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Développement d’un test d’agglutination pour la détection, in situ, de la vitellogénine : biomarqueur de la
contamination des écosystèmes aquatiques par oestrogènes mimétiques
Ilizabete Magalhaes-Antoine
To cite this version:
Ilizabete Magalhaes-Antoine. Développement d’un test d’agglutination pour la détection, in situ, de la vitellogénine : biomarqueur de la contamination des écosystèmes aquatiques par oestrogènes mimétiques. Toxicologie. Université Paul Verlaine - Metz, 2004. Français. �NNT : 2004METZ025S�.
�tel-01749578�
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Doctorole
THESE DE DOCTORAT pnÉsnurÉn a
L'UNIVERSITÉ DE METZ
POUR L'OBTENTION DU TITRE DE
DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DEI/iETZ spÉcrlr,rrÉ: BroLoGrE
OPTION : TOXICOLOGIE DE L'ENVIRONNEMENT
PAR
IIiZAbCtC MAGALHÂBS.NXTOINE Ecole
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OÉvTIoPPEMENT D'UN TEST D'AGGLUTTNATION POUR LA DÉTECTION, IN SITU,DE LA VITELLOCÉNTNN : BIOMARQUEUR DE LA CONTAMINATION DES ÉCOSYSTÈMES
AQUATIQUES PAR LES GSTROGÈNES MIMÉTIQUES
sourENUE r,B ro uÉcBMBRE 2004 DEvANT LE JURy conrposÉ oB :
Pr. I. PERES Pr. C.CASELLAS Pr. P.VASSEUR Pr. J. FALLA Pr. J.-C. PIHAN
Rapporteur Rapporteur Examinateur Directeur de Thèse Directeur de Thèse
Laboratoire d'Immunologie-Microbiologie Equipe de Production des Ecosystèmes et Ecotoxicologie (Laboratoire ESE-CNRS, unité FR2635) (Laboratoire LBFE)
IUT de Thionville-Yutz UFR SciFa
Impasse A. Kastler Campus Bridoux, rue du G. Delestraint
57970Yrtr7 57070 Metz
B I B L I O T H E O U E U N I V E R S I T A I R E DE METZ
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AQUATIQUES PAR LES GSTROGÈNES MIMÉTIQUES
sourENUE lB ro nÉcpMBRE 2004 DEvaNT LE JURy couposÉ nn :
Pr. I. PERES Pr. C.CASELLAS Pr. P.VASSEUR Pr. J.FALLA Pr. J.-C. PIHAN
Rrpporteur Rapporteur Examinateur Directeur de Thèse I)irecteur de Thèse
Laboratoire d'Immunologie-Microbiologie Equipe de hoduction des Ecosystèmes et Ecotoxicologie (Laboratoire ESE-CNRS, unité FR2635) (Laboratoire LBFE)
IUT de Thionville-Yutz UTR SciFa
Impasse A. Kastler Campus Bridoux, rue du G. Delestraint
S7970YUTZ 57070 Metz
A mes parents, ma sæur, mon mari e t . . . à mon parrain...
Remerciements
Au terme de ce travail, je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Messieurs les Professeurs Jaïro FALLA et Jean-Claude PIHAN pour leur compétence, leurs conseils, leur disponibilité et surtout leur aide sans laquelle ce travail n'aurait pas été aussi abouti. Je veux aussi les remercier pour leur confiance et pour m'avoir permis de participer à l'élaboration de différents projets.
Je remercie également Mesdames les Professeurs Isabel PERES et Claude CASELLAS d'avoir accepté d'être rapporteur de cette thèse et pour I'intérêt qu'elles ont porté à ce travail.
Mes remerciements vont aussi à Madame le Professeur Paule Vasseur qui, a accepté de faire parti des membres du jury.
Je remercie également le Président de la Fondation portugaise pour Technologie, Monsieur le Professeur Fernando naUÔe RIBEIRO d'avoir cru d'avoir permis qu'il se réalise.
la et la
en
Science et mon travail
Je tiens également à remercier chaleureusement Mademoiselle Marie-Laure LEDRICH ainsi que Messieurs Frédéric MELCHIOR, Philippe LAVAL-GILLY et Laurent FOUCAUD pour leur disponibilité de tous les instants et leurs nombreux conseils qui ont permis d'améliorer la qualité de cette recherche.
J'associe également à ce travail I'ensemble du personnel du département Génie Biologique de I'IUT de Thionville-Yutz pour leurs aides et leur gentillesse.
Enfin, je tiens à remercier mes parents, ma sæur et mon mari pour leur soutien inconditionnel durant ce travail.
Remerciements
.,
Avant-Propos
Avant-Propos
Ce travail a été co-financé (Bourse de doctorat: SFRH I BD I 3924 / 2000) par la Fondation pour la Science et la Technologie (FCT : Fundaçâo para a Ciência e a Tecnologia, appartenant au ministère de la Science et de l'Enseignement Supérieur portugais) et par le Fond Social Européen (FSE), dans la cadre du IIIiè'" plan communautaire d'appui financier.
De plus, ce travail a fait I'objet de trois articles scientifiques dont deux ont été publiés en 2004.
