Comparaison de la capacité de cellules ES dépendantes du FGF2 ou dépendantes du LIF à coloniser le blastocyste de lapin

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Submitted on 6 Jun 2020

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Comparaison de la capacité de cellules ES dépendantes du FGF2 ou dépendantes du LIF à coloniser le

blastocyste de lapin

Pierre Osteil, Murielle Godet, Suzy Markossian, Thierry Joly, Pierre Savatier, Marielle Afanassieff

To cite this version:

Pierre Osteil, Murielle Godet, Suzy Markossian, Thierry Joly, Pierre Savatier, et al.. Comparaison de la capacité de cellules ES dépendantes du FGF2 ou dépendantes du LIF à coloniser le blastocyste de lapin. Journées d’Animation des Crédits Incitatifs du Département de Physiologie Animale et Systèmes d’Elevage (JACI Phase 2010), Oct 2010, Tours, France. 1 p., 2010. �hal-02822184�

JACI Phase 2010 Page 9/26

Atelier 2 : Cellules souches

Le lundi 11 octobre 2010 de 14h00 à 18h30 amphithéâtre Camille Danguillaume (rdc) Animé par Jean-Stéphane Joly (NED Gif/Yvette) et Jean-René Huynh (Institut Curie)

Programme

14h00 Les Cellules souches de la lignée germinale chez la drosophile

Jean-René Huynh, Institut Curie Paris 14h30 Lignage germinal aviaire : approches comparative de la gestion de la biodiversité

Bertrand Pain, IGFL Lyon 14h45 GERMFISH : un projet pour la caractérisation de la niche germinale des cellules spermatogoniales souches

chez les poissons téléostéens Jean-Jacques Lareyre, SCRIBE Rennes

15h00 Etude de la méthylation des promoteurs des gènes pou2, sox2, c-myc et nanog au cours du développement

chez le poisson rouge Catherine Labbé, Lucie Marandel, SCRIBE Rennes

15h15 Etat de pluripotence des cellules souches pluripotentes nécessaire pour obtenir des lapins transgéniques

Marielle Afanassieff, PrimaStem Lyon 15h30 Analyse protéomique des mécanismes épigénétiques de contrôle de la transition des cellules souches entre

un état pluripotent et un état différencié Anne Mey, IGFL Lyon

15h45 Reprogrammation de différents noyaux pluripotents chez la souris

Alice Jouneau, BDR Jouy en Josas 16h00 Implication de séquences rétrovirales endogènes dans l'établissement et le maintien de la pluripotence

Véronique Duranthon, BDR Jouy en Josas 16h15 Pause

16h30 Discussion générale

Posters rattachés à cet atelier

Implication de séquences rétrovirales endogènes dans l'établissement et le maintien de la pluripotence

Véronique Duranthon, BDR Jouy en Josas Reprogrammation de différents noyaux pluripotents chez la souris

Alice Jouneau, BDR Jouy en Josas Pluripotence induite dans des cellules souches embryonnaires de lapin et de poulet nécessaires pour obtenir

des animaux transgéniques Jean-Stéphane Joly, NED Gif/Yvette

Mise au point de chimères Canards par injection de cellules de blastoderme

Pauline Aubel, UMR Inserm/CNRS Clermont-Ferrand Comparative genomics of sex differentiation, new insights from the medaka oryzias latipes

Galiana Delphine, IGFL Lyon Analyse protéomique des mécanismes épigénétiques de contrôle de la transition des cellules souches entre

un état pluripotent et un état différencié Anne Mey, IGFL Lyon

Mise au point des conditions d'utilisation de cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) pour la création de lapins transgéniques, modèles animaux de maladies humaines Yann Tapponnier, PrimaStem Lyon Comparaison de la capacité de cellules ES dépendantes du FGF2 ou dépendantes du LIF à coloniser

le blastocyste de lapin Pierre Osteil, PrimaStem Lyon

Etude de la méthylation des promoteurs des gènes pou2, sox2, c-myc et nanog au cours du développement

chez le poisson rouge Catherine Labbé, Lucie Marandel, SCRIBE Rennes

Comparaison de la capacité de cellules ES dépendantes du FGF2 ou dépendantes du LIF à coloniser le blastocyste de lapin.

Dérivation de cellules ES dépendantes du LIF chez le lapin.

Type de résumé : Oral presentation Session : Session 4 - CT4

Soumis par : Marielle Afanassieff

Auteurs et Orateurs : Marielle Afanassieff Liste complète des auteurs - Affiliations :

Murielle Godet¹, Suzy Markossian¹, Pierre Osteil¹, Thierry Joly², Pierre Savatier¹ et Marielle Afanassieff¹

1 PrimaStem, USC INRA/INSERM/UCBL-Lyon1 2008, Institut cellule Souche et Cerveau, Inserm U846, Bron

2 Unité CRYOBIO, UPSP ENVL/ISARA-Lyon, ISARA, Lyon.

L’isolement de cellules souches embryonnaires (ES) chez le lapin est une étape indispensable au développement des techniques de transgénèse chez cette espèce. Récemment, des cellules ES de lapin ont été obtenues par un groupe japonais (1) et par notre équipe. Dans les deux cas, la morphologie et les caractéristiques de ces cellules sont comparables à celles des cellules ES de primate et leur autorenouvellement est dépendant du FGF2. Or différentes équipes ont montré que seules, les cellules ES de rongeur dont l'autorenouvellement est dépendant du LIF, sont capables de coloniser un blastocyste, de participer à la formation de tous les tissus, y compris la lignée germinale, et donc de produire des animaux transgéniques (2). Cependant, la relation existant entre la dépendance au LIF des cellules ES et leur capacité à coloniser la lignée germinale reste posée. Le lapin est un bon modèle pour étudier cette relation du fait de son faible coût de production embryonnaire et de son temps de génération court. Dans un premier temps, nous avons étudié la capacité de nos cellules ES de lapin dépendantes du FGF2 à coloniser un embryon. Pour cela, nous avons micro-injecté des cellules ES exprimant le marqueur GFP dans des embryons de 44h (stade 8-16 cellules) et recherché l’expression de la GFP dans les embryons de 72h (stade blastocyste) et 6,5j (stade disque embryonnaire). Les résultats obtenus jusqu’à présent ne montre pas de participation des cellules ES au développement embryonnaire. Dans un deuxième temps, nous avons développé différentes stratégies pour obtenir des cellules ES de lapin dépendantes du LIF.

