Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
IV.5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
L'approche d'écologie moléculaire proposée se concentrera sur le détection de deux gènes étudiés dans les sections précédentes dans des biotopes riches en cuivre : un gène courant dans la résistance au cuivre (copA) et du gène copK, trouvé essentiellement dans C.metallidurans. Elle s'inscrit dans une recherche plus large du Laboratoire de Physiologie et de Génétique moléculaire des Plantes sur les plantes cuprorésistantes et leurs éventuelles bactéries endophytes (projet de doctorat d' A. Cubaka, ULB) et du Laboratoire de Microbiologie sur la diversité des mécanismes de résistance (projet de doctorat de J. Scheers, ULB).
Le Katanga est une région où la végétation est particulièrement bien adaptée à ce biotope naturel riche en cuivre (Lejoly, 2006). Les sites sont très variés : mines exploitées, réexploitées depuis peu ou l’arrêt, sites naturels jamais exploités, remblais d’extraction récents ou anciens, retombées de fumées. Ces sites forment un bel échantillon de tout ce qui peut se rencontrer comme pollution due à l’extraction du minerai de cuivre.
La rhizosphère est la région du sol directement influencée par les racines des plantes et les microorganismes associés. Notre étude concerne la terre à proximité des racines de plantes, et peut donc être considérée comme faisant partie de la rhizosphère. Des sites variés ont été sélectionnés pour y rechercher les gènes copA et copK par amplification PCR.
Le gène copA est un bon indicateur de la présence d’un groupe de gènes cop de résistance au cuivre. Ce gène code pour une protéine qui n’intervient que dans l’efflux du cuivre (point IV.2.2). Plusieurs études sur des sites de vignobles pollués par le cuivre : Dell’Amico et al.
(2006) n’ont mis en évidence ni copAB, ni copR dans des sols de vignobles du Piémont, par contre, Lejon et al. (2007) trouvent copA dans trois sites différents (Auvillars, Chinon et Mâcon) ; la présence de ce gène dépend fortement du pH, de la texture du sol et de sa composition en matières organiques (Lejon et al., 2007).
Diels et Mergeay (1990) ont montré la présence de gènes homologues aux gènes czc de C.
metallidurans CH34 dans des bactéries isolées de biotopes industriels belges et katangais. Sur milieu non sélectif, de 15 à 40 % des souches répondaient positivement à la sonde czc et après sélection sur milieu contenant du zinc, 100 % des souches répondaient positivement (Diels et Mergeay 1990). Ils démontrent ainsi le lien entre contamination par le zinc et présence d’un gène spécifique de résistance chez C. metallidurans CH34. Un essai d’amplification du gène czcC sera également effectué afin de mesurer la corrélation éventuelle avec la présence de gènes cop.
Enfin, la recherche de copK dans des biotopes riches en cuivre complète notre approche multidisciplinaire qui essaye de relier études biochimique, physiologique et écologique menées sur un gène et la protéine correspondante.
Nous aurions pu chercher le gène copF ou copB, qui apparaissent comme aussi importants
que copA dans la résistance au cuivre. Toutefois, nous aurions été confronté au problème que
copF a de très nombreux homologues qui ne confèrent parfois aucune résistance spécifique au
cuivre. Le gène copB étant présent uniquement quand un homologue de copA est également
présent, il nous est apparu plus judicieux de réaliser une recherche de copA avant
d’éventuellement chercher copB.
Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
IV.5.1. Echantillonnage des sols.
Localisation et caractéristiques macroscopiques des sites :
Les sites sont choisis de sorte qu’ils présentent la plus grande hétérogénéité.
Nonante six échantillons de sols ont été récoltés par le professeur Verbruggen et Alfred Cubaka (Laboratoire de Physiologie et de Génétique moléculaire des Plantes de l’ULB) dans la ceinture cuprifère du Katanga (RD Congo). Les photos suivantes (figure IV.53) illustrent les biotopes dans lesquels les échantillons ont été prélevés.
Figure IV.53 : Photos de sites de prélèvement des échantillons (N. Verbruggen).
Remblais d’une mine de cuivre à proximité d’habitations (Lubumbashi).
Bassin de décantation riche en arsenic (Kipushi).
