM1-MTMR12 (Kim et al., 2003 ; Nandurkar et al., 2003).
Pour d'autres interactions, la présence de la MTMR inactive augmente même l'activité de la MTM
active ; c'est le cas des interactions MTMR2-MTMR5 et MTMR7-MTMR9 (Kim et al., 2003 ;
Mochizuki et al., 2003).
Figure 5: Représentations des myotubularines humaines et hypothèses concernant le rôle des myotubularines inactives. (A) Représentation schématique de MTM1 et de 13 des MTMR. Six sous-groupes sont représentés par des barres verticales. Pour chaque MTM sont indiqués : la longueur en acides aminés, l'emplacement du gène, les interacteurs connus (au niveau protéique ou au (niveau génétique*)) et la séquence du site catalytique. Cette dernière est très conservée chez les MTMs actives ; chez les autres, les acides aminés divergents sont représentés en rouge.
(B) Rôles prédits des MTMs inactives. Si les MTMs actives déphosporylent leurs substrats (en
haut), la fonction des MTMs inactives est moins documentée. Elles pourraient jouer un rôle
d'anti-phosphatase et protéger le substrat par un mécanisme de compétition de substrat (au
milieu) mais des données récentes suggèrent qu'elles peuvent s'hétérodimériser avec leurs
homologues actifs pour augmenter leur activité catalytique ou les recruter à un pool de substrat
spécifique. Elles pourraient aussi modifier leur spécificité de substrat ou acquérir de nouvelles
fonctions. (d'après Laporte et al., 2003)
Les affections liées aux MTMs
Outre la myopathie myotubulaire et certains cas sporadiques de myopathies centronucléaires associées à des mutations dans MTM1 et MTMR14, une MTMR active, il a été décrit des cas de neuropathies démyélinisantes de Charcot-Marie-Tooth causées par des mutations dans le gène de MTMR2 (Bolino et al., 2000) ou MTMR13 (Azzedine et al., 2003).
Les maladies induites par ces mutations et touchant le tissu musculaire ou nerveux indiquent que malgré une activité enzymatique similaire et une expression ubiquitaire, il n'y a pas de redondance fonctionnelle totale entre les différents membres de cette famille, chacun jouant sans doute un rôle exclusif dans un territoire précis.
Par ailleurs, l'implication dans une neuropathie de MTMR13, dont le domaine phosphatase est inactif, souligne l'importance physiologique déjà évoquée de ces pseudophosphatases. La déficience d'une phosphatase et d'une pseudophosphatase donnant un phénotype similaire, cela confirme que les membres actifs et inactifs des MTMs n'ont pas nécessairement un effet antagoniste : leurs interactions peuvent être complémentaires ou moduler leurs activités individuelles (Figure 5).
Identité et trafic des membranes
Le phosphatidylinositol est un phospholipide des membranes dont le groupement inositol peut être
phosphorylé de manière réversible sur les carbones 3, 4 et 5 du cycle, en sept combinaisons
différentes (Figure 6). Les phosphatidylinositols phosphorylés sont regroupés sous le terme de
polyphosphoinositides (PPIn). Ils sont concentrés sur le feuillet cytosolique des membranes de la
cellule. Chaque phosphoinositide a un domaine précis de localisation ; par exemple, le
phosphatidylinositol phosphorylé sur les positions 4 et 5, noté PtdIns(4,5)P
2, est retrouvé
principalement à la membrane plasmique, tandis que le PtdIns4P est majoritairement à l'appareil de
Golgi (Figure 7). Ils jouent ainsi un rôle de recrutement des protéines cytosoliques à des territoires
membranaires précis via les interactions spécifiques des domaines de ces protéines capables de se
lier à la tête inositol différemment phosphorylée. Par exemple, les différents domaines PH
reconnaissent le PtdIns(4,5)P
2et le PtdIns4P tandis que le domaine FYVE lie le PtdIns3P. De cette
manière, ils sont impliqués dans de nombreux processus de signalisation cellulaire, particulièrement
en coopération avec les petites GTPases (revu dans Di Paolo et De Camilli, 2006). A travers ces
étiquettes membranaires, les kinases et phosphatases (telles que les MTMs) modifiant le statut de
ces phosphoinositides participent au trafic membranaire dans la cellule, par exemple l'endocytose et l'exocytose (Figure 6).
