Production en conditions non aseptiques d’inoculum de Trichoderma harzianum Rifai pour des essais de lutte biologique

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Production en conditions non aseptiques d’inoculum de

Trichoderma harzianum Rifai pour des essais de lutte

biologique

P. Davet, M. Artigues, C. Martin

To cite this version:

P. Davet, M. Artigues, C. Martin. Production en conditions non aseptiques d’inoculum de Trichoderma

harzianum Rifai pour des essais de lutte biologique. Agronomie, EDP Sciences, 1981, 1 (10),

pp.933-936. �hal-02728387�

Production

en

conditions

non

aseptiques

d’inoculum

de

Trichoderma

harzianum

_{Rifai pour des essais de lutte}

biologique

Pierre DAVET, Michel ARTIGUES Christian MARTIN

1. N. R. A., Laboratoire de Recherches de la Chaire de

_Biologie

et

_{Pathologie végétales}

de l’ENSA, F 34060

Montpellier Cedex.

( *

) Société coopérative de Recherches et _{d’Expérimentations agricoles} des _Pyrénées orientales, 19, Avenue de

Grande-Bretagne, F 66025 _Perpignan Cedex.

RÉSUMÉ Milieu

_sélectif,

Trichoderma harzianum, Sclerotinia minor, Laitue, Lutte biologique.

La note

_envisage

la _possibilité de

_produire

un inoculum de Trichoderma harzianum en conditions non stériles, pour des essais sous serre ou en

_{plein champ.}

Le substrat est constitué de

_paille

_{hachée humidifiée par} une

solution minérale. _L’apport de _12,5

_mg/1

de vinchlozoline et de 2,5 ml/1 d’alcool _allylique assure la sélectivité du milieu.

Cette

_préparation

a été utilisée pour traiter un sol préalablement infesté _par Sclerotinia minor. La mortalité de laitues plantées dans de telles

_parcelles

a été

_{significativement}

_{réduite par rapport} aux témoins non traités.

Le traitement

_chimique

à la vinchlozoline a toutefois donné, dans cet essai, des résultats

_supérieurs.

SUMMARY Selective medium, Trichoderma _harzianum, Sclerotinia minor, Lettuce, Biological control.

About the

_production,

in non-sterile

_{conditions, of}

a Trichoderma harzianum

_inoculum,

in view

_of

biological

control trials.

The substrate is _prepared in _{large plastic bags.}

_Chopped

straw is moistened _by an acid mineral _solution, to

which _selectivity is confered

_by

addition of _12,5

_mg/l

of vinclozolin and 2,5 mI/I of allyl alcohol.

Such a _preparation was

_employed

to treat a soil that had been

_previously

infested _by Sclerotinia minor. In

amended _plots, lettuce _drop was _{significantly reduced,}

_compared

with non treated _controls, in

_spite

of a too

short period between T. harzianum

_application

and

_planting.

Usual chemical control with vinclozolin still gave the best results.

I. INTRODUCTION

L’utilisation des Trichoderma pour une lutte

_biologique

contre des

_{champignons telluriques parasites}

des cultures nécessite

_{l’incorporation}

au sol de

_{quantités importantes}

d’inoculum. Des essais

_{préliminaires}

montrent _que,

_lorsqu’il

est

_apporté

sous la forme d’une

_{simple poudre}

_{de spores,} cet

inoculum se maintient difficilement dans le sol et _y est _peu

actif. Il

_paraît

donc nécessaire d’introduire le

_champignon

avec un

_support

_qui

lui fournisse une base nutritive suffi-sante _pour

_échapper,

au moins

_{temporairement,}

à la

compétition

des autres

_{microorganismes}

_telluriques.

De nombreux substrats

_remplissent

cette condition

_mais,

_pour convenir à une utilisation

_pratique,

ils

_doivent,

en _outre,

être bon marché et faciles à

_préparer.

_Or,

les chercheurs

_qui

ont

_{expérimenté}

avec les Trichoderma ont utilisé

_jusqu’à

présent

des milieux de culture autoclavés pour

produire

leur inoculum

_(W

_ELL

_S

et

_{al., 1972 ;}

BACKMAN & RODRIGUEZ

-K

ABANA

,

1975 ;

LEWIS &

_P

_APAVIZAS

_,

_{1980 ;}

ELAD et

_ül.,

1980).

