Identification et caractérisation de CASC5 chez des patients atteints de microcéphalie primaire

Université Libre de Bruxelles

Identification et caractérisation de CASC5 chez des patients atteints

de microcéphalie primaire

Anne Genin

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur

en Sciences Biomédicales Promoteur : Pr. Marc Abramowicz

Service : IRIBHM

Année Académique 2012-2013

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Jury sous la Présidence de

Monsieur le Professeur Gilbert Vassart

Composition du Jury

Experts étrangers

Madame le Professeur Anna Jansen, Vrije Universiteit Brussel Monsieur le Professeur Alain Verloes, Université Paris VII Denis Diderot

Membres de la Faculté de Médecine

Monsieur le Professeur Bernard Dan Monsieur le Professeur Denis Franchimont

Monsieur le Professeur Massimo Pandolfo Monsieur le Professeur Marc Abramowicz

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Remerciements

À Marc Abramowicz, mon promoteur de thèse.

Merci de m’avoir accueillie au sein de votre laboratoire, pour le partage de votre savoir quasi illimité en matière de génétique et pour votre présence dans les moments les plus critiques.

À Isabelle Pirson, pour avoir rejoint l’équipe sur le tard et nous avoir apporté un soutien et une aide si précieuse.

Merci Isa pour ta gentillesse, ton écoute, ta présence et tes bons conseils. Tu as toujours su me tirer vers le haut dans les moments les plus difficiles, c’est en grande partie grâce à toi que je me suis accrochée jusqu’au bout.

À Sandra, Régis, Anaïs, Julie, Zineb, Lidia, Rocky et Camille, l’équipe du C5.114, pour votre accueil, votre bonne humeur, vos conseils et votre aide pendant ces 5 années.

À Sandra Strollo, tout particulièrement, une technicienne en or qui s’est toujours montré disponible, dynamique, enthousiaste, pleine de bons conseils et de bonne humeur même après son départ de l’équipe. Merci pour ton aide et ton amitié tout au long de ce travail.

À Wendy, une amie sincère rencontrée à l’IRI.

À Pierre Vanderhagen et son équipe, Anya et Nelle pour votre collaboration à ce travail.

Merci Anya, pour ta gentillesse et tes conseils, le matériel et les protocoles.

À l’équipe de génétique de l’hôpital Erasme, pour les séquençages, les gels coulés, les tampons maison, le partage tout simplement.

À mes parents, ma famille, la base et les repères, pour votre amour, pour tellement, presque tout.

Et à tous les êtres chers qui égaillent ma vie…

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Résumé

Un des aspects les plus marquants de l'évolution des grands singes est l'augmentation relative du volume du cerveau, et en particulier du néocortex, qui culmine chez Homo sapiens. La microcéphalie primaire est une anomalie congénitale du développement cérébral humain caractérisée par un cerveau normalement formé mais de petit volume. Il en existe une forme isolée, non syndromique, dont la majorité des cas sont d'origine génétique et transmis sur le mode autosomique récessif (MCPH), qui constituent donc un modèle génétiquement simple qui résulte de l'altération d'un seul gène, essentiel dans le développement volumique du cerveau. Une consanguinité parentale est présente dans la majorité des cas, ce qui permet une approche puissante de localisation génomique de la mutation responsable, nommée cartographie d'homozygotie. A ce jour, huit gènes causant cette anomalie ont déjà été identifiés : BRIT1 (MCPH1), ASPM (MCPH5), CDK5RAP2 (MCPH3) et CENPJ (MCPH6), et plus récemment, STIL (MCPH7), CEP152 (MCPH9), WDR62 (MCPH2) et CEP135 (MCPH8). Tous ces gènes jouent un rôle au niveau du cycle cellulaire. Nous avons tenté, au cours de ce doctorat, d’identifier et de caractériser un nouveau gène du locus MCPH4 cartographié au laboratoire et situé sur le bras long du chromosome 15.

Dans trois familles MCPH4 originaires de villages voisins du Maroc rural, nous avons affiné la zone de liaison à un segment de 3,7cM, contenant un haplotype commun sur une longueur de 2,7cM suggérant un déséquilibre de liaison autour d’une mutation ancestrale. Le LOD score combiné dans les trois familles était supérieur à 6. Parmi les gènes contenus dans cette région, nous avons sélectionné des candidats que nous avons ensuite analysés par séquençage direct de l’ADN de nos patients. Parmi ces gènes, CASC5 présentait un variant, homozygote chez nos patients, hétérozygote chez leurs parents sains et absent chez 150 contrôles non apparentés. Nous avons utilisé la technologie 454 de séquençage à haut débit de Roche pour séquencer les gènes de l’intervalle de 2.7Mb en une fois. Parmi les mutations identifiées, nous n’avons trouvé qu’une seule variation exonique inconnue qui correspondait à la variation faux-sens déjà identifiée dans le gène CASC5. CASC5 est une protéine centromérique requise pour l’alignement des chromosomes à la métaphase et pour le point de contrôle métaphasique de la progression mitotique. Il était donc potentiellement un très bon candidat causal de la microcéphalie primaire. CASC5 lie directement MIS12, BUB1, BUBR1 et Zwint-1, et fait partie du réseau KMN du kinétochore. Il est nécessaire à l’ancrage des centromères

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chromosomiques au fuseau mitotique, et est requis pour le contrôle du cycle cellulaire au niveau du Spindle-Assembly Checkpoint.

Nous avons ensuite confirmé que la mutation génère un défaut d’épissage chez nos patients consistant en la perte partielle de l’exon 18 dans l’ARNm. La perte de cet exon conduit à un déphasage du cadre de lecture provoquant l’apparition d’un codon STOP prématuré dans l’exon 19. Ceci prédit donc la formation d’une protéine tronquée, ou absente après dégradation par le mécanisme cellulaire de dégradation des ARNm non-sens. Par Western- Blotting nous avons pu révéler, en lignée lymphoblastoïdes, la protéine CASC5 endogène chez tous nos patients, y compris, à notre surprise, chez les sujets atteints.

Il est décrit dans la littérature qu’un knockdown de CASC5 provoque un mauvais alignement des chromosomes, une entrée prématurée en mitose et la formation de micronoyaux, conséquence d’un mauvais alignement des chromosomes pendant la métaphase. Les différentes études menées sur le phénotype cellulaire de nos patients en lignées lymphoblastoïdes n’ont pu révéler ces défauts. Notre hypothèse est que l’allèle muté est hypomorphe et que le phénotype cellulaire décrit en boites de culture ne s’observerait in vivo que dans certaines cellules du cerveau en cours de développement.

En parallèle de ces travaux, nous avons également contribué à l’identification de la cause d’une microcéphalie primaire syndromique, associée à un diabète insulino-requérant précoce, tansmis sur le mode récessif autosomique et identifié dans une famille d’origine marocaine. Notre laboratoire avait localisé la mutation dans une région de 3 cM du chromosome 4. Parmi les 39 gènes compris dans cette région, nous en avons sélectionné et séquencé plusieurs. Aucun n’a cependant montré de mutation. Un séquençage de l'exome complet de l’un de nos patients, a permis de mettre en évidence une mutation non-sens homozygote dans un gène de l’intervalle critique de liaison. La mutation ségrège avec le phénotype autosomique récessif chez les malades, leurs parents et leurs germains asymptomatiques. L’abondance du transcrit de ce gène a été mesurée en lignées lymphoblastoïdes de patients : il est présent en quantité similaire chez les patients et chez un contrôle non apparenté.

En conclusion, notre travail a permis l’identification d’un nouveau gène muté chez des patients atteints de microcéphalie primaire, CASC5, avec un haut degré de preuve de causalité de cette mutation, impliquant ainsi une protéine du réseau KMN du kinétochore dans le développement volumique du cerveau humain. Nous avons par ailleurs contribué à

l’identification d’un nouveau gène causant microcéphalie primaire et diabète juvénile, dont le mécanisme biologique est en cours d’investigation.