Les fonctions permises par les phosphoinositides comprennent la prolifération et la mort cellulaire, le métabolisme, la motilité cellulaire, la régulation du cytosquelette ainsi que le trafic des vésicules intracellulaires (revues dans Toker, 2002). En conséquence, les défauts dans le contrôle du métabolisme des PIs ont été associés à un panel d'affections variées, telles que myopathies, neuropathies, cancers et diabète (revues dans Pendaries et al., 2003 ; Figure 6).
Figure 6: Métabolisme des phosphoinositides et maladies associées. Les différents
phosphoinositides sont représentés ainsi que les phosphatases et kinases qui les modifient. Les
enzymes dans des rectangles oranges ont été clairement associées aux maladies indiquées dans
les ovales de même couleur. (d'après Pendaries et al., 2003)
Les modèles animaux invalidés pour MTM1
Dans le but de caractériser les mécanismes physiopathologiques de la myopathie myotubulaire, plusieurs modèles ont été générés.
Ainsi, un modèle murin d'inactivation du gène Mtm1 a été obtenu par recombinaison homologue (Buj-Bello et al., 2002). Par inactivation conditionnelle (stratégie Lox/FRT), l'exon 4 du gène a été excisé, menant au décalage du cadre de lecture et apparition d'un codon stop prématuré conduisant à une absence de la protéine dans les tissus des souris Knock Out (KO). Phénotypiquement, les mâles atteints sont viables à la naissance mais présentent une faible espérance de vie. Leur croissance est plus faible que les individus sauvages de la même portée et ils développent dès 4 à 5 semaines un déficit moteur progressif décliné en quatre phases. La phase I, entre la naissance et 4-5 semaines, est asymptomatique ; la phase II, entre 4-5 et 5-7 semaines, correspond à la déclaration de la faiblesse musculaire limitée dans un premier temps aux membres postérieurs ; pour la phase III,
Figure 7: Localisation subcellulaire des phosphoinositides (PIs). Seuls les
PIs principaux sont montrés. Au sein des membranes, les PIs peuvent
présenter un disposition hétérogène. EP : Endosome Précoce ; CMV : corps
multivésiculaire. (D'après Kutateladze, 2010)
entre 5-7 semaines et 6-9 semaines, la faiblesse atteint les membres antérieurs et à la phase IV, au delà de 6-9 semaines, les souris sont paralysées des membres postérieurs, ont des difficultés à respirer et meurent de cachexie ou d'insuffisance respiratoire.
A l'histologie, les muscles squelettiques apparaissent normaux durant la phase I puis présentent une hypotrophie des fibres et une centralisation des noyaux progressant avec l'évolution de la faiblesse musculaire (Figure 8). On observe des agrégations de mitochondries dans l'espace périnucléaire des fibres à noyaux centralisés.
Figure 8: Caractéristiques histologiques de la souris KO pour Mtm1. Histologie des muscles de souris à 15 jours (A) et en phase IV (B) colorés à l'hematoxyline-éosine.
Souris KO pour MTM1 (cadres du haut) ou contrôles (en bas). A 15 jours, aucune modification n'est observable. En phase IV, les muscles de souris KO présentent une hypotrophie des fibres avec centralisation des noyaux et des vacuoles de taille variable dans le sarcoplasme des fibres peuvent être observées (<). (C) Quantification de la centralisation des noyaux selon le muscle étudié et la phase de progression de la maladie.
(D) Mesure de la force musculaire par un dynamomètre chez des souris KO et témoins.
(E) Aire des fibres musculaires du quadriceps chez des souris KO et témoins à différentes
phases. (Modifié de Buj-Bello et al., 2002)
Une autre lignée de souris a été créée, dans laquelle le gène Mtm1 est invalidé spécifiquement dans le muscle squelettique (croisement avec une souris portant le gène Cre sous le contrôle du promoteur de l'α-Actine Squelettique Humaine). Le phénotype des mâles invalidés est très similaire à celui résultant du KO total : faiblesse musculaire progressive apparaissant dès 4 semaines, espérance de vie faible et modifications histologiques. A l'opposé, l'invalidation de Mtm1 spécifiquement dans les neurones est sans effet. Mtm1, d'expression ubiquitaire, exerce donc une fonction muscle-autonome dans le muscle squelettique. On en déduit aussi que les MTMRs ne peuvent compenser ce rôle.