Les échantillons de plantes cuprorésistantes et de la terre qui les entoure proviennent de trois zones autour des localités de Kolwezi, Likasi et Lubumbashi. Ces localités sont toutes sur
« l’arc cuprifère katangais » (figureIV.54), connu pour sa richesse en minerai de cuivre.
Figure IV.54 : Localisation géographique des sites échantillonnés en RD Congo.
Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
Zone n° Site n° Site Type de site Type d'échantillon # d'échantillon
1 1' Kolwezi prox. Hôtel Urbain Déblais miniers 3
1 1 Kolwezi colline D Site naturel non-exploité Bassin de décantation 10
1 2 Kolwezi mupine Ancienne mine à l'arrêt Déblais miniers 6
1 3 Kolwezi Kilamusembu Mine exploitée Déblais miniers 3
1 4 Lualaba Chemin de fer Déblais miniers 4
1 5 Kisenda Mine nouvellement exploitée Déblais miniers 3
2 6 Kamfudwa Kambove Mont cuprifère non expl. Bassin de décantation 12
2 7 Kalabi Lwambo Mine exploitée artisanalement Bassin de décantation 2
2 8 Shituru dembo Fonderie à l'arrêt Bassin de décantation 7
2 9 Kamatanda Likasi Versant non-expl. de la mine Bassin de décantation 5
3 10 Kipushi Ancienne mine à l'arrêt Bassin de décantation 9
3 11 Cimetierre Urbain Retombées de fumées 4
3 12 Kalukuluku Mine réexploitée Déblais miniers 7
Les échantillons proviennent de déblais miniers, bassin de décantation et sites de retombées de fumées (table IV.4).
Table IV.4 : Description des sites d’échantillonnage.
Légende : La zone 1 couvre Kolwezi, la zone 2 couvre Likasi, la zone 3 couvre Lumbumbashi.
IV.5.2. Relation entre le site, la concentration en métal et la présence des gènes copA, copK et czcC au départ de l’ADN total extrait du sol.
Dosage des métaux.
Les mesures de concentrations en métaux lourds ont été réalisées par Gilles Collinet du Laboratoire de Géopédologie de la Faculté Universitaire de Sciences Agronomiques de Gembloux (FUSAGx) (table IV.4).
Les concentrations en cuivre, zinc, plomb, cadmium et cobalt ont été mesurées après une extraction solide-liquide au CaCl
2(à pH 7) et à l’acétate d’ammonium (à pH 5) qui sont les deux premières étapes d’extraction séquentielle des métaux (Tessier et al., 1979). L’extraction au CaCl
2permet de mesurer la proportion de métaux directement échangeables, celle à l’acétate d’ammonium permet de mesurer la proportion de « carbonates » de métaux.
Ensemble, ces fractions constituent la fraction considérée comme biodisponible (sur le temps d’une saison) et est reprise dans la table IV.6. Les concentrations en plomb et en cadmium sont négligeables par rapport à celles en cobalt, zinc et cuivre et n’entrent pas dans le calcul de la concentration totale en métaux (notée [Me]).
Les concentrations minimales varient de 136 à 4630 ppm pour le cuivre et 176 à 4783 ppm pour les métaux totaux. La concentration mesurée par extraction au CaCl
2est négligeable par rapport à la fraction extraite à l’acétate d’ammonium (résultat non présenté).
Seul le bassin de décantation (3.10) a une concentration en cuivre nettement inférieure à la
concentration totale en métaux. Il s’agit en effet d’un bassin riche en arsenic et en zinc qui
constituent des résidus de l’extraction du minerai de cuivre. Il y a une grande variabilité des
concentrations mesurées entre les différents échantillons prélevés sur un même site. On ne
peut donc pas considérer ces sites comme homogènes au niveau des concentrations en
métaux.
Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
Choix et description des amorces.
Les amorces de copA ont été choisies dans les régions les mieux conservées dans tous les homologues connus de ce gène. Cette approche qui vise à amplifier un maximum de gènes homologues à copA a montré expérimentalement son efficacité (Lejon et al., 2007). Comme nous ne disposions pas de séquence d’homologues de copK au moment de nos études, les amorces utilisées ont été choisies aux extrémités du gène. Les amorces de czcC sont décrites dans Dell’Amico et al., 2006, elles sont spécifiques du gène de C. metallidurans CH34 (résultat non présenté).