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LISTE DES ABREVIATIONS

Acide désoxyribonucléique

Complexe promoteur de l'anaphase Acide ribonucléique messager

Abnormal Spindle-like, Microcephaly associated Ataxia Telangiectasia Mutated

Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein Aurora Kinase B

Big dye terminator BRCA1 C-terminale

BRCT-repeat Inhibitor of hTERT expression 1 Budding Uninhibited by Benzimidazoles 1 BUB1- Related 1

CAncer Susceptibility Candidate 5

Constitutive Centromeric-Associated Network Cycle de division cellulaire

Protéine Kinase cycline-dépendante

Cyclin Dependant Kinase 5 Regulatory subunit-Associated Protein 2 CENtromeric Protein J

CEntrosomal Protein, 135kD CEntrosomal Protein, 152kD Checkpoint Kinase 1

Checkpoint Kinase 2

KNL1/Mis12 complex/Ndc80 complex) Kinetochore-null protein 1

Logarithme de Odds

Mitotic Checkpoint Complex

Microcéphalie Primaire Autosomale Récessive Mendelian Inheritance in Man

Majewski Osteodysplastic Primordial Dwarfism type II Centre Cellulaire Organisateur des microtubules

Syndrome d’Aneuploïdie Variable en Mosaïque ADN

APC ARNm

ASPM ATM ATR

AURKB BDT

BRCT BRIT1 BUB1 BUBR1 CASC5 CCAN CDC CDK

CDK5RAP2 CENPJ CEP135 CEP152 CHK1 CHK2 KMN KNL1 LOD MCC

MCPH MIM

MOPDII MTOC MVA

7 PAF

PC PCC PCTN

PLK PNB

PP1 (RT)-PCR

SAC SG STIL

SVZ TBS

VZ WDR62

Paraformaldehyde Plaque Corticale

Condensation Prématurée des Chromosomes Péricentrine

Polo-Like Kinase

Précurseurs des Neurones Granulaires (Reverse transcriptase) polymerization chain reaction

Spindle Assembly Checkpoint Granules de Stress

Sil, SCL/TAL1 interrupting locus Zone Sous Ventriculaire

Tris buffer saline Zone Ventriculaire

WD40-Repeat domain 62

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1. Introduction 11

1.1. Les maladies génétiques ... 11

1.1.1. Considérations générales sur l’hérédité ... 11

1.1.2. Types de maladies génétiques ... 13

1.2. Maladies génétiques récessives et consanguinité ... 13

1.2.1. Maladies génétiques récessives ... 13

1.2.2. Consanguinité ... 14

1.3. La microcéphalie primaire autosomique récessive (MCPH) ... 15

1.3.1. Développement du cortex cérébral ... 15

1.3.2. Le cycle cellulaire et la mitose ... 15

1.3.3. Progression de la division cellulaire des cellules progénitrices ... 18

1.3.4. Définition de la microcéphalie ... 19

1.3.5. Les causes de microcéphalie ... 20

1.3.6. Bases moléculaires de la MCPH ... 20

1.3.6.1. Hétérogénéité de loci ... 20

1.3.6.2. Gènes connus ... 21

1.3.6.2.1. Microcephalin ou BRIT1 (MCPH1) ... 21

1.3.6.2.2. WDR62 (MCPH2) ... 23

1.3.6.2.3. CDK5RAP2 (MCPH3) ... 24

1.3.6.2.4. ASPM (MCPH5) ... 25

1.3.6.2.5. CENPJ (MCPH6) ... 26

1.3.6.2.6. STIL (MCPH7) ... 27

1.3.6.2.7. CEP135 (MCPH8) ... 28

1.3.6.2.8. CEP152 (MCPH9) ... 28

1.3.7. La microcéphalie primaire associée à d’autres anomalies ... 29

1.3.7.1. Syndrome de Seckel ... 30

1.3.7.2. Microcéphalie primaire et diabète juvénile ... 31

2. Méthodes 33

2.1. Clonage positionnel ... 32

2.1.1. Cartographie génétique ... 32

2.1.2. La cartographie par homozygotie ... 33

2.1.3. Mesure quantitative de la liaison : le LOD score ... 33

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2.2. Analyse In Silico des gènes candidats ... 34

2.2.1. Analyse directe ... 34

2.2.2. Analyse assistée par le programme Endeavour... 34

2.2.3. Comparaison d’espèces, Ka/Ks ... 34

2.3. Recherche de mutations ... 35

2.3.1. Conception des amorces et amplification des fragments d’ADN à séquencer .. 35

2.3.2. Séquençage par la méthode Sanger ... 36

2.3.3. Séquençage à haut débit ... 38

2.3.3.1. GS-FLX 454 pyrosequencer ... 38

2.3.3.2. Exome Sequencing ... 40

2.4. Analyse fonctionnelle des mutations ... 40

2.4.1. Cultures cellulaires ... 40

2.4.1.1. Lignées lymphoblastoïdes ... 40

2.4.1.2. Culture primaire de fibroblastes ... 41

2.4.2. Etude du Transcrit ... 41

2.4.2.1. Extraction d’ARN ... 41

2.4.2.2. Reverse Transcription ... 42

2.4.2.3. Amplification des ADNc par PCR ... 43

2.4.2.4. Analyse des produits PCR par électrophorèse en gel d’acrylamide ... 43

2.4.2.5. Hybridation In Situ ... 43

2.4.3. Etude de la protéine... 45

2.4.3.1. Western-Blotting ... 45

2.4.3.2. Immunofluorescence ... 48

3. Résultats 50

3.1. Identification d’autres familles liées au locus MCPH4 ... 50

3.2 Exclusion de CEP152 dans nos familles ... 51

3.3. Sélection de gènes candidats ... 51

3.3.1. Tri des gènes in silico... 51

3.3.2. Etude transcriptomique par puce Affymetrix ... 52

3.4. Séquençage des gènes candidats ... 52

3.5. Le gène CASC5 ... 53

3.5.1. Identification de la mutation ... 55

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3.5.2. Etude du transcrit CASC5 en cellules lymphoblastoïdes de patients ... 56

3.5.2.1. Défaut d’épissage du transcrit CASC5 en lignées lymphoblastoïdes de patients ... 56

3.5.2.2. Expression du transcrit CASC5 en cerveaux fœtaux humains et murins .... 57

3.5.3. Etude de la protéine CASC5 ... 57

3.5.3.1. La protéine CASC5 est présente dans les lymphoblastes des patients ... 58

3.5.3.2. CASC5 est correctement exprimée et localisée en fibroblastes des patients ... 58

3.5.3.3. Analyse de l’expression et de la localisation de partenaires de CASC5 et d’autres protéines causant une MCPH dans les fibroblastes des patients ... 59

3.6. Séquençage de tout l’intervalle MCPH4 ... 60

4. Syndrome rare associant microcéphalie et diabète 61

4.1. Description clinique des patients ... 61

4.2. Résultats ... 61

4.2.1. Exclusion du syndrome de Wolcott-Rallison... 61

4.2.2. Localisation du gène par cartographie d’homozygotie ... 62

4.2.3. Analyse de gènes candidats... 62

4.2.4. Séquençage de tous les exons d’un proband (Exome) ... 62

4.2.5. Analyse du transcrit RG9MTD2 ... 64

5. Etude d’autres familles MCPH 65

5.1. Recherche de nouvelles familles ... 65

5.1.1. Homozygosity Mapping dans les familles consanguines ... 65

5.1.2. Gene Panel MCPH in silico et analyse d’exome complet ... 65

5.2. Résultats ... 66

6. Discussion 67

7. Conclusions et perspectives 75

8. Bibliographie 78

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Chapitre 1

Introduction

1.1. Les maladies génétiques

Les maladies génétiques résultent d’anomalies au niveau d’un ou de plusieurs gènes, qui sont transmises à la descendance, et entraînent un dysfonctionnement au niveau cellulaire¹. A l’heure actuelle, des milliers de maladies génétiques ont été documentées dont la plupart sont rares (< 1/2000) ou très rares (< 1/50.000). Les maladies génétiques rares sont mal connues et souvent difficiles à diagnostiquer. L’identification des gènes responsables de maladies génétiques permet d’établir un lien entre des molécules précises et les conséquences phénotypiques qu’engendre leur mauvaise fonction. Cela permet également d’éclaircir les mécanismes dans lesquels sont impliquées les protéines encodées par les différents gènes découverts mutés dans une même pathologie. Ceci permet une meilleure compréhension de la maladie et au final une amélioration du suivi et du traitement des patients. Certaines anomalies génétiques, comme le daltonisme, sont faiblement invalidantes, d’autres en revanche sont extrêmement graves, voir létales. Certaines de ces maladies sont visibles dès la naissance, comme l’ostéogénèse imparfaite, d’autres apparaissent plus tard, comme la maladie de Huntington. Cependant, la plupart de ces maladies apparaissent dans l’enfance ou l’adolescence. Malgré l’avancée considérable des connaissances à propos du génome humain, de nombreuses maladies génétiques restent encore mal comprises et le(s) gène(s) responsable(s) encore non-identifiés.