Avant-Propos - 3 -
Partie I. Analyse Bibliographique ...15
I. A. Les æstrogènes mimétiques ...17
I . A . - l . L e s æ s t r o g è n e s . . . . . . 1 9 I. A. - 2.1-ns molécules d'origine industrielle ...33
I. B. Les Effets ...54
I. B. - L Effets surl'espèce humaine ...54
L B. - 2. Effets sur les espèces piscicoles ...57
I. C. La vitellogénine : Biomarqueur d'exposition... ...72
I . C . - 1 . L a v i t e l l o g é n i n e . . . . . . 7 3 L C. - 2. Biomarqueur des æstrogènes mimétiques ...78
L D. Détection de la production anormale de VTG... ...84
I . D . - 1 . D o s a g e s i n d i r e c t s . . . 8 4 L D. - 2. Dosages directs ...84
I. E. Le test d'agglutination à billes de latex (ou LAT pour Latex Agglutination Test)...96
I . E . - l . H i s t o r i q u e . . . . . 9 6 I. E. - 2. Principe des tests d'agglutination à billes de latex . . .... ... .97
I. E. - 3. Facteurs influençant I'adsorption des anticorps... ...100
I.E. - 4. Etude de I'adsorption des anticorps sur la surface des billes de latex à I'aide de modèles mathématiques... ...102
I. E. - 5. Immunoagglutination... ...107
Partie II. Matériels et Méthodes... ...113
IL A. Purification de la vitellogénine... ...115
IL A. - 1. Induction de la synthèse de VTG de carpe (Cyprinus carpio)...115
II. A. - 2. Première méthode de purification... ...116
II. A. - 3. Deuxième méthode de purification... ...117
II. A. - 4. Etudes électrophorétiques... ...118
IL B. Production des anticorps monoclonaux spécifiques de la vitellogénine... ...122
II. B. - 1. Immunisation des souris ...I22 II. B. - 2. Culture cellulaire.... ...122
I I . B . - 3 . F u s i o n . . . 1 2 4 tr. B. - 4. Sélection des hybridomes producteurs d'anticorps spécifiques de la vitellogénine.J26 I I . B . - 5 . C l o n a g e . . . . 1 2 7 II. B. - 6. Production des anticorps monoclonaux... ...130
II. C. Sélection des anticorps monoclonaux multi-espèces... ...135
I I . C . - 1 . L e s p o i s s o n s . . . . . . 1 3 5 I I . C . - 2 . E t u d e s h i s t o l o g i q u e s . . . . . . 1 3 5 il. C. - 3. Etude de I'affinité des anticorps monoclonaux... ...136
II. D. Développement du test d'agglutination ... ....138
II. D. - 1. Protocole d'adsorption des anticorps monoclonaux... ...138
II. D. - 2. Etude du pH d'adsorption ...140
II. D. - 3. Etude de la cinétique d'adsorption des Acms retenus pour leur spécificité vis-à-vis d e la V T G . . . t 4 1 II. D. - 4. Etude de I'immunoréactivité ...144
- 4 - Table des Matières
Partie III. Résultats et Discussion... ...147
III. A. Purification de la vitellogénine de carpe ...149
IIL A. - 1. Induction de la synthèse de vitellogénine... ...149
III. A. - 2. Méthode de purification... ... 155
III. A. - 3. Deuxième méthode de purification... ...162
III. B. Production des anticorps monoclonaux spécifiques de la vitellogénine ...167
IIL B. - l. Production des Acms anti- VTG de carpe ...167
III. B. - 2. Sélection des Acms anti-VTGs multi-espèces... ...172
m. C. Développement d'un test d'agglutination... ....179
III. C. - 1. Développement avec des billes de 2 pm ... ... 180
m. C. - 2. Essai préliminaire avec des billes de I pm... ... 189
ru. C. - 3. Optimisation du test avec les billes de 1 pm ... 195
il. C. - 4. Essai sur le terrain ...213 Conclusions et Perspectives...
Références Bibliographiques...
Annexes....
217 225 2s3
Table des Matières - 5 -
DiBP DiPP DMP
Abrévintions
Ac : Anticorps
Acp : Anticorps polyclonaux Acm : Anticorps monoclonaux Ag : Antigène
ApnEO : Alkylphénol polyéthoxylate BBP : Butylbenzylphtalate
BCF : Facteur de bioconcentration
BCIP : 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate B i o A : B i o c h a n i n e A
BPA : Bisphénol A
BSA : Bovin serum albumin DBP: Dibutylphtalate
DDE : Dichlorodiphényldichloroéthane DDT : Dichlorodiphényltrichloroéthane DEHP : Diéthylhexylphtalate
DEP: Diéthylphtalate DES : Diéthylstilbestrol
Diad: DiadzéïneDi-iso-butylphtalate Di-iso-propylphtalate Diméthylphtalate DPP Dipropylphtalate El : (Estrone
E2 : (Estradiol E3 : (Estriol
EE2 : Ethinylæstradiol
ELISA : Enzyme linked immunoassay ERE : Elément de réponse aux æstrogènes Form: Formonométine
FSH : Follicule stimulating hormone GEN: Génistéïne
GH : Growth Hormone
GnRH : Gonadotropin releasing hormone GtH I : Gondatophin hormone
HAZ : Hypoxanthine, Azaserine
HAT : Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine HCH : Hexachlorocyclohexane
HPLC : High performance liquid HSP: Heat shock protein Ig: Immunoglobuline LAT : Latex agglutination test LC : Liquid chromatography
L-glu : L-glutamine
MS : Mass spectrophotometry n.d. : non détecté
4-NP: Nonylphénol
NPnEO : Nonylphénol polyéthoxylate NTB : Nitrobluetetrazolium
(EM : (Estrogène mimétique 4-OP : Octylphénol
OPnEO : Octylphénol polyéthoxylate PAE: Phtalates
PAGE : Polyacrylamide gel electrophoresis PBS : Phosphate buffer salin
PCB : Polychlorobiphényl
PCDD : Polychlorodibenzodioxine PCDF : Polychlorodibenzofuranne PCN : Polychloronapthalène PCQ : Polychloroquaterphényle PEG : Polyéthylène glycol
PM : Poids moléculaire
PVDF : Polyvinylidène difluoride RE : Récepteur des æstrogènes RIA : Radioimmunoassay
RPMI 1640 : Roosevelet park memorial institute 1640
SBSE : Stir bar sorptive extraction SDS : Sodium dodécyl sulfate Seq : Séquence
SPE : Solid phase extraction STEP: Station d'épuration SSA : Acide sulfosalicylique SVF: Serum de veau foetal TBS : Tris buffer salin
TTBS : Tris buffer salin + Tween 20 TCB : Trichlorobiphényle
TCDD : Tétrachlorodibenzodioxine TDE : Trichlorodiphényldichloroéthane
TEMED : N,N,N,N'-Tetramethylethylenediamine TPBS : Phosphate buffer salin + Tween 20
VTG: Vitellogénine ZON: Zéaralénone
- 6 - Abréviations
