Génomique Fonctionnelle des Cires Epicuticulaires
Patricia Costaglioli, Michel Tautu, Bertrand Garbay
Laboratoire de Biogenèse Membranaire Laboratoire de Biogenèse Membranaire
UMR 5200 CNRS-Université Victor Segalen Bordeaux 2 UMR 5200 CNRS-Université Victor Segalen Bordeaux 2
Exemple d’utilisation des puces ADN (1)
Les Cires épicuticulaires
• Couche cireuse hydrophobe
• Recouvre les parties aériennes des plantes
• Composition biochimique: dérivés d’AGTLC (C20-C32)
– Alcools primaires et secondaires – Aldéhydes, alcanes, cétones
– Esters, acides gras libres
• Rôles biologiques (mutants eceriferum, cer)
– Régulation de la « transpiration »
– Résistance aux pathogènes (insectes, bactéries..) – Protection UV
– Intégrité des grains de pollen
Long chain acyl-CoA trans-2,3-enoyl-CoA Long chain acyl-CoA n+2
KCS
ECR
ELONGASE ELONGASE
Plasma membrane Cell Wall Cutin
Primary alcohol Wax esters
Aldehydes Alkanes Secondary alcohols
Ketones
FAR*
WS
Decarbonylase FAR
Acyl reduction Acyl reduction pathway
pathway (20%) (20%)
Decarbonylation Decarbonylation
pathway
pathway (80%) (80%)
Hydroxylase Oxidase
LTPs
ABC transporters
Long chain acyl-CoA trans-2,3-enoyl-CoA
Long chain acyl-CoA n+2
KCS
ECR
ELONGASE ELONGASE
Plasma membrane Cell Wall Cutin
Aldehydes Alkanes Secondary alcohols
Ketones
Decarbonylase FAR
Acyl reduction pathway (20%) (20%)
Decarbonylation Decarbonylation
pathway
pathway (80%) (80%)
Hydroxylase Oxidase
LTPs
ABC transporters
VLCFAs C20-C32
Primary alcohol Wax esters
FAR*
WS
Acyl reduction
pathway
• KCS : CER 6, Fiddlehead, KCS 1
• KCR : Glossy 8
• ECR : TSC13
• CER 1 et WAX 2 (transporteur membranaire ou aldéhyde décarbonylase ?)
• CER 2 (régulation ?)
• CER 3 (régulation ?)
• Win1/SHN : facteur de transcription
Gènes connus à l’heure actuelle
Or, il existe 22 Loci CER chez Arabidopsis Thaliana
Objectifs du Projet
• Identifier d’autres gènes du métabolisme des cires
(synthèse, dégradation, transport), ainsi que les
protéines de régulation (facteurs de transcription, récepteurs nucléaires)
• Approche transcriptome
Comparaison de l’expression des gènes entre des
plantes normales (Ler0) et des mutants cer
plante sauvage (LER0)
mutants cer6-2 ou cer3
ARN m ARN m
RT + dNTP Cy5 Cy5 RT + dNTP Cy3 Cy3
ADNc marqués ADNc marqués
Protocole
plantules de 15 jours
Hybridation simultanée
Arabido 1 (14 400 gènes AT, oligos 60 mers déposés)
Arabido 2 (22 000 gènes AT, oligos 60 mers synthétisés in situ)
Rapport Cy5 Cy5 / Cy3 Cy3
Analyse
Scanner Scanner
+ Dye-swap
Ler-0 Cer 6-2
Fichiers pdf compte rendu manip (contrôle qualité)
Fichier excell
GeneName Description LogRatio
(ler0/cer6-2) PValueLog Ratio
rProcessed Signal (Cer6-2)
gProcessed Signal (Ler0)
AT2G14610.1 pathogenesis-related PR-1-like protein 2 4,03E-11 284 30180
AT3G57240.1 glycosyl hydrolase family 17 (beta-1,3-glucanase bg3) 1,13157 1,02E-09 167 2256 AT3G13610.1 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase family 1,11591 1,24E-08 37 482
AT2G42530.1 cold-regulated protein cor15b precursor 0,972336 4,93E-09 277 2597
AT2G44910.1 homeobox-leucine zipper protein, Athb-4 0,931978 7,84E-09 459 3923
AT4G30650.1 low temperature and salt responsive protein homolog 0,930917 7,66E-09 4195 35777 AT2G26010.1 plant defensin protein, putative (PDF1.3) 0,923731 8,44E-09 4978 41760
AT1G14880.1 unknown protein 0,917509 9,21E-09 1970 16295
AT2G26020.1 plant defensin protein, putative (PDF1.2b) 0,910633 1,01E-08 3408 27741 AT5G44430.1 plant defensin protein, putative (PDF1.2c) 0,900367 1,17E-08 4905 38996
AT4G08770.1 peroxidase, putative 0,855692 2,49E-08 356 2555
AT2G47880.1 putative glutaredoxin 0,815013 4,98E-08 337 2203
AT1G31680.1 copper amine oxidase, putative 0,813742 1,89E-06 50 325
AT1G78000.1 high affinity sulphate transporter, putative 0,799065 1,21E-07 130 821
AT5G23240.1 putative protein 0,796552 6,28E-08 975 6106
1 2
Extraction et analyse des résultats
3
L og R at io 0 0,3
-0,3
L og R at io 0 0,3
-0,3
Table 2
Real-time RT-PCR analysis of PR-1 gene expression in the mutant cer6-2 and in the control plant Ler-0.