1.1.1. Considérations générales sur l’hérédité

Les cellules somatiques humaines possèdent au total 46 chromosomes, répartis en 23 paires.

Sur ces 23 paires, 22 sont identiques chez l’homme et la femme, les autosomes, et la dernière paire contient les chromosomes sexuels ou gonosomes : XX chez la femme et XY chez l’homme. Des chromosomes homologues sont des chromosomes appartenant à la même paire, de même taille, possédant les mêmes gènes mais pas obligatoirement les mêmes allèles. Chez les organismes diploïdes, l'un des chromosomes homologues est d'origine maternelle, l'autre d'origine paternelle. Pour la 23^ième paire de chromosome dite sexuelle chez les mammifères, la mère étant XX, elle ne peut transmettre à sa descendance qu’un chromosome X, alors que

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le père étant XY, transmettra soit un X pour une fille, soit un Y pour un garçon¹. Il existe deux types de division cellulaire; la mitose et la méiose. La mitose correspond à la division d’une cellule somatique mère en deux cellules somatiques filles, chacune ayant un nombre de chromosomes et de gènes identique à la cellule mère, ce qui permet à l’organisme de se développer, se différencier et se régénérer. La méiose est constituée de deux divisions cellulaires successives qui aboutissent à la production de cellules sexuelles ou gamètes pour la reproduction (Fig.1). Lors de la première division de méiose (division réductionnelle), les chromosomes migrent au centre de la cellule. Chaque chromosome d’une même paire, se place en vis-à-vis de son chromosome homologue au niveau de la plaque équatoriale. Les chromatides des paires de chromosomes homologues forment ainsi des tétrades. Au niveau de ces tétrades, se produisent des échanges de fragments génétiques entre les chromatides des chromosomes homologues nommés recombinaisons homologues ou crossing-over. Ceci permet un brassage génétique par la formation de chromosomes recombinés. Après ces échanges, les chromosomes homologues se séparent, un chromosome de chaque paire migre vers un des pôles de la cellule, et la première division cellulaire se termine. La seconde division de méiose (division équationnelle), est similaire à une mitose sauf qu'elle concerne des cellules haploïdes. A la fin de la métaphase, les deux chromatides de chaque chromosome migrent vers les pôles opposés de la cellule ce qui termine alors sa division (Fig.1). Au cours de la méiose, il existe trois possibilités pour deux gènes de ségréger¹ (Fig.2):

1- Si deux gènes sont situés sur différents chromosomes, ces chromosomes se répartiront de manière indépendante et donc ces deux gènes ségrègeront de manière indépendante lors de la méiose.

2- Si deux gènes sont situés côte à côte sur le même chromosome, la probabilité qu’une recombinaison homologue les sépare lors de la méiose est très faible. Les deux gènes co- ségrègeront.

3- Entre ces deux situations extrêmes, si l’on considère deux gènes situés à une certaine distance l’un de l’autre sur le même chromosome, ils tendront à ségréger ensemble lors de la méiose à moins qu’une recombinaison homologue ne vienne les séparer.

Ce phénomène se nomme liaison génétique. La situation (2) représente une liaison génétique très étroite.

13 1.1.2. Types de maladies génétiques

De nombreuses maladies génétiques, dites monogéniques, résultent du défaut d’un gène unique. Lorsqu’en revanche plusieurs défauts génétiques sont impliqués simultanément, on parle de maladie multigénique. Les maladies monogéniques se distinguent par leurs caractères de transmission; elles seront dominantes, récessives, liées au chromosome X ou à l'ADN mitochondrial. La transmission dominante implique qu’un seul allèle muté pour un certain gène provoque le phénotype malade chez le sujet. Au contraire, elle sera récessive lorsque les deux allèles doivent être mutés pour que la maladie apparaisse, un seul allèle muté ne suffisant pas à produire le phénotype malade. On distingue enfin les maladies génétiques selon la localisation du gène atteint; sur un autosome (chromosome 1 à 22) on parle de maladie autosomique, sur un chromosome sexuel on parle de maladie gonosomique et sur de l’ADN mitochondrial, on parle de maladie mitochondriale¹. Les différents types de maladies génétiques sont résumés dans le Tableau 1.

1.2. Maladies génétiques récessives et consanguinité 1.2.1. Maladies génétiques récessives

Les maladies génétiques autosomiques récessives résultent du fait qu’un sujet hérite de deux allèles mutés (un de chacun de ses deux parents, qui sont porteurs sains hétérozygotes). Les allèles mutés peuvent porter la même mutation (le malade sera homozygote) ou deux mutations différentes (le malade sera hétérozygote composé). Les parents sains des individus atteints sont des porteurs obligatoires de la maladie et chacun des enfants du couple a 25% de risque d’être atteint (Fig.3).

En 1902, Sir Archibald Garrod fut le premier à décrire une maladie humaine, l’alcaptonurie, comme répondant aux principes de la transmission mendélienne autosomique récessive². Garrod observa qu’une proportion élevée de patients atteints d’alcaptonurie étaient issus de mariages entre cousins germains et interpréta que la consanguinité favorise l'apparition des homozygotes. Il est bien établi depuis que les maladies récessives rares apparaissent plus souvent chez les enfants consanguins que dans la population générale. Les enfants de cousins germains, par exemple, ont un risque de 3-5% d’être atteints d’une maladie génétique récessive, alors que les enfants de parents non-consanguins ont un risque <0,5%³. En effet, la maladie dans ces familles est généralement due à l’homozygotie par descente d’un seul allèle muté, hérité d'un ancêtre commun aux lignées maternelle et paternelle. Ce constat explique non seulement l'incidence de ces maladies dans les familles consanguines, mais fournit

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également un puissant outil pour la cartographie génétique des gènes responsables (voir plus loin).

1.2.2. Consanguinité

On parle de consanguinité quand les membres d’un couple partagent au moins un ancêtre commun relativement proche. Ceci est représenté par une double ligne d’union entre les membres du couple sur le pédigrée. Chaque descendant d’une union consanguine a un risque majoré d’hériter de deux copies du même allèle malade qui sera authentiquement homozygote (identique par descente). Plus l’ancêtre commun est proche, plus le risque est élevé. Le coefficient de consanguinité (F) est une mesure de la proportion de gènes hérités de manière homozygote entre deux individus (Fig.4). Ce coefficient est utile pour l'évaluation des risques d’une maladie récessive dans une famille où il y a une consanguinité connue. Les descendants de cousins au second degré ont un coefficient de consanguinité de 1/64 (1/64ème de leur génome est identique par descente et donc homozygote); les descendants de cousins germains ont un coefficient de consanguinité de 1/16; les descendants de doubles cousins germains ou de demi-frère et demi-sœur de 1/8; et les descendants d’une union entre frère et sœur de 1/4.