Le _{substrat que} nous avons mis au

_point

n’a pas besoin

d’être

autoclavé,

ce

_{qui simplifie}

considérablement sa

préparation.

Nous

_indiquerons

dans cette note sa

composi-tion et nous donnerons un

_exemple

de sa mise en oeuvre.

Il.

MATÉRIEL

ET

MÉTHODES

A.

_Préparation

du substrat

1.

_Composition

du milieu

L’inoculum est

_produit

dans des sacs en matière

_plastique

de 100 x 55 cm. La source de carbone est _{constituée par de} la

_paille

de

blé,

qui

sert en même

_temps

de

_support

matériel

au

_mycélium

du

_champignon.

Dans

_chaque

sac, on introduit

d’une solution minérale dont la

_composition,

_par

litre,

est la suivante :

Ca(N0

3

)

z

, 4H

z

0

... 1 g

CaC1

2

... 1 g

KN0

3

...

0,250

g

S0

4

Mg,7Hp

...

0,250

g

H

Z

KP0

4

...

0,125

g

HK

2

PO

I

...

0,125

g eau du robinet ... 1000 mi

Cette solution est acidifiée à

_pH

= _{4 avec}

quelques

gouttes

d’acide

_{chlorhydrique}

du commerce. Avant

_l’emploi

on met _{les spores de Trichoderma} en

suspension

dans le

liquide

et l’on

_ajoute,

_{par litre :}

_12,5

_{mg de vinchlozoline} et

2,5

ml d’alcool

_allylique,

destinés à assurer la

_{spécificité}

du milieu

_(D

_AVET

_,

_1979).

2. Ensemencement du substrat

Les

_suspensions

_{de spores} sont obtenues à

_partir

de cultures

_ayant

bien

_{sporulé, développées}

sur une décoction

de pomme de terre

_{gélosée (milieu PDA),}

dans des tubes inclinés.

_Quelques

ml de solution minérale sont introduits

dans les tubes

_{qui, simplement}

fermés avec le pouce, sont ensuite

_{vigoureusement agités.}

Ces

_suspensions

concentrées sont alors versées dans la solution minérale de

départ

dont la teneur en _spores

_peut

être éventuellement contrôlée par un

_comptage

à

l’hémacytomètre.

Nous introduisons en

moyenne 101 spores par sac, ce

_{qui correspond}

à 3 ou

4 tubes de milieu

_gélosé.

3. Incubation

Après

avoir versé sur la

_paille

les 2 1 de solution minérale

contenant _{les spores de}

_Trichoderma,

on

agite

les sacs de

façon

à ce _{que la}

paille

soit bien humectée. On

replie

ensuite vers le bas la

_{partie supérieure}

des sacs et on les

place

dans un local dont la

_température

est

_comprise

entre 24 et 30 °C. On

_peut

secouer à nouveau les sacs 5 à

_{6 j après}

l’ensemencement,

lorsque

les

_premières

colonies sont bien

apparentes,

de

_façon

à accélérer

_{l’occupation}

_{du milieu par} le

_champignon.

L’inoculum est utilisable 20 à

_{30 j}

_après

l’ensemence-ment, mais il _peut être conservé

_{plus longtemps}

sans

inconvénient.

B. Conditions de l’essai

Nous avons

_{éprouvé l’aptitude}

d’un inoculum du

_type

précédent

à

_protéger

une culture de laitues des

_attaques

de

Sclerotinia minor.

1. Terrain

La culture est réalisée en

_plein

air,

à

Montpellier,

dans un

sol maraîcher sablo-limoneux de

pH

(CaCl,)

=

_6,7,

conte-nant

_1,94

_{g p. 100 de carbone}

_organique.

Des

_parcelles

de

1 x 2 m sont délimitées au _moyen de tôles enfoncées

verticalement de

_façon

à

_empêcher

les

_mélanges

de terre.

2.

_Infection

_{par Sclerotinia minor}

Le

_champignon

est cultivé sur milieu PDA dans des boîtes

de Petri maintenues à 20 °C. Les sclérotes sont récoltés à la surface des boîtes

_{puis mélangés}

à de la terre de

_jardin

dans

un sac de matière

_plastique

et ainsi conservés à 4 °C

jusqu’au

moment de

_l’emploi.