Nous avons récemment isolé deux lignées de cellules ES à partir de boutons embryonnaires de blastocystes cultivés dans un milieu contenant du LIF en absence de FGF2 et de sérum.

Nous présenterons la caractérisation de ces cellules ES dépendantes du LIF.

JACI Phase 2010

Références bibliographiques :

1: Honda, A., Hirose, M., Inoue, K., Ogonuki, N., Miki, H., Shimozawa, N., Hatori, M., Shimizu, N., Murata, T., Hirose, M., et al. (2008). Stable embryonic stem cell lines in rabbits: potential small animal models for human research. Reprod Biomed Online 17, 706-715.

2 : Guo, G., Yang, J., Nichols, J., Hall, J.S., Eyres, I., Mansfield, W., and Smith, A. (2009).

Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.

Development 136, 1063-1069.

Mots-clés :

Cellules souches pluripotentes, ES, embryon, lapin, transgénèse Commentaires

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© INRA 2010

Capacité à former des chimères

ICM Epiblaste

Lignées 4, 8 et 19 Lignées 17,18,24

0.1%

0.1%

3.1%

12.3%

93.4%

95.4%

Comparaison de la capacité de cellules ES dépendantes du FGF2 ou dépendantes du LIF à coloniser le blastocyste de lapin

Pierre Osteil ¹ , Murielle Godet ¹ , Suzy Markossian ¹ , Thierry Joly ² , Pierre Savatier ¹ , Marielle Afanassieff ¹ .

1. Primastem, USC INRA/INSERM/UCBL-Lyon1 2008, Institut Cellule Souche et Cerveau, Inserm U846, Bron.

2. Unité CRYOBIO, UPSP ENVL/ISARA-Lyon, ISRARA, Lyon

Dérivation de lignées de cellules ES

Morula Blastocyste Élimination du manteau

muqueux et de la zone pellucide

Blastocyste nu Élimination du

trophectoderme

Pronase Anticorps +

compléments

Ensemencement

5-7 jours

Apparition des Excroissances

Colonie à repiquer 1 jour

ICM

Élimination du voile

Injection de 5 à 10 cellules ES GFP

⁺

dans un embryon au stade 8 cellules . (20-26h)

Localisation des cellules ES (6 jours)

Contraste de phase TOPRO-3 GFP

Contraste de phase GFP Superposition

Localisation des cellules ES (68h-76h)

FGF2: Tests d’obtention de chimères FGF2: 6 lignées dérivées

Activité

phosphatase alcaline

FGF-24

Con tr as te de p h ase Fil tr e FI TC

Mésoderme Red O Oil Desmine

GFAP

Ectoderme FGF-4 GFP- FGF-18 GFP+

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1- lignée 4 2- lignée 8 3- lignée 17 4- lignée 18 5- lignée 19 6- lignée 24 7- T- MEF CF1 8- T+ REF GFP 9- T- H

₂

O

Détection du gène SRY (220pb) par PCR

Morphologie (Contraste de phase)

Oct4 FGF-4

Nanog FGF-4

Ho e ch st An tic orp s

SSEA1 FGF-4

E-Cadh FGF-4

N-Cadh FGF-4

Tra1-60 FGF-4

SSEA4 FGF-4

Cellules ES de souris Cellules ES de primate

Révélation des marqueurs nucléaires et membranaires spécifiques des cellules ES

Révélation de l’expression de la GFP par cytométrie en flux

Production de Corps Embryoïdes et Analyse de l’expression des gènes

de pluripotence et de différenciation par RT-PCR Production de Tératomes Caryotype FGF-18

LIF: 2 lignées dérivées

G1: 70%

S: 17%

G2/M: 13%

G1: 51%

S: 30%

G2/M: 19%

G1: 81%

S: 7%

G2/M: 12%

G1: 27%

S: 50%

G2/M: 23%

G1: 32%

S: 37%

G2/M: 28%

SSEA4 LIF-2 SSEA1

LIF-2

Tra1-60 LIF-2

Ho e ch st An tic orp s

Nanog LIF-2 Oct4

LIF-2

Cellules ES de souris CGR8

Cellules ES de rhésus LYON-ES

Cellules ES de lapin LIF-2

Cellules ES de lapin FGF-4

Fibroblastes de lapin

Morphologie (Contraste de phase)

Activité

phosphatase alcaline

Révélation des marqueurs nucléaires et membranaires spécifiques des cellules ES

Comparaison du cycle cellulaire des cellules ES chez différentes espèces

Immunofluorescence + analyse au microscope

confocal

J0 J3 J7 J10 J14 J21 T-H2O J0 J3 J7 J10 J14 J21 T-H2O

FGF-4 FGF-18

GAPDH

Oct4 Nanog Lefty1

Cer1 Sox1 HNF3b Gènes de

pluripotence

Ectoderme

Endoderme

44 XY

?

Injection dans le

rein: 31 jours