Listes des poissons
Nom français Anguille vivipare Anguille
Barbeau Bar rayé Bar de mer Brème Brochet Carpe Carassin Carrelet Chevesne Choquemort Flet
Gag Gardon Gobie
Grenadier de Roche Guppy
Hoplostete rouge Hotu
Limande Mafou Médaka Merlan
Omble de I'arctique Petote
Perche Plie
Poisson plat
Poisson tête de boule Poisson zèbre Rotengle
Saumon atlantique Sole anglaise Tacaud Tilapia
Truite arc-en-ciel Truite commune Vairon
Vandoise
Nom anglais Eelpout Eel Barbel Striped bass Sea bass Bream Pike Carp
Crucian carp Wild flounder Chub
Mummichog Flounder Gag Roach Goby
Roundnose grenadier Guppy
Orange roughy Common nose Dab
Cobia Médaka Whiting Artic char
Sheepshead minnow Perch
Plaice Platfish
Fathead minnow Zebrafish Rudd
Atlantic salmon English sole Bib / Pout Tilapia Rainbow trout Brown trout Minnow Dace
Nom latin
Tnarces viviparus Anguilla anguilla Barbus barbus Genus morone Dicentrarchus labrax Abramis brama Esox lucius Cyprinus carpio Carassius carassius Pleuronecte s y okohamae Leusiscus cephalus Fundulus heteroclitus Platichthys flexus
Myc teroperc a microlepis Rutilus rutilus
Ac antho gobius flav imanus Coryphaenoide s rupe stris Poecilia reticulata
Hoplo stethus atlanticus Chondrostoma nasus Limanda limanda
Rac hy c e nt r on p ondi c uranum Oryzias latipes
Merlangius merlangus Salvelinus alpinus Cyprinodon variegatus Perca fluviatilis
Hipo glo s soïde plate s soide Xyphophorus mnculus Pimephales promelas Danio rerio
S c ardinius e ryt hrophtalmus Salmo salar
Pleuronectes vetulus Trisopterus luscus
Sarotherodon me lanotheron Oncorhynchus mykiss Salmo trutta
Phoxinus phoxinus Leusiscus leusiscus
Liste des poissons - 7 -
- 8 - lntroduction
Introduction
Introduction - 9 -
- 10- Introduction
Introduction
Certains polluants, qualifiés d'æstrogènes mimétiques ((EMs), sont rejetés dans les écosystèmes aquatiques par les stations d'épuration traitant des effluents domestiques, industriels, etlou agricoles. En effet, les traitements d'épuration traditionnels ne permettent pas d'éliminer totalement ces polluants. Ces toxiques s'accumulent alors dans I'eau, dans les sédiments et finalement dans les poissons où ils induisent des pathologies. Les poissons sont les bioindicateurs les plus utilisés pour diagnostiquer ce type de pollution. Dans ce cas, le biomarqueur détecté est la synthèse anormale de vitellogénine (VTG) par les poissons mâles ou les jeunes immatures.
Le but de ce travail est de développer un test d'agglutination pour la détection in situ de la VTG. Le fonctionnement de ce type de test est basé sur l'interaction immunologique entre un anticorps (Acs), fixé sur des billes de latex, et I'antigène (la vitellogénine).
Dans le cadre de cette démarche, pour induire la production d'anticorps monoclonaux spécifiques de la VTG il est nécessaire, au préalable, de développer une nouvelle méthode de purification non dénaturante de cette protéine, permettant d'obtenir une solution pure et suffi samment concentrée.
De plus, dans I'objectif d'élargir l'utilisation de ce test à différentes espèces de poissons, une étude de la conservation phylogénétique des différentes molécules de VTG a êté Éalisée.
Cette étude doit aboutir à la sélection d'un anticorps monoclonal reconnaissant un grand nombre de ces différentes molécules de VTG.
Enfin, il est intéressant de déterminer si la carpe, comme d'autres espèces, produit plusieurs molécules de VTG, et dans ce cas, si ces deux molécules sont synthétisées dans les mêmes conditions ou bien si leur production caractérise un état physiologique.
L'analyse bibliographique (Partie I) présente une liste non exhaustive des (EMs les plus connus (sources et devenir dans I'environnement) ; leurs effets sur I'espèce humaine et sur les poissons ; les différentes méthodes existantes de dosage de la VTG; et enfin, l'intérêt et les étapes de développement d'un test d'agglutination pour détecter sa production anormale, in situ.
Introduction 1 1 -
Les résultats obtenus et leur discussion (Partie 3) s'articulent, au terme d'une présentation du matériel et des méthodes utilisées (Partie 2), selon 4 axes :
a la purification de la vitellogénine de carpe Cyprinus carpio,
r l'obtention et la production d'anticorps monoclonaux spécifiques d'un épitope commun à la vitellogénine de plusieurs espèces de poissons,
o le développement d'un test d'agglutination spécifique, rapide, simple d'utilisation, pour pouvoir être utilisé directement sur le terrain,
. l'application sur le terrain en utilisant les anticorps monoclonaux produits.
Les conclusions présentent la complexité du développement d'un test d'agglutination, et l'intérêt, de ce type de test, dans la compréhension des processus contrôlant la synthèse de la VTG.
- t2- Introduction
Introduction - 1 3 -
- t4- Panie I. Analyse Bibliographique
Partie I.
Analy s e Biblio graphique
- 1 5 -
Partie I. Analyse Bibliographique
- 1 6 - Partie I. Analyse Bibliographique
I. A. Les æstrogènes mimétiques
A I'heure actuelle, les écosystèmes aquatiques sont contaminés par différents types de molécules, naturelles ou anthropiques, responsables de transformations parfois irréversibles de la morphologie ou de la physiologie des organismes, qui vivent dans les milieux aquatiques ou en dépendent. Parmi ces molécules, certaines possèdent la capacité de mimer les effets des æstrogènes. Cette nouvelle famille de polluants, appelée æstrogènes mimétiques (GMs), regroupe un large éventail de substances d'origines et d'utilisations très diverses tels que des produits industriels, phamaceutiques, phytosanitaires mais également des composés naturels produits par I'Homme, les animaux, les végétaux et les champignons.