La conséquence clinique de la consanguinité est une incidence accrue de maladies autosomiques récessives. Imaginons une maladie causée par un allèle récessif en un seul locus mendélien, où l’allèle malade a une fréquence q dans une population en équilibre de Hardy Weinberg (grande population, panmixie, absence de mutation et de sélection naturelle). Si un enfant est atteint de la maladie, alors l’homozygotie par descente au locus malade est presque sûrement en cause: la probabilité peut en être calculée selon la formule α = Fq / [Fq + (1 - F)q2], où Fq représente la proportion des enfants atteints consanguins homozygotes au locus et (1-F)q2 les enfants non homozygotes par descente au locus mais atteints à cause de la transmission par hasard de deux allèles malades. Si q est beaucoup plus petit que F, α est très proche de 1⁴. Prenons l’exemple de la mucoviscidose, où q est élevé (1/50), pour un couple de cousins germains. La probabilité que leurs enfants soient atteints par homozygotie par descente de l’allèle malade est de α = Fq / [Fq + (1 - F)q2] = 1/16*1/50 : [1/16*1/50 + 15/16*1/50*1/50] = 10/8000 : [10/8000 + 3/8000] = 10/13 = 77%. Il y a donc 23% de chance que l’enfant soit atteint par hasard et non à cause d’une homozygotie par descente de l’allèle malade. Prenons un autre exemple où q est plus faible (1/500), pour un couple de cousins germains. La probabilité que leurs enfants soient atteints par homozygotie par descente de l’allèle malade est de α = Fq / [Fq + (1 - F)q2] = 1/16*1/500 : [1/16*1/500 +

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15/16*1/500*1/500] = 100/103 = 97%. Il n’y a donc dans ce cas que 3% de chance que l’enfant soit atteint par hasard.

1.3. La microcéphalie primaire autosomique récessive (MCPH) 1.3.1. Développement du cortex cérébral

Le cortex cérébral se forme dans la partie antérieure du tube neural. La première structure cérébrale à se différencier dans ce qui donnera les hémisphères cérébraux est la zone ventriculaire. Les progéniteurs neuraux (cellules souches des neurones et de cellules gliales), se situeront dans la face apicale juxtaventriculaire du neuroépithélium devenu pseudostratifié.

Les progéniteurs se multiplient et se divisent de façon symétrique en deux cellules-filles identiques ou de façon asymétrique pour former une cellule-fille progénitrice identique et une cellule qui se différencie et migre radialement vers la surface et se différencie en neurone (Fig.5). L'autre cellule reste dans la zone ventriculaire et est apte à une nouvelle division proliférative⁵. La structure initiale en trois couches (épendymaire ou ventriculaire, intermédiaire ou du manteau, et marginale) du tube neural primitif, est rapidement modifiée au niveau du cortex cérébral. Les neurones de la zone intermédiaire (manteau) envahissent progressivement la zone marginale où ils vont constituer, suite à un processus de prolifération, de migration et de différenciation complexe, les différentes couches du cortex cérébral. Les neurones du cortex des mammifères sont organisés en six couches, par contre les cortex des reptiles et des oiseaux présentent seulement trois couches, qu’on pense être équivalentes aux couches I, V et VI des mammifères⁶. Le répertoire, augmenté de fonctions cognitives supérieures des mammifères, semble être le résultat d’une augmentation du volume cortical.

Parmi les mammifères, c’est l’homme, qui présente le plus grand quotient d'encéphalisation, c'est-à-dire qu'il a le plus gros cerveau pour la dimension de son corps.

1.3.2. Le cycle cellulaire et la mitose

Le cycle cellulaire des eucaryotes comprend quatre phases (Fig.6a). Durant deux de ces phases, S et M, les cellules exécutent deux événements fondamentaux du cycle : la réplication de l’ADN (phase S, pour synthèse) et le partage rigoureusement égal des chromosomes entre les deux cellules filles (phase M, pour mitose). Les deux autres phases du cycle, G1 et G2, représentent des intervalles: au cours de la phase G1, la cellule effectue sa croissance, intègre les signaux mitogènes ou anti-mitogènes et se prépare pour effectuer correctement la phase S ; au cours de la phase G2, la cellule se prépare pour la phase M. Les phases G1, S et G2 constituent l'interphase. Il existe également une phase dite de quiescence, la phase G0, qui

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correspond à la sortie du cycle. Celle-ci survient généralement en G1. La mitose se compose de plusieurs phases: la prophase, la métaphase, l´anaphase et la télophase (Fig.6b). Durant ce phénomène, noyau et cytoplasme seront divisés, on parlera respectivement de caryocinèse et de cytocinèse. Le fuseau mitotique est une structure cellulaire éphémère constituée de microtubules. Il n'est présent que lors de la division cellulaire. Le fuseau mitotique est bipolaire formant deux pôles de nucléation à partir desquels les microtubules croissent en direction de l’équateur cellulaire. Les microtubules sont constitués de plusieurs protofilaments de tubuline. Chaque protofilament est lui-même constitué de dimères de tubuline-α et tubuline-β reliées par des liaisons non-covalentes. Cet assemblage polymérique est extrêmement labile : les extrémités des microtubules polymérisent et dépolymérisent en permanence. Les deux extrémités des microtubules ont des propriétés différentes (polarité du microtubule). Il existe une extrémité "plus" où les dimères s'ajoutent et une extrémité "moins"

qui au contraire perd progressivement ses dimères. Dans les cellules animales, le centrosome est le centre cellulaire organisateur des microtubules (MTOC). Il se compose d'une paire de centrioles, perpendiculaires l'un à l'autre, entourée par un nuage de matériel amorphe péricentriolaire. La gamma-tubuline est un élément essentiel du MTOC responsable de la nucléation et de l’orientation polaire des microtubules. La gamma-tubuline s’associe à d’autres protéines pour former le gammatubulin ring complex ou gamma-TuRC qui imite l’extrémité « plus » d’un microtubule, ce qui permet aux dimères de tubuline de se lier. Le centrosome se duplique au cours de la phase de synthèse (pendant l'interphase) et se sépare pendant la mitose pour former les deux pôles du fuseau mitotique.

Au cours du cycle cellulaire, il existe des mécanismes de surveillance capables d’imposer l’arrêt du cycle. Ces mécanismes interviennent lorsque des lésions ou des anomalies de réplication de l'ADN sont détectées, ou pour contrôler que les chromatides-sœurs vont bien se répartir équitablement dans les deux cellules filles. Ils assurent en quelque sorte le « contrôle de qualité » du cycle cellulaire. Les étapes principales (checkpoints) de ces mécanismes de surveillance contrôlent les transitions G1/S (G1/S checkpoint), G2/M (G2/M checkpoint), et Métaphase/Anaphase (Spindle Assembly Checkpoint). L'entrée en mitose, ou transition G2/M, est sous le contrôle du complexe CyclineB/CDK1 et se réalise de manière brutale (Fig.7). Un stock de CyclineB/CDK1 se forme pendant la phase G2. En fin de G2, la Polo kinase phosphoryle CDC25, permettant son activation partielle. CDC25 (activateur) agit alors en déphosphorylant CDK1 (appelé aussi CDC2), une partie des CyclineB/CDK1 est ainsi activée. En même temps, WEE1 continue à phosphoryler CDK1, ce qui contribue à maintenir

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une majorité de complexes CyclineB/CDK1 inactifs. Les quelques molécules CDK1 activées phosphorylent WEE1 (qui est ainsi inhibée) et CDC25 (qui est ainsi activée). Ainsi le complexe CyclineB/CDK1 active son propre activateur et inhibe son propre inhibiteur. Ces deux boucles de rétrocontrôle positif ont pour conséquence l’activation de tous les complexes et l’entrée en mitose, commençant par la condensation des chromosomes dans le noyau, la séparation des centrosomes, et l’augmentation de l’activité de nucléation des microtubules dans le cytoplasme. Le point de surveillance de la phase G2/M peut être activé par divers signaux (cassures des brins d’ADN, arrêt de la progression de la réplication lors de la synthèse de l’ADN,...), et permet d’arrêter le cycle en G2, c’est à dire de faire en sorte que la mitose ne soit pas initiée tant que la réplication n’est pas totalement et correctement achevée.

Pour cela, des molécules régulatrices vont soit inactiver la déphosphorylation de CDK1, soit inhiber l’activité de CDC25, lui faisant perdre sa capacité à déphosphoryler CDK1, soit maintenir l’activité de WEE1.