Ils sont

_épandus

sur les

parcelles

le 16

_septembre

et enfouis

_{superficiellement}

_par

griffage

du sol. La

_quantité

est

_ajustée

de

_façon

à avoir environ 5 sclérotes pour 100 g de terre dans les 10

_premiers

cm de sol.

3.

_Apport

de Trichoderma

Nous utilisons un clone de T.

_harzianum,

choisi dans une

population

provenant

d’un sol de

_Villelongue

de la Salan-que

(Roussillon).

La

paille

colonisée par T. harzianum est

mélangée

au

_sol,

à la

_bêche,

sur une

_profondeur

de 15 cm, à raison de 500 g de

paille

imbibée par m2

_(un

sac

_permet

de

traiter

_5M

₂

_{) .}

L’enfouissement est réalisé le 22

_septembre.

4. Culture

Les laitues

_(variété

« Trocadéro à

graines noires »)

sont semées sous abri le 24

_septembre

et

_repiquées

en

_godets

le

8 octobre. Deux traitements au thirame sont

_pratiqués

pendant

la

_{période d’élevage.}

Les

_plants

sont mis en

_place

le

12

_novembre,

_{à raison de 20 par}

_parcelle,

_répartis

en

quinconce

sur 3 rangs.

5. Traitements

Une

_partie

des

_parcelles

seulement

_reçoit

T. harzianum.

Une autre

_partie

ne subit aucun traitement. Dans un

troisième

_lot,

les laitues et la surface du sol sont traitées à la vinchlozoline

_(0,75

_g de m.a.11 de

_bouillie),

selon la méthode

_préconisée

_par MARTIN

_{(1978) ;}

3

_{pulvérisations}

sont effectuées avant le stade 18

_feuilles,

à des dates très

espacées

en raison du très lent

_{développement}

des

_plantes,

dû au froid

_(le

_24/11,

le 15/12 et le

_{16/1). Chaque}

_type

de traitement

_comprend

6

_{répétitions.}

Trois

_parcelles

non

contaminées,

non

_traitées,

servent de témoins d’inocula-tion.

On

_compte

le nombre de

_plantes

mortes à divers moments de la culture

_qui

est arrêtée le 6 mars. A cette

date,

des

_{prélèvements}

de sol sont effectués dans les

parcelles

enrichies en T. harzianum. Pour

_{chaque parcelle}

élémentaire,

5 sous-échantillons sont

_prélevés

dans les 5 à 6 cm

_superficiels

et

_mélangés.

On obtient ainsi 6

échantil-lons,

dont le nombre est _{finalement ramené à 3 par}

_mélange

des

_prises

de 2

_parcelles.

Des

_{prélèvements}

de sol sont faits de la même

_façon

dans les

_parcelles

non traitées. La teneur

en Trichoderma de ces sols est évaluée

_après

isolement sur un milieu sélectif

_(D

_AVET

_,

_1979).

III.

RÉSULTATS

A. Milieu de culture

1. Production

Diverses souches de T. harzianum

_provenant

de sols maraîchers ont été cultivées sans difficulté sur ce milieu non

stérile. La

_production,

évaluée en nombre de spores par g

de

_paille,

est de l’ordre de 200 à 300 x 106

_{spores/g après}

une dizaine de

_jours

d’incubation à 24 °C. Nous avons

prélevé,

à diverses

_reprises

en cours

d’incubation,

des

fragments

de

_paille

_que nous avons

_déposés

dans des boîtes de Petri contenant du milieu PDA : nous avons obtenu le

plus

souvent _{des cultures pures de} T. harzianum. Les

colonies bactériennes que l’on observe

parfois

sont

rapide-ment recouvertes _{par le}

_champignon

et ne

_paraissent

_pas

2. Sélectivité

Pour

_éprouver

la sélectivité du milieu vis-à-vis d’éventuels contaminants

_fongiques,

nous avons ensemencé simultané-ment T. harzianum et

_Aspergillus

_niger

ou un Mucor sp. Les

suspensions

étaient

_ajustées

de

_façon

à avoir une _spore

d’A.