Ces substances sont chimiquement très différentes (Figure 1 et Annexe 1). En effet, alors que tous les composés d'origine biotique et leurs dérivés sont des stéroïdes apparentés aux æstrogènes, certains produits de synthèse sont également considérés comme des (EMs : les polychlorobiphényles (PCBs) et leurs métabolites hydroxylés (les dioxines tels que les PCDDs et PCDFs), les alkylphénols, les phtalates, le bisphénol A (composé aromatique), mais également certains pesticides organochlorés (DDT et ses métabolites, endosulfane, toxaphène, HCH et la dieldrine) ainsi que des fongicides (comme la vinclozoline).
Partie I. Analyse Bibliographique t 7
æstrone (El)
17 a-êthinylæ stradiol (EE2)
GSTROGENES DE SYNTHESE
4/\y/O-rcH2- CH2-O-),H t l l
R.\./
Alkylphénols polyéthoxylates
I7 ftæstradiol (E2)
GSTROGENES HUMAINS ET AMMAUX
génistéïne (GEN)
PHYT(ESTROGENES
o tl
^./t-o-cnr{:n*r
i l l
\4.-o-c"r{:*, o
Phtalates (PAEs)
æstriol (E3)
O H
""""dÔï1"
zéaralénone (ZON)
MYC(ESTROGENES
Bisphénol A (BPA)
,".oer!ïO"."
PCBs Endosulfan (ES)
SI.IBSTANCES INDUSTRIELLES
Figure 1 : Exemples de différentes structures chimiques des æstrogènes mimétiques (une présentation exhaustive de ces molécules est répertoriée dans l'annexe 1).
- 1 8 - Partie I. Analyse Bibliographique
I. A. - 1. Les æstrogènes
I. A. - 1. 1. Les æstrogènes d'origine animale ou humaine
I. A. - 1. L l. Rôles
Dans le règne animal, l'æstrone (El), le 17 -æstradiol (E2) et l'æstriol (83) sont des hormones stéroïdiennes secrétées, respectivement, par le cortex adrenal, les ovaires et le placenta. Ces trois æstrogènes sont majoritairement des hormones femelles indispensables au développement et au fonctionnement de leurs organes reproducteurs, ainsi qu'à la mise en place des caractères sexuels secondaires (seins...) (Vander et al., 1995).
Les æstrogènes naturels peuvent être classés dans la catégorie des (EMs car ils représentent une source exogène d'hormones pour le biotope.
I. A. - 1. 1.2. Sources de pollution
Source animale
Les élevages intensifs d'animaux domestiques (ovins, bovins, porcins ou volailles) constituent la source d'æstrogènes animaux la plus importante. Dans le cas des bovins, le taux urinaire de E2 a été estimé à 13 ngll (Erbe et al., 1997, Ying et a1.,2002). Concernant les volailles, sa concentration dans les fumiers a été évaluée entre 14 et 533 ng/g de matière sèche (Shemesh et Shore, 1994, Shore et al., 1995, Shore et al., 1998, Ying et aL,2002). Les fumiers issus de ces différents élevages sont, pour la majorité, épandus. La lixiviation des sols peut alors entraîner ces hormones dans les eaux de surface ou souterraine qu'elles polluent comme I'ont montré Shore et al. (1995) ainsi que Peterson et al. (2001). D'après ces études une concentration constante de E2 de 5 ng a été mesurée dans certaines eaux souterraines américaines, au printemps (Shore et aI., 1995, Peterson e/ aI., 200I, Ying et al., 2002). Une partie de cette pollution peut également être conduite vers les stations d'épurations (STEPs) (Centner, 2004).
Partie I. Analyse Bibliographique - 1 9 -
Source humaine
Les hormones stéroïdiennes (Fl, E2 et E3), sont aussi excrétées par l'Homme. Les quantités journalières d'hormones stéroïdiennes, excrétées dans les urines. varient entre 1 et 8 ngll en fonction du type d'hormone, de l'âge et du sexe du sujet. Il reste, de plus, particulièrement élevé chez la femme enceinte (259 à 6000 ngll en fonction de l'hormone) (Tableau l).
Tableau I : Estimation de la quantité d'hormones stéroTdiennes (en pg/l) éliminée par voie urinaire chez I'espèce humaine (Johnson et a\.,2000).
(Estrone (Estradiol (Estriol Femmes menstrualisées (15 à 59 ans
Femmes ménopausées (> 59 ans)
8 3,5 4,8
) 1
Femmes enceintes (derniers mois)
600 259 6000
Hommes 3,9
A partir de ces estimations, il a été possible de modéliser la quantité d'hormones urinaires d'origine humaine arrivant en station d'épuration (Johnson et a1.,2000). Cette modélisation a aboutit aux trois relations suivantes :
r [El] en ngll =P / lI4,3F, r [E2] en ng/l =P /262,8F, e [E3] en ng/l =P 123,64F,
où P est le nombre d'habitants desservis par la station d'épuration et F est le débit entrant des effluents bruts en litres par jour (Vjour).
En comparant les résultats prédictifs obtenus avec ces trois relations et les concentrations mesurées dans différents effluents bruts domestiques (en terme de P et de F), il a été démontré que, dans la majorité des cas, les concentrations mesurées sont similaires aux taux prédictifs (Ternes et a1.,I999b, Johnson et a1.,2000. Cargouët et a1.,2004, Laganà et al.,2004,Lee et aI., 2004). Cette concordance entre la modélisation et la mesure montre que les æstrogènes arrivant dans les STEPs sont majoritairement d'origine humaine et résultent de leur élimination par les urines. On peut aussi noter que les quantités excrétées viales selles sont très faibles par rapport à celles éliminées dans les urines (Johnson et al.,2000\.