Lors de la mitose, une étape clé est le passage de la métaphase (où les chromatides sont encore étroitement associées) à l'anaphase (où les chromatides se séparent). Les chromatides sont liées entre elles dans la région du centromère, mais aussi tout au long de leurs bras, par un complexe de protéines: le complexe cohésine. Celui-ci se met en place pendant la réplication (phase S) et est dégradé en deux étapes. Au cours de la prométaphase de la mitose, le complexe cohésine est dégradé le long des bras mais demeure au niveau du centromère. A la fin de la métaphase, la destruction par un processus spécifique de protéolyse du complexe cohésine du centromère permet la séparation des chromatides-sœurs, qui peuvent alors migrer vers les pôles opposés du fuseau. Cette protéolyse est liée à l'activation du complexe APC/CDC20. L'ancrage correct des chromosomes au fuseau mitotique est indispensable au déclenchement de l'anaphase. Le contrôle de cet ancrage représente un point de contrôle important, au cours de la mitose, aussi appelé SAC (spindle Assembly Checkpoint) (Fig.8).

Un mécanisme opère pour s’assurer que tous les chromosomes sont correctement attachés au fuseau avant que la séparation des chromatides-sœurs n’ait lieu. Chaque kinétochore non correctement attaché au fuseau envoie un signal inhibiteur bloquant l’activation du complexe APC/CDC20. Ce signal généré par le kinétochore a pour conséquence la liaison de protéines inhibitrices (MAD1, MAD2, BUBR1, BUB1, BUB3 et MPS1) sur le complexe APC/CDC20.

Une fois que tous les kinétochores sont attachés, APC/CDC20 devient actif, ce qui permet la séparation des chromatides pour leur ascension polaire opposée.

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1.3.3. Progression de la division cellulaire des cellules progénitrices

Chez Drosophila Melanogaster, le développement du système nerveux central implique trois types de cellules en division: les cellules neuroectodermiques, les neuroblastes et les cellules mères ganglionnaires qui occupent des couches distinctes dans l’épithélium stratifié de l’embryon. La couche apicale est le neuroectoderme constitué de cellules épithéliales cuboïdales. Les neuroblastes perdent leurs jonctions intercellulaires et se séparent puis se divisent à la surface basale de l’épithélium neuroectodermique. Les divisions des neuroblastes sont asymétriques, donnant naissance à un nouveau neuroblaste et à une cellule mère ganglionnaire. Ensuite dans la couche la plus basale, la cellule mère ganglionnaire se divise symétriquement pour donner naissance à deux neurones ou deux cellules gliales⁷. Les cellules neuroectodermiques et les neuroblastes ont une polarité apico-basale (les complexes jonctionnels et les centrosomes sont apicaux en interphase). Dans les cellules neuroectodermiques, le fuseau mitotique s’aligne parallèlement à la surface apicale, ce qui résulte en un plan de clivage vertical et en une distribution symétrique des constituants cellulaires polarisés. Dans les neuroblastes au contraire, le fuseau mitotique pivote de 90° lors de la métaphase et s’aligne perpendiculairement à la surface neuroectodermique, ce qui résulte en un plan de clivage horizontal et en une distribution asymétrique des constituants cellulaires polarisés. Chez les mammifères, on peut noter trois différences principales avec le modèle de la drosophile dans le mode de division des progéniteurs neuronaux de la zone ventriculaire : la pseudostratification de la couche des progéniteurs, la perte de la rotation du fuseau mitotique, et la précision de la division symétrique des progéniteurs. Chez la drosophile, les neuroblastes subissent une division asymétrique neurogène dans une couche distincte de celle des cellules épithéliales neuroectodermiques. Chez les mammifères par contre, le cerveau se développe à partir d’un épithélium pseudostratifié, le neuroépithélium, dans lequel les cellules subissent des divisions symétriques ou asymétriques dans la même couche unique. Les cellules au sein du neuroepithélium sont en prolifération, définissant ainsi la zone ventriculaire. Les noyaux de ces cellules effectuent une migration le long de l’axe apico-basal appelée migration interkinétique (Fig.9). La variation de la taille du cerveau entre les invertébrés et les vertébrés s’explique en partie par le nombre de cellules progénitrices par unité de surface apicale. Pour permettre à plus de cellules d’être présentes sur la même surface apicale, les cellules progénitrices neuronales s’allongent dans l’axe apico-basal en rétrécissant leur surface apicale. L’épithélium devient alors pseudo-stratifié, avec des noyaux à différentes hauteurs. Chez les mammifères une rotation à 90° du fuseau mitotique lors des divisions asymétriques n’est jamais observée comme chez la drosophile. Les constituants de

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la membrane apicale sont répartis sur une plus petite surface chez les vertébrés. Une déviation minime de l’axe du fuseau mitotique pourrait donc suffire à rendre leur répartition dans les cellules-filles asymétrique, et conduire à une division neurogène⁸ (Fig.10). Il semblerait que les divisions symétriques des cellules progénitrices neuronales chez les mammifères résultent du maintien de la précision du plan de clivage des cellules jusqu’à la fin de la cytocinèse⁷. Pendant la cytocinèse, le sillon de clivage se forme de la membrane plasmique basale vers la membrane plasmique apicale. Ceci assure que la ségrégation des complexes jonctionnels apicaux dans les deux cellules-filles arrive tard dans la cytocinèse et que la séparation se fasse à la surface apicale. Cette séparation finale à la surface apicale nécessite que l’axe du fuseau et particulièrement le fuseau central reste bien parallèle à la surface apicale jusqu’à la fin de la cytocinèse. Une petite déviation de cette orientation suffit à mener à une division asymétrique⁷ (Fig.10).

1.3.4. Définition de la microcéphalie

Le terme microcéphalie désigne un volume du crâne plus petit que celui des individus de même âge et de même sexe. Le volume crânien reflète le volume cérébral, et s’évalue facilement par la mesure du périmètre crânien (PC). Si l’on considère que le volume du crâne, comme la taille et le poids, suit une distribution gaussienne dans la population générale, on s’attend à ce que 2% de la population normale ait un PC inférieur à 2 déviations standard (DS) sous la moyenne. Le terme de microcéphalie est généralement réservé aux périmètres crâniens

<-3 DS⁹. On distingue les microcéphalies primaires, dues à une anomalie du développement volumique cérébral et présentes avant la naissance, des microcéphalies secondaires, par exemple dans le cadre d’une maladie métabolique, qui le plus souvent ne sont pas congénitales et indiquent une condition neurodégénérative progressive¹⁰. Les patients MCPH (Fig.11) présentent tous un handicap mental, mais leur retard est généralement d'intensité légère à modérée¹¹. Il n'y a pas de déclin cognitif progressif ou de déficit moteur. Les premières étapes du développement telles que la vigilance, le sourire aux parents, et contrôle de la tête sont souvent normaux. Les étapes motrices et sociales plus tardives sont seulement légèrement retardées, mais le langage l’est toujours. Les adolescents qui présentent une MCPH ont une bonne motricité fine, un bon équilibre et de la grâce dans les mouvements. Ils réussissent bien dans le sport, en comparaison avec d'autres enfants retardés mentaux, et sont souvent de nature joyeuse. Les personnes avec MCPH ont tendance à bien se comporter et sont capables d’apprendre des gestes de la vie quotidienne, et quelques notions d’écriture et de lecture¹².

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Les critères validés de MCPH (revu en 2005 par Woods¹²) sont les suivants:

- Microcéphalie congénitale, PC avec au moins 3 DS en-dessous de la moyenne pour l'âge et le sexe.

- Retard mental sans autre trouble neurologique, comme la spasticité, ou le déclin cognitif progressif (l’absence de convulsions est retirée de la définition).

- Pour la majorité des personnes MCPH, taille, poids, apparence, caryotype et imagerie cérébrale normaux. Pour les personnes MCPH1: la taille peut être petite, mais le PC sera toujours nettement plus petit que la taille; certains patients peuvent présenter des hétérotopies neuronales périventriculaires à l’IRM cérébrale; et l'analyse cytogénétique peut indiquer une augmentation de la proportion de cellules en prophase.

