Mode opératoire de CRB-Anim : Prélèvement, Traitement et Congélation de fragment d'oreille de lapin

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Mode opératoire

Version n° 1 En date du 30/07/2017 Page 1 sur 4

Prélèvement, Traitement et congélation de fragment d’oreille de lapin

Ce mode opératoire est issu des recherches développées dans le WP2.2 de CRB-Anim (développements technologiques).

Rédigé par : Lucie Gavin-Plagne et Marielle Afanassieff

Institut/Unité : INSERM U1208

Personne(s) à contacter : marielle.afanassieff@inserm.fr

1. Objectifs du mode opératoire et domaines d’application

La présente procédure a pour objet de définir les modalités de prise en charge des tissus somatiques telles que la peau ou le cartilage d’oreille de lapin, de leur réception jusqu’à leur stockage dans des conditions optimales pour assurer leur stabilité génomique. Il peut s’appliquer à l’ensemble des prélèvements de peau dans le cadre des activités du CRB Anim pour la Cryobanque Nationale quelque soit l’espèce.

Le but de la cryoconservation de ce type de tissus, vise à permettre l’obtention de fibroblastes adultes à la décongélation des tissus, afin de les reprogrammer en cellules souches pluripotentes induites (rbiPSC). Les tissus somatiques permettant ainsi de conserver dans un but reproductif les génotypes d’animaux précieux ou malades chez lesquels la conservation de gamètes ou d’embryons est inconcevable ou impossible.

2. Références bibliographiques

Publication sur la cryo-préservation en cours de préparation Publication sur la production de rbiPSC :

Afanassieff M, Tapponnier Y and Savatier P. 2014. Generation of induced pluripotent stem cells in Rabbits. Methods in Molecular Biology, 2016; 1357:149-72. doi: 10.1007/7651_2014_140.

Osteil P, Tapponnier Y, Markossian S, Godet M, Schmaltz-Panneau B, Jouneau L, Cabau C, Joly T, Blachère T, Gocza E, Bernat A, Yerla M, Acloque H, Hiddot S, Bosze Z, Duranthon V, Savatier P, Afanassieff M. 2013. Induced pluripotent stem cells derived from rabbits exhibit some characteristics of naïve pluripotency. Biology Open 2(6), 613-618

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Prélèvement, Traitement et congélation de fragment d’oreille de lapin

Personne(s) à contacter : adresse mail marielle.afanassieff@inserm.fr

3. Mode opératoire 3.1. Solutions

Matériels Consommables

- Marqueur indélébile à l’azote liquide

ou étiquettes - Boîtes de pétri polystyrène stériles - Gants nitrile de préférence

- Portoir pour cryotubes - Lames de scalpel n°22 stériles - Boîte d’instruments stérile (2 pinces, 1

manche à scalpel) - Tubes Greiner 50 mL stériles - Sigma Aldrich # T2318 - Gants pour manipulation d’azote

liquide - Cryotubes Nunc stériles 2 mL - Sigma Aldrich # V7634

- Lunettes de protection - PBS (Phosphate-Buffered Saline) stérile - Gibco # 10010023 - Congélateur programmable (Freezal)

ou Boite de congélation (ex. Nagel) - CRYO3 - Stem alpha # 5617

- DMSO (DiméthylSulfoxide) Sterile - Sigma Aldrich # D2650 - Mélange Pénicilline/ Streptavidine/Glutamine (PSG 10X) Gibco # 16578

3.2. Mode d’obtention de l’échantillon

Généralement, les prélèvements sont réalisés sur les sites de collectes et ne sont traités qu’au retour au laboratoire. Les prélèvements peuvent être une oreille entière sur un animal euthanasié, ou un fragment d’oreille sur un animal vivant. Le prélèvement est réalisé avec un scalpel stérile et immédiatement stocké dans un tube de 40 ml contenant du PBS + 1% de PSG (PBS-PSG) à 4°C ou dans la glace. Vérifier que le tissu soit complètement immergé dans le tampon. Le tube doit être annoté avec le numéro de l’animal et la date de prélèvement. De façon optimale, le délai entre le prélèvement du tissu et sa congélation doit être inférieur à 48 heures avec une conservation intermédiaire à 4°C toujours dans du PBS-PSG.

3.3. Procédure

Avant la procédure, préparer le matériel : une place suffisante sur la paillasse doit être dédiée à cette activité et nettoyée avec de l’alcool 70%. Les cryotubes sont identifiés avec : le numéro de l’animal, la date de prélèvement ainsi que le type de l’échantillon, peau (P) ou cartilage (C), accompagné d’un numéro incrémenté. Préparer le milieu de congélation, soit du CRYO3 contenant 4,5% de DMSO, en mélangeant 450µL de DMSO dans 9550µL de CRYO3 et le garder dans la glace.

Pendant le traitement du prélèvement, l’opérateur s’assure que le prélèvement tissulaire ne se dessèche pas et n’est pas contaminé par du tissu avoisinant ou par d’autres échantillons.

Dans le cas d’une oreille entière, celle-ci est préparée de la façon suivante : - Enlever le contour de l’oreille très poilu à l’aide du scalpel :

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- Séparer la peau du côté externe de l’oreille (côté poils) en la tirant délicatement et l’éliminer

- Raser à l’aide d’une lame de scalpel les poils restant sur la peau du côté interne de l’oreille

Dans le cas d’un fragment d’oreille (biopsie ou pointe de l’oreille),

- séparer si possible la peau externe ou la raser comme pour la peau interne Dans les deux cas, une fois l’oreille ou le fragment d’oreille dépourvus de poils :

- rincer l’échantillon dans du PBS-PSG propre,

- séparer la peau du côté interne de l’oreille (fine membrane) du cartilage (portion plus épaisse et dure) en tirant délicatement.

- placer les deux tissus séparés dans deux boite de pétri propre

- découper chaque tissu séparément en petits carrés de 1mm², en réalisant tout d’abord des lanières de 1mm de largeur qui sont ensuite recoupées dans l’autre sens.

- répartir les petits morceaux de tissus dans des cryotubes annotés et contenant 1mL du milieu de congélation CRYO3/DMSO froid. Le volume des petits morceaux ne doit pas dépasser 0,5mL par cryotube.

En présence d’un congélateur programmable :

- rassembler les cryotubes sur le portoir ou les canisters du congélateur programmable - congeler les tissus à une cinétique de -1°C/min jusqu’à -80°C

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- à la fin de la cinétique (environ 2h), immerger les cryotubes dans l’azote liquide - stocker les tubes dans des containeurs à azote liquide (-196°C)

En absence de congélateur programmable :

- placer les tubes dans une boite de congélation de type Nalgen maintenue préalablement à 4°C et contenant de l’isopropanol frais (le changement de l’isopropanol est conseillé toutes les 3 utilisations)

- stocker la boite de congélation à -80°C pendant 24h, puis immerger les cryotubes dans l’azote liquide.

- stocker les tubes dans des containeurs à azote liquide (-196°C) 4. Hygiène et sécurité

Les prélèvements tissulaires sont traités comme du matériel biologique à risque infectieux et sont manipulés avec les précautions d’usage. L’opérateur doit être équipé d’une blouse en coton et porter des gants propres. Il faut rester le plus possible stérile ou propre car les échantillons sont destinés à la culture cellulaire après décongélation, donc seront manipulées en conditions stériles.

5. Traçabilité

Au niveau des échantillons, il est important de noter le numéro de l’animal, le tissu et la date de congélation pour pouvoir se référencer à la fiche de l’animal avec la date et le lieu de prélèvement.