_niger

ou de Mucor sp. pour 20 conidies de T. harzia-num dans un

_premier

_essai,

et une spore de contaminant pour 10 conidies de T. harzianum dans un second essai.

Dans tous les cas, l’inoculum de T. harzianum était de 101 spores par sac. T. harzianum s’est

toujours

bien

développé.

On

_pouvait

observer

_quelques

colonies d’A.

_niger

ou de

Mucor sp. pour le taux de contaminants le

_plus

élevé. 3.

_{Influence de la}

concentration de l’inoculum initial

Les

_suspensions

_{de spores} sont

_ajustées

de

_façon

à introduire par sac les

_quantités

suivantes : 2 x

₁₀

₁

_,

₁₀

₁

_,

₁₀

₁

_,

10

11

_spores.

_Après

une semaine d’incubation à 24

°C,

on ne

constate aucune différence

d’aspect

entre les sacs. La

production

est la même dans tous les traitements : elle est

comprise

entre 150 x 106 et 300 x

10

6

_spores/g

de

_paille.

B.

_Application

à une culture de laitue

L’évolution de la maladie dans le

_temps

selon les

diffé-rents traitements est

_{représentée}

_{par les}

_graphiques

de la

figure

1. A la fin de

l’essai,

les taux de mortalité sont

respectivement

de

58,3

p. 100 pour les témoins non

traités,

35,8 p.

100 pour les

parcelles

ayant

reçu T. harzianum et

13,3

p. 100 pour les

parcelles

traitées à la vinchlozoline. Ces 3 résultats sont

_{significativement}

différents.

Il _y a en _{moyenne 8 500}

propagules

de T. harzianum par g

de terre dans les

_parcelles

témoins,

et 256 100

_propagules/g

dans les

_parcelles

_ayant

reçu l’amendement à base de

paille,

5 mois et demi

_après

son

incorporation.

IV. CONCLUSION

Le milieu non stérile à base de

paille

_que nous _proposons ne soulève aucune difficulté de

_préparation

ni de mise en oeuvre. Il

_peut

être ensemencé soit à

_partir

de tubes de culture contenant des clones de T. harzianum sélectionnés

au

_laboratoire,

soit à

_partir

de

_{préparations}

commerciales

en

_poudre.

La vinchlozoline

_ajoutée

initialement à la

_paille

repré-sente, à supposer

qu’elle

n’ait pas été

dégradée pendant

le

temps d’incubation,

un

_apport

_{insignifiant :}

5

_mg/m

₂

de sol.

En _{considérant que la}

_paille

est enfouie uniformément sur une

_épaisseur

de 10 cm, la concentration de vinchlozoline

introduite dans le sol avec le Trichoderma est donc au

_plus

de

_0,05

_mg/1,

ce

_qui

est nettement _{insuffisant pour inhiber le}

développement

de S. minor. Un seul traitement

_fongicide

en

_{pulvérisation représente}

un

_apport

de matière active 15 à

20 fois

_plus

_{élevé. Nous estimons donc que la diminution de} la mortalité des laitues dans les

_parcelles

traitées est attribuable à T.

_harzianum,

dont nous avons _{par ailleurs}

constaté in vitro l’activité

_parasitaire

vis-à-vis de S. minor.

Dans cet

_essai,

l’enfouissement de l’amendement

biologi-que a

_été,

_{pour des raisons}

_pratiques,

réalisé très

tardive-ment

_(fin

_septembre),

alors

_qu’il

aurait été

_préférable

d’opérer

au moins un mois

_plus

tôt. En outre, les

premiers

froids sont _{apparus dès le mois de novembre. T. harzianum} n’a _{donc bénéficié que d’une} courte

_période

de chaleur favorable pour exercer son activité

_{bénéfique. Compte}

tenu de ces conditions peu

_propices,

la

_protection

exercée par

T. harzianum

_paraît

_{intéressante,}

même si elle se montre ici

inférieure à celle

_procurée

par la vinchlozoline.

On constate _{enfin que la}

_population

de T. harzianum enfouie dans le sol s’est maintenue à un très haut niveau

jusqu’à

la fin de la culture.

Reçu le 11 mai 1981.

Accepté le 26 août 1981.

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