1 , 5 1 , 6
- 2 0 - Partie I. Analyse Bibliographique
Les résultats prédictifs peuvent aussi parfois surestimer Ia réalité: un pourcentage non négligeable de stéroïdes peut en effet, être adsorbé sur des particules en suspension (jusqu'à 2O 7o) qui sont éliminées par une étape de filtration préliminaire (Johnson et al., 2000) ; une autre proportion des æstrogènes présents dans les effluents bruts resterait sous une forme conjuguée (Tilton et aI., 2002), contrairement à ce qui a été avancé par Belfroid et al.(I999), Larsson et aL (1999) et Ternes et aI. (I999a) selon lesquels la totalité de ces molécules sont déconjuguées lors de leur transport dans les égouts vers les STEPs. Une partie de ces oestrogènes pourrait également être métabolisée lors de ce même transport, comme l'E2 qui peut être oxydé en El (Laganà et a1.,2004) et I'E3 qui s'oxyde enE2 puis en El. Ceci pourrait expliquer que dans certains effluents, ces deux hormones ne soient pas détectées (Johnson et a1.,2000).
En dernier lieu, certaines stations d'épuration traitent à la fois des effluents bruts d'origines domestiques et industrielles (Harries et aL, 1999, Cargoaët et a1.,2004, Pawlowski e/
aI., 2004a). Belfroid et al. (1999) montrent que les effluents bruts industriels peuvent également contenir des cestrogènes (El : <0,1-11 ngll;82 : <0.4-I,8 ng/l et E3 : <0,4-1,8).
I. A. - I. I. 3. Epuration des eaux usées
Dans les stations d'épuration, ces cestrogènes peuvent être métabolisés, avec un rendement qui peut varier entre 45 Vo eT 98 Vo pour I'E I , entre 33 7o et 99,9 %o pour l'E2 et entre 4O 7o et97 Vo pour I'E3 (Tableau 2, Annexe2,3 et4) (Ternes et al.,1999b, Johnson et al.,20OO, Cargouët et a1.,2004, Laganà et a1.,2004,1-ee et al.,2004).
Tableau 2: Niveaux de contamination en hormones stéroïdiennes (en ngll) de divers effluents bruts et traités de STEPs (84 STEPs) et eaux de surface (150 sites de prélèvements), entre 1996 et2002 (Routledge et aI.,1998, Belfroid et al.,1999, Larsson et al.,1999, Ternes et al.,1999b, Johnson et a1.,2000, Fawell et aL,2001, Kashiwada et a1.,2002, Todorov et a1.,2002. Williams et a\.,2003, Cargouët et a1.,2004, Hemming et a1.,2004. Laganà et al.,2004,Lee et a1.,2004, Pawlowski et al., 2004a).
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n.d. - 48 u n.d. - 64 u3 3 - 9 9 , 9 0 n . d . - 2 7 u
(Estriol n.d. - 120 u
n . d . - 2 8 u4 0 - > 9 7 0 n . d . - ) - valeur minimale détectée - valeur maximale détectée I o valeur minimale estimée - valeur maximale estimée
Partie I. Analyse Bibliographique - 2 1
Ce rendement d'épuration est variable, et peut être amélioré selon les processus d'épuration employés tels que l'utilisation de boues activées (Ternes et al., 1999b). Dans ce cas, le rendement augmente avec le temps de rétention hydraulique (c'est à dire le temps de passage dans la STEP et donc le temps de contact des effluents avec les boues activées) (Johnson et al., 2000). D'autres facteurs d'origine externe peuvent également influencer le rendement d'épuration de ces hormones, comme par exemple la température (qui favorise l'activité bactérienne et la dégradation chimique) et les précipitations (qui influent sur la durée de rétention hydraulique et sur I'adsorption organique) (Harries et al., 1999, Temes et al., I999a, Ternes et al.,1999b, Johnson et a1.,2000, Tilton et a1.,2002, Cargouët et a1.,2004, Hemming e/
aL.,2004, Laganà et aL.,2004, Pawlowski et a\.,2004a).
Dans tous les cas, les rendements d'élimination de ces hormones n'étant pas de I0O Vo, elles sont présentes dans les effluents traités où elles peuvent encore atteindre des concentrations de 76 ng/l pour l'EI, 64 ngfl pour l'82 et 28 ng pour l'E3 (Tableau 2 et Annexes 2, 3 et 4) (Routledge et al., 1998, Belfroid et al.,1999, Larsson et al.,1999, Ternes et al., 1999b, Johnson et a1.,2000, Kashiwada et aL.,2002, Todorov et a\.,2002, Williams et a\.,2003, Cargotët et al., 2004, Hemming et al.,2004,Laganà et al.,2004,Lee et a1.,2004, pawlowski et a1.,2004a).
I. A. - 1. 1.4. Situation dans I'environnement
Milieu naturel
Les effluents traités dans les STEPs sont déversés dans les fleuves, les rivières ou les estuaires. Cargouêt et al. (2004) ont observé que les concentrations en hormones (El, E2 etE3) présentes dans la Seine, en aval de 4 stations d'épuration (Evry, Valenton, Colombes et Achères) desservant Paris et ses environs, sont environ deux fois supérieures à celles mesurées en amont (Annexes 2,3 et 4). De plus, leur concentration ne descend pas en dessous de 1,1 ng/l (Cargouët et al., 2004).
Toutefois, en s'éloignant du point de rejet des STEPs, la dilution de I'effluent induit une diminution de la concentration en hormones. A cela s'ajoute I'adsorption de ces molécules sur les sédiments etlou sur les particules en suspension dans l'eau, ainsi que leur biodégradation bactérienne (Williams et aL,2003). Ces phénomènes expliquent que, dans certains cours d'eau et
- 2 2 - Partie I. Analyse Bibliographique
à certains moments de I'année, ces oestrogènes puissent être indétectables (Temes et al.,1999b, Kashiwada et aL..2002. Williams et aL..2003).
Eaux de consommatinn
Dans la région parisienne, les deux points de prélèvement d'eau de consommation sont situés à Vigneux (sur la Seine entre les stations d'épuration d'Evry et de Valenton) et à Méry-sur- Oise (sur l'Oise). Ils présentent des concentrations en hormones El, E2 etB3, respectivement, de I,4, 1,7 et2,2 ng/\, pour Vigneux et une concentration de 1,8 ngll pour les trois molécules à Méry- sur-Oise (Cargouët et a1.,2004). Ces concentrations sont plus élevées que celles mesurées dans des eaux de consommation provenant du sud de I'Allemagne où les concentrations sont plutôt de l'ordre de 0,4 (El),0,7 (82)et0,3 ng/l (E3) (Kuch et Ballschmiter, 2001).