Par le caractère précoce de la myopathie myotubulaire humaine et la morphologie des fibres dans les muscles affectés, proche de celle de myotubes, il a été supposé que la maladie était liée à un défaut de maturation du tissu musculaire. Chez la souris KO, le phénotype apparaît bien après la naissance et le muscle apparaît avant cela bien développé et similaire à celui de souris de phénotype sauvage, ce qui indique que la différenciation du muscle n'est pas affectée, mais que les mécanismes physiopathologiques résident plutôt dans le maintien de la structure des fibres musculaires matures.
Les auteurs portent à notre attention le fait que la myogenèse est bien plus précoce chez l'homme que chez la souris : achevée avant la mi-gestation chez l'homme, elle s'achève à la parturition chez la souris.
La localisation subcellulaire de Mtm1 dans la fibre musculaire n'a pu être déterminée pour la protéine endogène, exprimée à un niveau non détectable par les anticorps existants. En revanche, la myotubularine surexprimée par injection intramusculaire d'un vecteur viral se localise au sarcolemme et au niveau des triades le long des sarcomères (Buj-Bello et al., 2008). Cette donnée est compatible avec une série d'observations : des anomalies structurales des triades ont déjà été décrites dans des cas de myopathies myotubulaires (Sarnat, 1990) ; des anomalies de localisation des tubules T et une dérégulation des gènes impliqués dans l'homéostasie du calcium, essentielle au couplage excitation-contraction dans le muscle, ont été retrouvées dans le modèle de souris KO (Al- Qusairi et al., 2009). MTM1 participerait donc à l'homéostasie de la triade.
Un autre modèle animal vient confirmer ces observations. En effet, l'invalidation de MTM par
morpholinos chez le poisson zèbre a révélé que les embryons de poissons mutants ont des
anomalies de morphologie générale, une fonction musculaire altérée mise en évidence par la
réduction de la fréquence et de l'efficacité des mouvements spontanés et induits. Par ailleurs, la
compensation par injection de transcrits de MTMR1 et MTMR2, normalement non exprimés dans
le muscle, corrige ces défauts. Au sein de la famille des MTMRs, ces deux protéines ont l'homologie la plus élevée avec MTM (Dowling et al., 2009). On peut donc en déduire que MTMR1 et MTMR2, bien qu'exprimés dans d'autres territoires, peuvent jouer un rôle redondant avec celui joué par MTM dans le muscle squelettique.
Chez le poisson zèbre déficient en myotubularine, l'analyse des cellules musculaires en microscopie électronique a révélé des anomalies des triades, semblables à celles observées par la même méthode chez les patients souffrant de XLMTM (Dowling et al., 2009). De même, à l'instar de la souris KO, l'anomalie des triades semble chez le poisson zèbre relié à un défaut du couplage excitation- contraction (Figure 9). Ce travail montre également pour la première fois qu'in vivo, un substrat de MTM, le PtdIns3P, s'accumule dans les fibres musculaires en l'absence de MTM. Bien qu'intéressant, ce résultat ne permet cependant pas d'établir un lien direct entre la perte de l'activité phosphatase et les anomalies de triades.
Un lien probable entre les phosphoinositides et la dynamique calcique a été établi à partir d'un récent modèle de souris invalidée pour MTMR14, complété d'analyses in vitro (Shen et al., 2009).