1.3.5. Les causes de microcéphalie

La microcéphalie peut être d’origine génétique ou non génétique (environnementale). Les microcéphalies d’origine génétique sont classées en deux catégories: syndromiques (associées à des malformations congénitales extracérébrales), et non-syndromiques (isolées). Dans cette dernière catégorie, il y a lieu de distinguer les microcéphalies isolées avec architecture cérébrale normale (microcephalia vera) des microcéphalies associées à des anomalies de l’architecture cérébrale (Tableau 2). Les causes de microcéphalies sont très hétérogènes: on en connaît plusieurs centaines. Il existe de nombreuses causes génétiques ou non-génétiques de microcéphalie primaire avec retard mental, comme par exemple l’infection congénitale par le toxoplasme, la surconsommation d’alcool pendant la grossesse, ou le syndrome de Rubinstein-Taybi, qui doivent être soigneusement exclus avant que le diagnostic de MCPH (microcéphalie primaire héréditaire) soit considéré¹².

1.3.6. Bases moléculaires de la MCPH 1.3.6.1. Hétérogénéité de loci

La microcéphalie primaire autosomique récessive est une anomalie génétiquement hétérogène puisqu’à ce jour, huit gènes causant cette anomalie ont déjà été identifiés: le gène de la Microcéphaline ou BRIT1 (MCPH1)¹³, ASPM (MCPH5)¹⁴, CDK5RAP2 (MCPH3), CENPJ (MCPH6)¹⁵, et plus récemment, STIL (MCPH7)¹⁶, CEP152 (MCPH9)¹⁷, WDR62 (MCPH2)¹⁸ et CEP135 (MCPH8)¹⁹. D'autre(s) loci MCPH sont encore à découvrir, puisque plusieurs familles ne sont liées à aucun des loci connus²⁰.

21 1.3.6.2. Gènes connus

1.3.6.2.1. Microcephalin ou BRIT1 (MCPH1)

Pour identifier le gène lié au chromosome 8p23 (MCPH1 ; MIM #251200), un effet fondateur a été mis en évidence dans 2 familles liées²¹. Un gène, auparavant non-caractérisé, a montré la même mutation non-sens dans les deux familles partageant l’haplotype ancestral. Ce gène codant pour une protéine de 835 acides aminés fut appelé Microcephalin. Microcephalin ou BRIT1 contient 3 domaines BRCA1 C-terminaux (BRCT). Elle partage seulement 57%

d'identité avec l’orthologue murin, les régions les plus conservées étant les domaines BRCT, qui présentent 80% d'identité entre espèces. Des RT-PCR faites sur des tissus fœtaux²¹ montrent que BRIT1 est exprimée dans le cerveau foetal. Il l’est aussi dans le foie, les reins fœtaux, et également faiblement dans une série d'autres tissus fœtaux et adultes. L'hybridation in situ sur des embryons de souris a montré que BRIT1 est exprimée au cours de la neurogenèse. Dans le cerveau foetal, des niveaux élevés d'expression sont détectables au niveau du prosencéphale, en particulier, aux parois des ventricules latéraux. Les cellules progénitrices de cette région se divisent pour produire des neurones qui migrent pour former le cortex cérébral. Dans les cellules humaines U2OS et HeLa, BRIT1 est localisée aux centrosomes lors de la mitose (de la prophase à la télophase) et durant l'interphase, et co- localise avec la gamma-tubuline²². Cette localisation appuie l'existence d'un mécanisme centrosomal qui contrôle le nombre de neurones produits par les cellules progénitrices neurales et contribue directement à la microcéphalie. D'autres protéines contenant des domaines BRCT ont un rôle dans le contrôle du cycle cellulaire et la réparation de l'ADN²³, et une perte des gènes de réparation de l’ADN peut conduire à l'apoptose au cours de la neurogenèse²⁴. Il est maintenant bien établit que BRIT1 est un régulateur crucial des dommages à l'ADN dans les voies ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated)/ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein) et fonctionne comme un gène suppresseur de tumeur²⁵. De plus, BRIT1 interagit avec le complexe de remodelage de la chromatine ATP- dépendante SWI-SNF. Ces interactions sont renforcées en réponse à une lésion de l'ADN par la phosphorylation ATM/ATR-dépendante de SWI-SNF. BRIT1 serait requis pour le recrutement et le maintien de SWI-SNF aux lésions de l'ADN en favorisant le relâchement de la chromatine et en facilitant le recrutement des protéines de réparation de l'ADN. Une perte de BRIT1 conduirait donc à un échec du relâchement de la chromatine et de réparation de l’ADN double brin, ce qui peut contribuer au développement de MCPH et de cancer²⁶ (Fig.12).

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Un syndrome autosomique récessif a été décrit en 2002²⁷, caractérisé par une condensation prématurée des chromosomes (PCC) dans une fratrie issue de parents consanguins. Les enfants atteints présentaient également une microcéphalie, un retard de croissance, et un retard mental. Les fibroblastes des patients montraient une forte proportion de cellules en prophase, due à l’initiation trop précoce de la condensation des chromosomes. Ce syndrome co-localisait avec MCPH1 en 8p23, et il a été montré qu’il résultait également d’une mutation tronquante de BRIT1²⁸. La microcéphalie primaire de type MCPH1 partage ce phénotype cellulaire de PCC. Ce phénotype peut également être reproduit par interférence d’ARN de BRIT1 en culture cellulaire²⁸. Alderton et al. ont mis en évidence un défaut d’arrêt du cycle cellulaire au point de surveillance G2/M et donc une entrée prématurée en mitose des lignées lymphoblastoïdes (lymphocytes B immortalisés) de patients avec des mutations tronquantes de BRIT1²⁹. La microcéphalie primaire MCPH1 pourrait donc résulter d'une perturbation du cycle cellulaire pendant la neurogenèse.

BRIT1 régule CHK1 et BRCA1, grâce à l'interaction avec le facteur de transcription E2F1 sur les promoteurs des deux gènes. BRIT1 régule également d'autres gènes cibles d’E2F1 impliqués dans la réparation de l'ADN et l'apoptose. BRIT1 coopère donc avec E2F1 pour réguler les gènes impliqués dans la réparation et la surveillance de l'ADN et l'apoptose, et pourrait participer au maintien de l'intégrité génomique³⁰. BRIT1 a également une fonction en aval de CHK1 et de la voie ATR de réparation de l’ADN. La protéine CHK1 inhibe l’activité de CDC25. En l’absence de CDC25 le complexe n’est pas activé et l’entrée en mitose ne se fait pas. CHK1 est une kinase localisée aux centrosomes à l'interphase, mais pas pendant la mitose. L'inhibition chimique de CHK1 aboutit à la séparation prématurée des centrosomes et à l'activation de CDK1. L’absence de BRIT1 se traduit par la diminution de la phosphorylation de CDK1 sur sa tyrosine 15 à la fin des phases S et G2, ce qui explique une entrée trop précoce en mitose se traduisant phénotypiquement par une condensation prématurée des chromosomes. MCPH1 a donc un rôle direct dans la coordination de l’activité de CDC25 et du complexe CyclineB/CDK1 et donc, dans la régulation de l'entrée en mitose^29,

31. En conclusion, l’entrée prématurée en mitose due à l’absence de BRIT1 entraîne une condensation prématurée des chromosomes et une séparation prématurée des centrosomes. Le cycle du centrosome et le cycle nucléaire sont désynchronisés, entraînant un ralentissement, voire un arrêt de la mitose.

23 1.3.6.2.2. WDR62 (MCPH2)

En 2010, Bilgüvar et al. ont réalisé des séquençages d’exome entier sur une trentaine de probands présentants des malformations du développement cortical. Neuf d’entre eux étaient porteurs d’une mutation dans le gène WDR62 (WD40-repeat domain 62)³². Tous les patients présentaient une microcéphalie sévère, une pachygyrie et une hypoplasie du corps calleux. De plus, ils présentaient les caractéristiques radiologiques d'une lissencéphalie, y compris les divers degrés d'épaississement cortical et la perte de jonction entre les substances grise et blanche. Deux des sujets avaient une polymicrogyrie affectant de manière prédominante un hémisphère. D'autres malformations ont été observées incluant une dysmorphologie hippocampique avec une orientation verticale dans 6 cas et un seul cas de dysgénésie unilatérale du cervelet. Il n'y avait pas d'anomalies du tronc cérébral à l'exception d’une atrophie unilatérale observée chez un patient³². Rapidement, des mutations de WDR62 ont été identifiées chez des patients atteints de microcéphalie primaire ou de microcéphalie associée à d’autres symptômes^33-35.