Or, les eaux de consommation subissent un certain nombre de traitements de potabilisation dont une étape de désinfection au chlore. D'après une étude réalisée sur l'E2, un traitement avec 1,5 mg/l de chlore pendant 36 heures suffirait à éliminer 27 pg/r de cette hormone (I-ne et al., 2004). Une autre étude fait également état de l'élimination totale des trois stéroides naturels par les différents processus de potabilisation de I'eau utilisés régulièrement en Angleterre comme I'ozonation, la coagulation et le traitement au charbon actif (Webb et a1.,2003).
Par conséquent dans le cas de l'æstrone, du 17 -æstradiol et de l'æstriol, la contamination de I'Homme vial'eau de boisson semble limitée. Une contamination éventuelle par 1'alimentation des poissons contaminés par exemple, reste cependant envisageable.
Absorption par les poissons
Les hormones El, E2, et E3 dissoutes dans I'eau ou adsorbées sur les particules en suspension ou dans les sédiments, peuvent pénétrer dans I'organisme des poissons, via l'alimentation etlou la filtration de I'eau par les branchies. Les hormones peuvent alors s'accumuler dans les tissus avec un temps de persistance qui est fonction des espèces. Ainsi, des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) exposées à un effluentftaité contenant 5,8 ng/l de E1 et 1,1 ng/l de E2, élimineraient ces hormones seulement après 4 semaines d'exposition, une partie de ces hormones étant éliminée comme chez l'être humain, sous forme conjuguée
Partie I. Analyse Bibliographique - 23 -
(Larsson et al., 1999). La quantité accumulée et le temps de bioaccumulation de ces oestrogènes sont dépendants de la quantité de tissus adipeux. Par exemple, les larves de carrelets (Pleuronectes yokohamae) éliminent l'F;2 une heure après avoir été replacées dans une eau propre. Quant aux jeunes immatures, ceux-ci ne commencent à éliminer I'E2 qu'après 24 h d'épuration (Specker et Chandlee, 2003).
I. A. - 1.2. L'æstrogène de synthèse : l'éthinylæstradiol
I. A. - 1.2. 1. Rôles
Le I7 -éthinylæstradiol (EE2) est un déivé synthétique du 17 -cestradiol. Sa structure moléculaire a été élaboÉe pour la rendre plus stable de manière à augmenter sa demi-vie dans l'organisme humain (EE2 : 17 heures, E2: 20 min) (Lai et a1.,2002). Cette hormone synthétique est le composant majeur de plusieurs pilules contraceptives et de divers traitements hormonaux de substitution pour la ménopause (Johnson et al., 2000). D'autres hormones synthétiques, dérivés moins stables de l'F,E,2, sont également utilisés dans la fabrication d'autres pilules ou médicaments : le mestranol (ethinylæstradiol-3-methyl éther), la norethisterone, I'acétate de norethisterone, la progestine et la lynestrenol (Larsson et aI.,1999).
I. A, - 1. 2.2. Source de pollation
L'apport journalier enEE2 par la pilule contraceptive et les traitements hormonaux sont respectivement d'environ 35 trrg et 27 pg par femme. En moyenne 26 Vo de l'EE2 absorbé sont excrétés dans les urines (Johnson et a1.,2000), sous une forme conjuguée (Ternes et al.,1999a).
L'importance de la pollution par les hormones de synthèse varie d'un pays à I'autre, le pourcentage de femmes consommant des hormones de synthèse étant différent. Les quantités totales absorbées s'élèvent en Suisse à environ 3,5 mg/jour, parmi lesquelles 2,9 mgljour sont éliminées (Larsson et al., 1999). La consommation allemande s'élève à l37prgljour (Ternes et al., I999a) alors qu'en Angleterre, seulement 13 Vo de la population féminine prend la pilule et 3 Vo suit un traitement hormonal de substitution (Johnson et a\.,2000). En France, le pourcentage de femmes prenant la pilule est plus élevé avec 21,6 vo (cargouët et at.,2004).
- 2 4 - Partie I. Analyse Bibliographique
De même que pour les oestrogènes naturels, un modèle de prédiction des quantités urinaires arrivant en STEP a pu être établi :
IEF;ZI en ngll =P / 1428F
où P est le nombre d'habitants desservi par la STEPs et F, le flux d'effluent brut arrivant à la STEPs en Vjour. Ce modèle est calculé sur la base d'un taux moyen d'excrétion del'EB2 égal à 26 7o. I-es résultats obtenus avec ce modèle indiquent cependant qu'il sous-estime la réalitê (Johnson et a1.,2000, Williams et a1.,2003). Johnson et aL (2000) expliquent cette différence par une sous-estimation du pourcentage enEE2 réellement excrété qui peut être bien supérieur à 26 Vo paisqu'il peut atteindre une valeur maximale de 90 Vo (Johnson et a1.,2000). Par ailleurs, le modèle ne comptabilise pas les femmes utilisant des moyens de contraception ou des compléments hormonaux composés d'autres hormones de synthèses tels que le mestranol, la norethisterone, I'acétate de norethisterone, la progestine et la lynestrenol (Larsson et al., 1999).
Ces hormones sont rapidement métabolisées en EE2 soit avant d'être excrétées, soit au cours de leur transport dans les égouts. Elles seraient, de ce fait, responsable d'une partie du surplus de EE2 dêtectê dans les effluents bruts (Ternes et al.,1999a).
I. A. - l. 2. 3, Epuration d,es eaux usées
L'EEZ arrive au niveau des STEPs sous une forme déconjuguée lors de son transport avec les eaux usées (Ternes et al., I999a). Au Brésil, en Allemagne, en Italie et en France, la concentration enEE2 présente dans les effluents bruts étudiés varierait du non détectable (n.d.) à 10 ng/l (Tableau 3 et annexe 5) (Ternes et al.,1999b, Johnson et a1.,2000, Laganà et a1.,2004).