ΔΔCt 2-ΔΔCt Fold change cer6-2/Ler-0
Experiment 1 8.08 3.70 10-03 -270
Experiment 2 7.00 7.81 10-03 -128
Experiment 3 8.84 2.18 10-03 -458
Experiment 4 7.45 5.72 10-03 -175
Experiment 5 7.85 4.33 10-03 -231
Table 3
Real-time RT-PCR analysis of PR-1 gene expression in cer1-1, cer3-1 and cer2 mutants and in Ler-0 and Col-0 control plants. Results are expressed as fold change ± SD with the Ler-0 results, except for cer2 whose results are expressed as fold change ± SD with the Col-0 results.
Col-0/ Ler-0 cer1-1/ Ler-0 cer3-1/ Ler-0 cer2/Col-0
PR1 -1.7 ± 0.9 (n=3) -24.9 ± 14.5 (n=3) -1.4 ± 2.3 (n=3) -236 ± 125 (n=3)
Figure 1
Real-time PCR analysis of PR-1, PDF 1.2c, PDF 1.3 , Cor15b, Athb4 in cer6-2 and cer6-2R
mutants and in Ler-0 control plants. Results are expressed as fold change compared to Ler-0
results
Conclusion
• Nous n’avons pas trouvé ce que nous cherchions (nouveaux gènes eceriferum)
• Approche expérimentale à reconsidérer
• Identification d’un lien entre synthèse des cires et mécanisme de résistance aux pathogènes
• Avantage des approches globales: mise en évidence
de processus sans idée préconçue
Etude des résistances au STI (imatinib) dans les Leucémies myéloïdes chroniques
• Collaboration laboratoire d’hématologie (Béatrice Turcq, FX Mahon) Université Victor Segalen Bordeaux2
• Patient atteind de Leucémie Myéloïde Chronique
LMC: réarrangement chromosomique induisant la surexpression d’une tyrosine kinase qui régule par phosphorylation la division cellulaire
Elle est activée constitutivement dans les LMC: prolifération des cellules souches hematopoiétiques dans la moelle osseuse
Les inhibiteurs de la tyrosine kinase (STI) inhibe la prolifération cellulaire
Résistance à l’Imatinib mesylate
• Résistance primaire et résistance secondaire
Étude des gènes différentiellement exprimés au cours de la résistance secondaire : étude transcriptomique
% BCR-ABL/ABL
0 1 10 100
/01/2000 /07/2000 /10/2000 /12/2000 /03/2001 /06/2001 /10/2001 /11/2001 /02/2002 /05/2002 /08/2002 /11/2002 /01/2003 /04/2003 /06/2003 /07/2003
A
B Certaines rechutes après traitement au STI ont été rapportées.
Le plus fréquemment, il s’agit de mutation de la tyrosine kinase au niveau du site de fixation de l’ATP: le STI ne peut plus se fixer.
Les autres cas de résistance?