Dans le cerveau murin en développement, l’expression de Wdr62 est prédominante dans les lignées de la crête neurale. Elle est également frappante dans les zones ventriculaires et subventriculaires (VZ et SVZ, respectivement) au cours de la neurogenèse corticale cérébrale (jours embryonnaires 11,5 à 16,5), avec une intensité décroissante à partir de E17.5. Dans le cervelet, Wdr62 est fortement exprimé dans les précurseurs des neurones granulaires (PNB) à la fin de la période embryonnaire et aux premiers stades postnataux. A partir du neuvième jour postnatal (P9), l’expression de Wdr62 est considérablement réduite. A P21, de faibles niveaux d'expression de Wdr62 sont détectés uniquement dans l'hippocampe et le cortex piriforme et la transcription est absente dans les neurones corticaux différenciés³². Une forte expression de Wdr62 dans la VZ et la SVZ du cerveau fœtal humain a également été montrée³². Dans les lignées humaines HeLa, HEK293T et lymphoblastoïde, au niveau subcellulaire, l’expression de WDR62 est faible, diffuse dans le cytoplasme et non nucléaire pendant l’interphase. Pendant la mitose, WDR62 s’accumule aux pôles du fuseau mitotique mais n’est pas présent au « midbody » ou fuseau central pendant la cytocinèse³⁵.

JNK (c-Jun N-terminal kinase) fait partie de la cascade de signalisation MAPK (mitogen- activated protein kinase). Des protéines d’échafaudage s’associent simultanément avec divers composants de la voie de signalisation MAPK et jouent un rôle dans la transmission et la régulation des signaux. WDR62 a été identifiée comme une nouvelle protéine d’échafaudage se liant à JNK. WDR62 potentialise l'activité kinase de JNK, mais inhibe la transcription des

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gènes c-jun et c-fos (formant le complexe AP-1) par le recrutement de JNK dans un compartiment non nucléaire. Il a été montré que la surexpression de protéines résidents dans des granules de stress (SG) provoque le recrutement de WDR62 endogène et de JNK activée aux SG³⁶. Plus récemment, il a été montré que l’inactivation de Wdr62 par électroporation in utero de siRNA dans des cellules neuroprogénitrices induit leur sortie du cycle cellulaire et réduit leur capacité de prolifération. Wdr62 agit comme un stabilisateur du fuseau mitotique en particulier durant la métaphase. En effet, la perte de Wdr62 provoque des défauts d'orientation du fuseau, une diminution de l'intégrité des centrosomes déplacés des pôles du fuseau et retarde la progression mitotique. Cette étude a également montré que la phosphorylation de WDR62 par JNK est nécessaire pour maintenir l'organisation du fuseau à la métaphase³⁷.

1.3.6.2.3. CDK5RAP2 (MCPH3)

Dans une famille pakistanaise avec microcéphalie primaire autosomique récessive, MCPH3 a été cartographié en 9q34³⁸. Une stratégie de clonage positionnel a été utilisée pour identifier le gène dans cette région avec une deuxième famille de même origine³⁹. Deux mutations homozygotes dans le gène CDK5RAP2 (Cyclin Dependant Kinase 5 Regulatory subunit- Associated Protein 2) ont été identifiées, une dans chacune des deux familles. L’expression de CDK5RAP2 a été détectée dans tous les tissus et dans des régions spécifiques du cerveau⁴⁰. La protéine CDK5RAP2 est localisée au centrosome dans des cultures de cellules humaines^{39, 41} et plus précisément dans l'ensemble du matériel péricentriolaire à tous les stades du cycle cellulaire⁴². Au cours de la mitose dans les cellules HeLA humaines, CDK5RAP2 est localisée aux pôles du fuseau mitotique pendant la métaphase, au sillon de clivage pendant la télophase et au « midbody » pendant la cytocinèse comme ASPM⁴³. Récemment, Issa et al. ont étudié l'expression spatio-temporelle de CDK5RAP2 dans le développement du cerveau de la souris et l'homme. Ils ont constaté la concordance entre les régions exprimant fortement Cdk5rap2 chez la souris et les sites les plus atteints dans la microcéphalie primaire. Les résultats dans les tissus humains confirment ceux dans les tissus de souris, soulignant la fonction de CDK5RAP2 dans la prolifération cellulaire. Ces études suggèrent un rôle de cette protéine dans le développement du cortex cérébral conservé chez les mammifères.

Cdk5rap2 a d’abord été identifiée par double-hybride comme partenaire de p35nck5a⁴⁴. La liaison de Cdk5rap2 est nécessaire pour l’attachement du gamma-tubulin ring complex

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(gammaTuRC) au centrosome. En perturbant la fonction de Cdk5rap2, on délocalise la gamma-tubuline du centrosome et on inhibe la nucléation centrosomale des microtubules, ce qui conduit à la désorganisation des microtubules en interphase et à la formation de fuseaux mitotiques anastraux (sans centrosome). Cdk5rap2 est donc un composant structurel péricentriolaire qui fonctionne dans l’attachement du gammaTuRC et donc dans la fonction d'organisation des microtubules du centrosome. De plus, Cdk5rap2 pourrait être un élément essentiel d'une voie moléculaire qui régule la cohésion des centrosomes pendant l'interphase et l'attachement des centrosomes aux pôles du fuseau lors de la mitose^{45, 46}. Cdk5rap2, est fortement exprimé dans le pool de progéniteurs neuronaux et sa perte provoque un épuisement des progéniteurs apicaux et une augmentation de l’arrêt du cycle cellulaire conduisant à une différenciation neuronale prématurée⁴⁷. La fonction de Cdk5rap2 est liée à la protéine péricentrine (PCTN) dont la perte de fonction est associée avec le Syndrome MOPDII (Majewski osteodysplastic primordial dwarfism type II). Un knockdown de PCTN en progéniteurs neuraux phénocopies les effets du knockdown de Cdk5rap2 et provoque une diminution de recrutement de Cdk5rap2 au centrosome. Ces aberrations dans le programme de la neurogenèse peuvent donc conduire au développement d'une microcéphalie dans plusieurs maladies⁴⁷.

1.3.6.2.4. ASPM (MCPH5)

Le gène ASPM (Abnormal Spindle–like, Microcephaly associated) est l’orthologue humain du gène de Drosophila melanogaster « abnormal spindle» (asp), qui est essentiel pour la fonction normale du fuseau mitotique des neuroblastes embryonnaires¹⁴. Une stratégie de clonage positionnel a été utilisée pour identifier le gène mutant dans la région critique MCPH5 en 1q31. Le gène ASPM a été localisé dans une région de 600 kb définie par des haplotypes communs entre les familles. ASPM est un grand gène de 28 exons et 10.4 kb de CDS (Coding DNA Squence)¹⁴. L'hybridation in situ chez la souris a montré son expression préférentielle au cours de la neurogenèse du cortex cérébral, en particulier dans la zone ventriculaire du cortex cérébral. L’expression est assez intense à E14.5, quand il y a beaucoup de cellules progénitrices dans la zone ventriculaire corticale, mais diminue en intensité à E16.5⁴⁸. Dans les cellules humaines U2OS, HeLa et HaCaT, ASPM est localisé au centrosome pendant l'interphase et aux pôles du fuseau mitotique de la prophase à la télophase, et co-localise avec la gamma-tubuline⁴⁹. ASPM est localisé au centrosome, mais également au « midbody » ou fuseau central pendant la cytocinèse dans les cellules humaines HeLa, HEK 293, et NIH3T3 ; dans les lignées cellulaires de rat B104 neuroblastome et également dans les cellules

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progénitrices neurales du néocortex des embryons de rat⁴³. La protéine ASPM contient un domaine N-terminale de liaison aux microtubules ainsi que des domaines « IQ » pour Isoleucine-Glutamine, d'environ 25 acides aminés de longueur contenant une séquence consensus [I,L,V]QxxxRGxxx[R,K], qui constitue une hélice-α capable de lier la calmoduline indépendamment du Ca2+. Entre la mouche, la souris et l’homme, on peut remarquer un nombre de domaines IQ de plus en plus grand⁴⁸. ASPM contient également deux domaines