Tableau 3 : Concentration en EE2 (en ng/l) détectée dans divers effluents bruts et traités de STEPs (63 STEPs) et dans plusieurs eaux de surface (41 points de prélèvements), entre 1996 et 2002 (Routledge et aL, 1998, Belfroid et a1.,1999, Larsson et al., 1999, Ternes et al., 1999b, Johnson et a1.,2000, Fawell et al.,2O0l, Williams et a1.,2003, Cargouët et aL,2004, Hemming et a1.,2004, Laganà et a1.,2004, Pawlowski et al.,2O04a).
Composé Effluent brut Effluent traité 7o d'élimination Eau de surface
Ethinylæstradioln.d. - 500 u 34 - >ggb
n . d . - 4 , 3 u" valeur minimale détectée - valeur maximale détectée ; o valeur minimale estimée - valeur maximale estimée
Partie I. Analyse Bibliographique -25 -
L'absence de quantité de F,E2 détectable dans certains effluents bruts domestiques pourraient être due au faible nombre de femmes prenant la pilule dans I'aire desservi par la STEP (Laganà et a1.,2004) etlou à la dilution très rapide del'EE2 (Cargouët et aL,2004).
Les pourcentages de dégradation del'EE2 par les processus d'épuration varient de 34 Vo à plus de 98 7o. Par conséquent, comme pour les hormones naturelles, l'EE2 peut également être, en partie, éliminé par les processus d'épuration. Toutefois sa biodégradation par les microorganismes semble plus difficile. En effet, Ternes et al. (1999a) montrent que seulement 20 Vo de EE2 ont disparu après 24 heures passés en batch en contact avec des boues activées, alors que pourl'E2, plus de 95 %o des molécules disparaissent après I à 3 heures (Temes et al., 1999a). Un rendement de 98 7o, peat toutefois être atteint en augmentant les temps de rétention hydraulique à 26 heures et le temps de contact avec les boues à 20 jours (Johnson et al., 2000).
Cependant, dans la pratique, le temps passé, dans les STEPs, (temps de rétention hydraulique + temps de contact avec les boues) par les effluents bruts varie en moyenne enffe 2 et 10 heures ce qui conduit à un rendement d'épuration de 53 7o environ (Exemple des STEPs parisiennes) (Cargouët et aI., 2004).
D'après une autre étude, réalisée aux USA en 2000, des taux de 500 ng/l en EE2 ont été mesurés sur la période de mars-avril dans les effluents traités d'une STEP (Hemming et al., 2004). Mais ce niveau de pollution semble exceptionnel et serait lié à I'augmentation de la population féminine étudiante. En général, les valeurs retrouvées dans la majorité des effluents traités sont comprises entre non détectable (n.d.) et 42 nglml (Annexe 5) (Routled ge et al., 1998, Belfroid et al., 1999, Larsson et al., 1999, Ternes et aI., 1999b. Johnson et a1.,2000, Williams er a1.,2003, Cargouët et a1.,2004, Laganà et a1.,2004, pawlowski et a1.,2004a\.
I. A. - 1.2. 4. Situation dans I'environnement
Milieu naturel
Comme les hormones naturelles, I'EE} présent dans les effluents traités est une source de pollution locale au niveau du rejet des STEPs. Les résultats observés en France, le confirment puisque les quantités mesurées en aval des 4 stations d'épuration desservant la région parisienne, sont supérieures à celles mesurées en amont (Cargouët et a1.,2004). Les concentrations en EE2
- 2 6 - Partie I. Analyse Bibliographique
diminuent, ensuite, au fur et à mesure de l'éloignement du rejet, du fait de la dilution des rejets, des dégradations chimique et biologique, et de I'adsorption sur les sédiments.
La demi-vie physico-chimique del'EE2 dans les écosystèmes aquatiques est plus élevée que celle de I'El et del'82 (4 à 6jours et 2 à 3 jours, respectivement). De plus, le coefficient de répartition del'EE2 entre les sédiments et la colonne d'eau, est supérieur à celui des hormones naturelles. Selon les conditions de débit, il varie entre 34 et98 Vo, alors que pour I'El etl'82, il est compris, respectivement, entre 7-68 Vo et 12-78 7o (Williams et al., 1999). L'EE2 s'adsorbe donc plus facilement sur les sédiments, où il est plus stable (physico-chimiquement). Par conséquent, I'EEZ séjourne plus longtemps dans les eaux de surface (incluant les sédiments) que les hormones naturelles.
Eaux de consommation
L'EE2 peut également être retrouvé dans les sites de prélèvement d'eaux de boisson. Ainsi, dans la région parisienne, les deux sites de pompage de la Seine et de I'Oise, sont pollués par de I'F,82. Les concentrations retrouvées dans I'eau y sont équivalentes à celles des trois hormones naturelles (1,1 ng/l à Vigneux et 1,4 ngll à Méry-sur-Oise) (Cargoaët et a1.,2004).
L'espèce humaine pourrait donc être contaminée par de l'EE2 via l'eau de boisson.
Cependant d'après Webb et aI. (2003), les quantités absorbées, comprises entre <I et2 ng/jour, seraient négligeables par rapport à la production humaine endogène en stéroïdes, même chez les jeunes garçons pré-pubères dont la production minimale en cestradiol est de 6 pg/jour (Webb el aI., 2003). Comme pour les hormones naturelles, la pollution des eaux de surface par I'EE2 ne semble donc pas, pour l'instant, présenter de danger direct pour I'espèce humaine.
Absorption par les poissons
Par contre, la pollution des eaux de surface (eau et sédiment) par l'F,82, peut poser des problèmes via les espèces piscicoles. Tout d'abord , Lai et al. (2002) ont estimé que le facteur de bioaccumulation de I'EE2 chez les poissons varierait entre 170 et332, ce qui est plus de 10 fois supérieur aux facteurs de bioaccumulation des hormones naturelles (El : 3,6-30, E2: 5,8-61, E3: 1,8-13) (Lai et al., 2002). D'autre part, l'EE2 est très difficilement métabolisé par les
Partie I. Analyse Bibliographique -27 -
poissons comme le montre sa demi-vie qui est, en moyenne, de 3,54jours (Lai et a1.,2002).
Cette hormone devrait donc affecter les poissons sur de plus longues durées induisant un risque plus élevé de contamination de l'espèce humaine via la consommation de poissons par rapport à celui par les hormones naturelles.