Pour mémoire, des mutations dans MTMR14 ont été associées à des cas sporadiques de myopathies
centronucléaires (Tosch et al., 2006). Les souris MTMR14-KO présentent en situation d'effort une
fatigabilité musculaire augmentée qui a pu être attribuée à une élévation de la concentration
calcique intracellulaire aux dépens de la concentration dans le réticulum sarcoplasmique. Un
marquage immunofluorescent réalisé sur des myotubes primaires isolés de ces souris a permis de
Figure 9: Anomalies structurales et fonctionnelles des triades chez le poisson zèbre invalidé pour
MTM1. Images de microscopie électronique montrant les triades dans un muscle de poisson témoin
(CTL MO) et de poisson invalidé pour MTM (MTM MO), chez qui le réticulum apparaît dilaté et
désorganisé. Les tubules T sont indiqués par les flèches verticales, le réticulum sarcoplasmique par
des flèches penchées. A droite, défaut de contraction des muscles de poisson MTM MO en réponse à
un courant dépolarisant en comparaison avec le poisson témoin. (Modifié de Dowling et al., 2009)
montrer que le PtdIns(3,5)P
2s'accumule dans le réticulum sarcoplasmique. La perfusion de PtdIns(3,5)P
2dans des myotubes sauvages récapitule l'altération de la dynamique calcique observée chez les mutants. Enfin, les auteurs de cette étude ont démontré in vitro que le PtdIns(3,5)P
2se lie avec le canal calcique RyR1 et augmente sa probabilité d'ouverture (Shen et al., 2009). Ainsi, en l'absence d'activité phosphatase par MTMR14, le PtdIns(3,5)P
2s'accumule dans la fibre musculaire, provoquant une fuite calcique RyR1-dépendante à l'origine des anomalies de relaxation et de fatigue musculaire observées.
Au bilan, les modèles animaux déficients pour deux membres actifs de la famille des MTMRs ont mis en évidence un mécanisme pathogénique probable pour les myopathies myotubulaire/centronucléaires selon lequel les niveaux finement contrôlés des phosphoinositides seraient essentiels à l'homéostasie calcique et à la performance musculaire.
Si ce mécanisme physiopathologique se vérifie dans les différents modèles animaux des myopathies centronucléaires et myotubulaire, cela établit un lien pathogénique entre ce groupe nosologique et les autres myopathies congénitales, notamment les myopathies à core provoquées par des mutations dans le gène de RyR1 ou dans les Selenoprotéines N, modificatrices de RyR1 (Dowling et al., 2009).
I.1.2.b BIN1, la dynamine 2 et la connexion MAD BIN1
En ce qui concerne les myopathies centronucléaires à transmission autosomique, l'origine génétique a été identifiée seulement dans quelques familles de patients. Cela est particulièrement vrai pour l'ARCNM, pour laquelle des mutations dans le gène codant pour la protéine Bridging Integrator 1 (BIN1) ou Amphiphysine 2, ont été publiées pour quatre patients appartenant à trois familles (Nicot et al., 2007). De nouvelles mutations ont été identifiées et sont en cours de publication (J. Laporte, communication personnelle).
BIN1, identifiée comme un homologue de l'amphiphysine 1 neuronale, est d'expression ubiquitaire (Butler et al., 1997 ; Prendergast et al., 2009). Chez la souris, la déficience de BIN1 induit une myocardiopathie précoce responsable d'une létalité prénatale, masquant un éventuel phénotype musculaire (Muller et al., 2003). Il n'existe pas à ce jour de mutant conditionnel.
BIN1 est soumis à un épissage différentiel qui dépend notamment du tissu d'expression. Ainsi, les
isoformes propres au muscle squelettique contiennent un exon (exon 10 ou 11 selon les annotations), non retrouvé dans les transcrits des autres organes, qui code pour un domaine PI impliqué dans la liaison aux phosphoinositides (Lee et al., 2002).
BIN1 possède en partie N-terminale un domaine BAR (Bin/Amphiphysine/Rvs) dimérisé en forme de banane, qui produit des courbures de membrane chargées négativement (Peter et al., 2004 ; Casal et al., 2006). Du côté C-terminal, un domaine SH3 (src homology 3) permet à la protéine d'interagir, notamment avec les dynamines. Ces deux domaines participent sans doute à la capacité de la protéine à participer à la tubulation des membranes et au processus d'endocytose (Takei et al., 1999
; Farsad et al., 2001 ; Razzaq et al., 2001). Dans le muscle, le domaine SH3 se lierait au domaine PI de la protéine et ne pourrait interagir avec les dynamines à moins que le domaine PI soit lié aux phosphoinositides (Kojima et al., 2004).
Très tôt, BIN1 a été associé à la formation des tubules T dans le muscle squelettique (Razzaq et al., 2001 ; Lee et al., 2002) et c'est par le séquençage de gènes candidats que des mutations dans ce gène ont été liées à des cas de myopathie centronucléaire (Nicot et al., 2007).
Dynamine 2