Corrélation entre le site, la concentration minimale en Cu ou Me sur le site et la présence de copA ou copK dans l’ADN total extrait.
Table IV.5 : Sites, concentrations moyennes, minimales et maximales en Cu et en métaux mesurés (Me), extraits à l’acétate d’ammonium (AA).
Légende :. « Cu
min» et « Me
min» correspondent à la concentration minimum pour un site donné, « Cu
max» et « Me
max» correspondent à la concentration maximale pour un site donné,
« <Cu> » et « <Me> » correspondent à la concentration moyenne pour un site donné.
Les gènes copK, copA et czcC ne sont pas amplifiés de la même façon : un produit PCR copK est observé au départ de tous les ADN extraits des sols, un produit copA est observé de façon irrégulière par rapport à la zone ou au site de prélèvement ou à la concentration en Cu ou Me, et un produit czcC est très rare (table IV.5).
Le gène copK est amplifié au départ de presque tous les échantillons. Ceci suggère que copK pourrait être fréquemment présent dans les biotopes chargés en cuivre.
Il n’y a pas de relation entre la concentration en cuivre ou métal total mesuré et l’amplification du gène copA.
Le gène czcC n’est pratiquement jamais amplifié au départ des échantillons ce qui suggère que C. metallidurans CH34 est peu présente dans nos biotopes. Ce n’est pas surprenant dans la mesure où cette souche a été isolée d’un biotope chargé en zinc.
Zone Site [Cu]min(ppm) <[Cu]> (ppm) [Cu]max(ppm) [Me]min(ppm) <[Me]> (ppm) [Me]max(ppm) copA copK czcC
1 1' 1940 2697 4158 2057 2893 4355 3/3 3/3 1/3
1 1 1835 11608 31270 2216 12165 32525 3/10 10/10 2/10
1 2 2028 4068 11046 2484 4392 11469 4/6 5/6 1/6
1 3 136 4068 16645 176 4392 17212 2/3 2/3 0/3
1 4 325 832 1477 365 916 1550 1/4 3/4 0/4
1 5 547 1044 1758 643 75 2230 1/3 3/3 0/3
2 6 231 960 2096 286 1223 2627 9/12 12/12 1/12
2 7 2866 3007 3148 2930 3059 3188 2/2 2/2 0/2
2 8 518 2595 4830 1498 3883 6179 2/7 7/7 0/7
2 9 4630 5260 5938 4675 5306 5988 2/5 5/5 0/5
3 10 443 960 1314 1645 7990 10836 6/9 8/9 0/9
3 11 3966 6923 10106 4783 7443 10551 3/4 4/4 0/4
3 12 568 2325 3900 656 2424 4009 0/7 7/7 0/7
Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
Les produits PCR sont en cours de séquençage afin de s’assurer qu’il s’agit bien d’homologues de gènes de C. metallidurans CH34 et pas d’une amplification aspécifique.
Nous avons également essayé de mettre en parallèle l’amplification de copA avec d’autres facteurs : le pH, la plante parfois associée à l’échantillon de terre, la concentration totale en métaux, sans y parvenir.
Ce résultat n’est pas surprenant : Lejon et al. (2007) ont montré que la présence de copA dépend fortement de la texture du sol et de la composition en matières organiques. Toutefois, la concentration totale en cuivre de leurs échantillons n’excédait pas 70 ppm, alors que les concentrations de nos échantillons sont beaucoup plus élevées (jusque 31270 ppm).
Les observations bioinformatiques (table IV.3, point IV.2.1) montrent que copA est présent dans de nombreux organismes, par contre copK n’est présent que rarement et uniquement dans des β-protéobactéries.
V.5.3. Constitution et caractérisation d’une collection de souches cuprorésistantes.
Choix de la concentration de sélection : 1,5 mM en Cu(II).
Nous avons choisi de sélectionner des souches au moins aussi résistantes que C.
metallidurans CH34.
Une première expérience sur 21 échantillons a permis de définir une concentration en Cu(II) susceptible de sélectionner efficacement des souches très résistantes au cuivre.
Entre 4 et 100 % des bactéries sont capables de croître sur 1 mM en Cu(II) ; à 2 mM en Cu(II), il n’y a que 1 à 37 % des bactéries capables de croître. Une concentration de sélection intermédiaire a été retenue (1,5 mM en Cu(II)). Cette valeur est aussi celle de la CMI de C.
metallidurans CH34.