« CH » pour Calponin Homology domain, qui sont des domaines de liaison à l’actine trouvés dans des protéines du cytosquelette et des protéines de transduction de signaux. L'une des plus importantes tendances dans l'évolution des mammifères est l'augmentation massive de la taille du cortex cérébral, en particulier chez les primates. La taille du cerveau semble contrôlée en partie par la modulation de l’activité du fuseau mitotique des cellules progénitrices neurales⁴⁸. Aspm est concentré aux pôles du fuseau mitotique dans les cellules neuro-épithéliales de la souris, et dans les cellules embryonnaires et progénitrices du cerveau des mammifères⁵⁰. L’expression de Aspm est down-régulée lors du passage des divisions cellulaires prolifératives aux divisions neurogènes. L'interférence d’ARN dans les cellules neuroépithéliales du télencéphale montre que, lorsque l’ARNm d’Aspm est réduit et que la protéine Aspm manque au niveau des pôles du fuseau mitotique, le plan de clivage est moins souvent orienté perpendiculairement à la surface ventriculaire du neuroépithélium. La modification d'orientation du plan de clivage augmente la probabilité que les cellules subissent une division asymétrique neurogène, c'est-à-dire que la membrane plasmique apicale soit héritée par seulement une des deux cellules filles. Une grande proportion des cellules neuroépithéliales se retrouve dans la couche de neurones, ce qui implique une réduction du nombre de cellules progénitrices. ASPM paraît donc crucial pour le maintien de l’orientation du plan de clivage qui permet la division cellulaire symétrique, proliférative au cours de neuro-développement du cerveau⁵⁰.

1.3.6.2.5. CENPJ (MCPH6)

Dans trois familles liées à la région critique MCPH3 en 13q12.2, dont une famille brésilienne précédemment décrite par Leal et al.⁵¹ et deux familles pakistanaises, Bond et al. ont identifié une mutation homozygote dans le gène CENPJ (CENtromeric Protein J)³⁹. Des analyses par Northern blot ont permis de détecter un transcrit majeur de 4,5 kb dans tous les tissus et lignées cellulaires examinés, avec la plus grande expression dans les testicules⁵². Malgré son nom de Centroméric protein, CENPJ co-localise avec la gamma-tubuline au centrosome tout au long du cycle cellulaire dans les cellules humaines SiHa (human cervical carcinoma cell

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line)⁵². Au cours de la mitose dans les cellules HeLA humaines, CENPJ est localisée aux pôles du fuseau pendant la métaphase, au sillon de clivage pendant la télophase et au « midbody » pendant la cytocinèse comme ASPM⁴³. CENPJ est aussi appelée CPAP pour Centrosomal P4.1-Associated Protein. En effet, la protéine a été découverte en utilisant le double-hybride en levure, pour rechercher les partenaires potentiels de la protéine 4.1R-135⁵². CPAP porte un motif de déstabilisation des microtubules de 112 acides aminés, qui non seulement inhibe la nucléation des microtubules du centrosome, mais aussi dépolymérise les microtubules⁵³. Durant la division cellulaire, CENPJ joue un rôle structurel dans le maintien de l'intégrité du centrosome et dans la morphologie normale du fuseau, et elle est impliquée dans le désassemblage des microtubules au centrosome⁵⁴. CENPJ peut fonctionner comme un co-activateur transcriptionnel dans la voie de signalisation STAT5⁵⁵, et aussi comme un co- activateur de la transcription médiée par NF-kappaB, probablement par l'intermédiaire de son interaction avec le coactivateur p300/CREB-binding protein⁵⁶. De plus, CENPJ interagit avec deux autres protéines responsables de microcéphalie primaire (STIL et CEP152) et ces interactions sont nécessaires pour la formation procentriolaire, ce qui implique un rôle central dans la biogenèse des centrioles^{57, 58} (Fig.13). Plus spécifiquement, CENPJ semble jouer un rôle dans l’élongation des centrioles⁵⁹ (Fig.13). Notons que certaines mutations de CENPJ causent le syndrome de Seckel (voir 1.3.6.2.8 et 1.3.7.1).

1.3.6.2.6. STIL (MCPH7)

En 2009, Kumar et al. ont identifié trois mutations différentes du gène STIL dans quatre familles indiennes atteintes de microcéphalie primaire⁶⁰. STIL (Sil, SCL/TAL1 interrupting locus) est une protéine centrosomale exprimée dans les cellules en prolifération⁶¹. Les souris dépourvues d'une protéine fonctionnelle Stil meurent à mi-gestation avec un retard de croissance marqué, des défauts dans le développement du pli neural et la perte de la symétrie gauche-droite⁶². De même, la perte de fonction de Stil chez le poisson zèbre provoque des apoptoses disséminées dans le système nerveux en développement associées à des anomalies mitotiques⁶³.

La protéine STIL est un régulateur mitotique, elle s’accumule pendant le cycle cellulaire, atteint son plus haut niveau en phase G2 et est ensuite dégradée en fin de mitose^{61, 64}. STIL est exprimée dans de multiples cancer et son expression est corrélée avec un taux élevé de mitose et les cancers en progression^{65, 66}. Un knockdown de STIL par siRNA en cellules cancéreuses cause un retard d’entrée en mitose associé avec une réduction de l’activation de la kinase

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CyclineB/CDK1⁶⁷. STIL est également nécessaire pour la duplication des centrioles en cellules humaines (Fig.13) et sa surexpression déclenche la formation quasi-simultanée de plusieurs centrioles filles autour de chaque centriole mère⁶⁸.

1.3.6.2.7. CEP135 (MCPH8)

CEP135 (CEntrosomal Protein, 135kD) a été identifié comme étant responsable de microcéphalie primaire dans une famille provenant du nord du Pakistan avec deux enfants malades. Le gène codant pour une protéine centrosomale est situé sur le bras long du chromosome 4. Des fibroblastes obtenus à partir d’un des patients présentaient des centrosomes multiples et fragmentés, des microtubules désorganisés, et un taux de croissance réduit⁶⁹.

CEP135 est localisé autour des centrioles et est solidement attaché aux centrosomes.

L’analyse de la séquence et des domaines de la protéine CEP135 indique la présence d'importants domaines α-hélicoïdaux (coiled-coil) couvrant presque continuellement la longueur de la protéine. Elle comprend également deux motifs hypothétiques en fermeture éclair à leucine (leucine zipper), ce qui implique que CEP135 est capable d’interaction protéine-protéine. En outre, trois motifs consensus de phosphorylation tyrosine ont été identifiés, ce qui suggère que CEP135 pourrait être une phosphoprotéine⁷⁰. L’analyse d’un knockdown de Cep135 en cellules CHO (Chinese hamster ovary) a montré que bien que la formation des microtubules n’était relativement pas affectée, plus de 50% des cellules présentaient un réseau de microtubules désorganisé. Un grand nombre de cellules étaient détachées et flottaient dans le milieu de culture pendant la mitose. Différentes anormalités du fuseau mitotiques ont été révélées: fuseau multipolaire et monopolaire et arrangement des microtubules complètement désorganisés. Ces cellules peinent également à achever leur division cytoplasmique suggérant que Cep135 est important pour l’organisation d’un fuseau mitotique fonctionnel et l’achèvement de la cytocinèse⁷⁰.

1.3.6.2.8. CEP152 (MCPH9)

Une mutation du gène CEP152 (CEntrosomal Protein, 152kD) a été identifiée dans deux familles de l’Est du Canada ayant chacune un enfant atteint de microcéphalie primaire¹⁷. Les patients étaient homozygotes pour une mutation faux-sens. Un troisième enfant atteint rapporté était hétérozygote composé pour cette mutation et une mutation tronquante. Un défaut de CEP152 cause également le syndrome de Seckel de type 5 (SCKL5)⁷¹, une maladie autosomique récessive rare caractérisée par un nanisme prénatal proportionné associé à un