• Échantillon après traitement chimiothérapeutique A
• Échantillon après rechute (résistance au traitement) B
• Comparaison des transcriptomes
Protocole expérimental
• Purification des cellules (lymphocytes et
plaquettes) à partir des échantillons sanguins (rémission/rechute)
• Purification des ARNs
• Synthèse des ADNc
• Synthèse d’ARNm marqués à la Cy5 et Cy3 par transcription in vitro
• Hybridation de lames (dye-swap) Agilent
Technologies (17 000 genes humains, oligos 60
mers synthétisés in situ)
Image obtenue
Analyse des données (1)
Analyse des données (2)
Manip A
logratio pvalue Dye-swap
logratio pvalue Protein with high similarity to human LRE1, which reverse transcribes L1 elements 1,58263 1,15E-31 -1,03853 1,50E-25
Member of the L1 transposable element family 1,38528 5,01E-33 -1,3842 5,21E-33
Member of the L1 transposable element family 1,35491 7,88E-33 -1,24488 5,78E-32
Protein of unknown function 1,30758 1,88E-32 -1,11083 1,58E-30
Activator of S phase kinase 1,29851 3,38E-12 -1,02067 2,01E-17
LINE retrotransposable element 1 1,2699 4,32E-32 -1,20069 1,87E-31
Protein of unknown function 1,26201 8,08E-12 -1,15705 2,15E-21
Protein with strong similarity to LINE retrotransposable element 1 1,21543 1,15E-31 -1,49326 1,24E-33
Lactotransferrin, transports iron in extracellular fluid , potential theraputic for autoimmune
diseases -1,00234 4,03E-29 0,979134 9,31E-29
Cathepsin G, a serine protease involved in inflammation -1,04623 1,04E-29 1,09852 2,21E-30
Lipocalin 2, a member of the lipocalin family of secreted transporters, may act in inflammatory -1,21439 1,15E-30 0,866699 5,27E-26
Defensin alpha 4; may modulate lymphocyte activity -1,50071 1,07E-33 1,42032 2,94E-33
Defensin alpha 1, may also regulate the classical complement cascade -1,99417 3,67E-35 1,8642 6,41E-35
Génes dont l’expression augmente chez les patients résistants
LMC – Résistance secondaire : RT PCRq Défensine alpha-1
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
A B
% BCR-ABL/ABL
0 5 10 15 20
18/12/2000 02/07/2001 04/03/2002 19/11/2002 04/11/2003
A B
Log Def-α1/actine
(N=7)
LMC – Résistance IM : expression de Def. αlpha-1 résistants-IM
0 1 2 3 4 5 6 7 8
T1 T2
log(DEF1/ACT)
0 1 2 3 4 5 6 7
T1 T2 T3
log(DEF1/ACT)
Résistants I IM Résistants II IM
Log Def-α1/actine
Log Def-α1/actine
LMC – Expression de Def. αlpha-1
1,000E-01 1,000E+00 1,000E+01 1,000E+02 1,000E+03 1,000E+04 1,000E+05 1,000E+06
35082 35340 35466 35799 36125 36166 36250
BCR-ABL DEF1
1,00E-01 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07
oct- 00
janv- 01
avr- 01
juil- 01
oct- 01
janv- 02
avr- 02
BCR-ABL/ABL DEF1/ACT
Défensine alpha-1 : marqueur précoce de la perte de la réponse à l ’IM (?)
LMC – Expression de Def. αlpha-1
Approche transcriptomique originale : 22 gènes différentielle ment exprimés
au cours de la résistance à l ’IM Def. Alpha-1
Variations d’expression Def-α1 corrélée à la qualité de la réponse au traitement
Expression Def.α1 corrélée à la réponse à l’IM
diminution rapide et persistante de l’expression de Def- α1 chez les patients répondeurs à l’IM
persistance de taux de transcrits élevés chez les patients présentant une résistance primaire à l’IM
ré augmentation de l’expression de Def. Alpha-1 lors de la résistance secondaire
Caractère prédictif précoce de la perte de la réponse à l’IM
validation sur une cohorte de patients plus important
Visualisation des données obtenues dans plusieurs expériences
(clustering hiérarchique)
Microarray Data Matrix
In analysis of microarray data, what we analyze is an expression matrix. Each column represents all the gene expression levels from a single experiment, and each row represents the expression of a gene across all experiments. Each element is a log ratio. The log ratio is defined as log2 (T/R), where T is the gene expression level in the testing sample, R is the gene expression level in the reference sample.
The expression matrix is presented as a matrix of colored rectangles. Each rectangle represents an element of the expression matrix.