Sélection des souches cuprorésistantes.
Après avoir traité les échantillons de terre pour en extraire les bactéries, celles-ci ont été
étalées sur milieu contenant du Cu(II) à 1,5 mM. Quatre cent cinquante colonies (soit six
colonies par échantillon de terre traité) ont été retenues aléatoirement sur le milieu de
sélection et répliquées sur des milieux contenant un autre ion métallique (Zn(II), Ni(II),
Co(II), Cd(II), Hg(II)). Soixante et une d’entre elles, qui présentaient à la fois une résistance
très élevée au Cu(II) et un phénotype multi-résistant aux métaux lourds, ont été mises en
collection. Notre objectif est de caractériser ces souches afin de mettre en évidence des
mécanismes de résistance au cuivre plus efficaces que le système cop de pMOL30.
Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
Caractérisation de souches cuprorésistantes
Six genres principaux identifiés parmi les souches isolées.
Cette soixantaine de souches ont été caractérisées lors d’un travail de fin d’études (Joanne Scheers, 2007).
Six genres ont été identifiées : Méthylobacterium, Sphingomonas, Cupriavidus, Ralstonia, Stenotrophomonas et Luteifibra. Les souches de Stenotrophomas identifiées présentent trois profils ITS distincts.
Les Sphingomonas font partie des
α-protéobactéries, leur habitat naturel est très variépuisque des espèces sont présentes dans le sol, dans les eaux, les racines de plantes et aussi des biotopes contaminés aux hydrocarbures.
S. yanoikuyae est capable de dégrader des composés mono- et poly-aromatiques (Zylstra et Kim, 1997). S. yunnanensis a été isolé de boîtes contaminées dans un laboratoire (Zhang et al., 2005). D’autres espèces de Sphingomonas ont été isolées d’un biofilm soumis à une concentration de 0.23 mM en Cu(II) (Vilchez et al., 2007).
Stenotrophomonas maltophilia est une
γ-protéobactérie ubiquiste. Cette souche est présentedans les eaux de surface et souterraines, salines ou non, dans le lait de vache et de brebis (même pasteurisé), les aliments réfrigérés,… Sa grande faculté d’adhérence fait qu’on la rencontre dans les hôpitaux où cette bactérie peut proliférer sous forme de biofilms à la surface des cathéters par exemple.
Les Ralstonia (R. picketii, mannitolytica, solanacearum) sont connues pour leur capacité à coloniser les plantes et R. solanacearum est une souche pathogène capable de coloniser plus de deux cent plantes différentes.
Le genre Cupriavidus est commun dans les biotopes anthropogéniques, comme C.
metallidurans ou C. basiliensis (une souche isolée de sols riches en sédiments de Zn). C.
eutrophus est résistante au cuivre à 1,2 mM en Cu(II) (sur milieu minimum) (Casida, 1987).
Les souches de Luteifibra n’ont jamais été identifiées auparavant dans des biotopes industriels.
Les Methylobacterium sont des bactéries rhizosphériques courantes pour lesquelles on fait
l'hypothèse qu'elles métabolisent le méthane largué par les stomates des plantes (Nemecek-
Marshall et al., 1995).
Chapitre IV : Résultats, 5. Les gènes copK et copA dans les biotopes riches en cuivre.
Détermination des niveaux de résistance des souches isolées : Des CMI deux à trois fois supérieures à celle de CH34.
Le niveau de résistance (table IV.6) a été testé sur le même milieu que le milieu de sélection, avec des concentrations croissantes en Cu(II).
Table IV.6 : Niveaux de résistance extrêmes et moyen des souches cuprorésistantes.
CMImax CMImin <CMI> σ Identification Nombre (mM) (mM) (mM) (mM)
Cupriavidus 10 4,2 1,4 2,34 0,83
Ralstonia 9 5 1,6 3,33 1,49
Luteifibra 5 4 1,4 2,04 1,13
Stenotrophomonas 18 2,2 1,4 1,46 0,25
Sphingomonas 10 3,6 0,8 1,70 0,99
Methylobacterium 6 5 3,6 4,27 0,63