I. A. - 1. 3. Les phytæstrogènes et les mycæstrogènes
I. A. - 1. 3. 1. Rôles
Les phytæstrogènes et les mycæstrogènes sont des composés stéroidiens, produits respectivement par les plantes et les champignons.
La famille des phytæstrogènes est constituée de quatre grands groupes de composés:
les lignanes (le secoisolariciresinol et le matairesinol), les coumestrans (le coumestrol), les phytostérols (le B-sitostérol) et les flavonoides. Ces demiers sont eux-mêmes composés de trois sous- groupes : les isoflavones (la diadzêîne et la génistéïne), les flavones (le kaempferol) et les flavonones (la naringenine). Ces substances sont présentes dans diverses graines de céréales (seigle, blé...), fruits (pamplemousse, orange...), légumes (carottes, épinards, choux-fleun, haricots, soja...), baies, noix et noisettes, etc. (Bennetau-Pelissero et al., 1998, Mazur et al., 1998, Safe et Gaido, 1998, Bennetau-Pelissero e/ a1.,2001, Hutabarat, 2001, Albertazzi et Purdie, 2002, Zhang et a1.,2002, Bennetau-Pelissero et a1.,2003, Grace et aL,2003, Ososki et Kennelly, 2003,Laganà et al.,2OO4).
læur fonction principale est d'agir coûrme anti-oxydants (Albertazzi et Purdie, 2002).
Quant aux mycæstrogènes, le plus connu estla zéaralénone. Ce composé est une toxine macrocyclique produite par de nombreuses espèces fongiques (Fusarium et Aspergillas) se développant sur les céréales (Ososki et Kennelly ,2003, Laganà et aL,2004).
I. A. - 1. 3.2. Sources de pollution
Alimentation humaine
Les deux sources alimentaires en phytæstrogènes, destinées à I'espèce humaine, sont les végétaux mais également les produits alimentaires enrichis en farines etlou en protéines de soja,
- 2 8 - Partie I. Analyse Bibliographique
comme certains desserts (yaourts, laits chocolatés, ou desserts à la vanille, etc), quelques fromages, sauces (de soja ou à la lécithine), ou encore certains laits en poudre pour bébé. La consommation des végétaux apporte principalement quatre phytæstrogènes : les deux isoflavones, la génistéïne et la diadzéïne, et les deux lignanes, le secoisolariciresinol et le matairesinol. Iæ coumestrol a également êté retroavé dans environ 50 Vo des légumes étudiés par l|dann et al. (1998), mais à des quantités beaucoup plus faibles. Quant à l'enrichissement des produits alimentaires en farines etlou protéines en de soja, il serait responsable d'un apport supplémentaire en génistéïne et en diadzéïne (Hutabarat,200l, Bennetau-Pelissero et al., 2003) et dans une moindre mesure en lignanes (Mazur et a1.,1998).
Les quantités ingérées par I'espèce humaine vont donc essentiellement dépendre du régime alimentaire des populations concernées. Au Japon, pays où la consommation en soja est la plus importante, I'apport en isoflavone varierait entre 50 et200 mg/jour (Albertazzi et Purdie, 2002).
En France, les quantités d'isoflavones consommées s'élèveraient à environ 100 mg/jour pour un adulte omnivore, et entre I5,7 et 34,3 mgljoar pour un bébé àgé de 4 mois. Ces isoflavones seraient, dans ce cas là, plutôt apportées par des aliments enrichis en farines etlou en protéines de soja (Bennetau-Pelissero et aI., 2003). Concernant les régimes végétariens, il semblerait, paradoxalement, qu'ils appoftent moins d'isoflavones (taux plasmatique de 89 ng/ml) qu'une alimentation omnivore (IM nglml) ou à base de soja (233 nglml). Par ailleurs, les régimes alimentaires, de type omnivore, lactovégétarien et macrobiotique sont également une source de lignanes ; des taux urinaires en lignanes s'élevant à 23,9 nmol/jour, 4,64 nmoVjour et 2,32 nmoUjour, ont été mesurés chez des femmes suivant, respectivement, ces trois types de régimes. Le taux très élevé en lignane du régime macrobiotique est lié à une alimentation plus riche en germes de soja, en haricots verts ou en choux de Bruxelles. (Mazur et a1.,1998).
D'autre part, de plus en plus de compléments alimentaires prescrits aux femmes ménopausées, contiennent des phytæstrogènes, comme la génistéïne et la diadzéïne, pour pallier à leur déficit hormonal. Ces aliments spécifiques apporteraient entre 2,4 et 98,2 mg/jour d' isoflavones (Bennetau-Pelissero et al., 2003).
Les isoflavones ingérées subissent alors plusieurs transformations. Les isoflavones inactivées (forme glycosilée pour la génistéïne etla diadzéïne) (Grace et a1.,2003), peuvent être activées par clivage du groupement glycosile (Albertazzi et Purdie, 2002). Dans le foie, elles
Partie I. Analyse Bibliographique -29 -
subissent une conjugaison avec des groupements B-glucuronides ou sulfates. Ces conjugués sont ensuite éliminés, via les urines. Quant aux deux lignanes (matairesinol et secoisolariciresinol) et au mycæstrogène (zéaralénone), leur métabolisation par la flore intestinale aboutit respectivement à la production d'entérolactone, d'entérodiol, et de a-zéaralénol et de B-zéarulénol. Ces substances sont par la suite également excrétées après conjugaison viales urines (Mazur et al., 1998, Albertazzi et Purdie, 2002, Laganà et al., 2004). Ces produits de métabolisation sont alors véhiculés jusqu'aux stations d'épuration pour être, théoriquement, dégradés.
Alimentation animale
L'alimentation traditionnelle des animaux d'élevage, est la première source de phytæstrogènes et de mycæstrogènes (Bennetau-Pelissero et a1.,2003). Dans quelques cas, leurs apports sont augmentés pour pallier à des carences ou pour bénéficier de certains avantages apportés par ces suppléments alimentaires. Par exemple, en pisciculture, le rendement de croissance des poissons est amélioré par une alimentation enrichie en protéines de soja (Bennetau-Pelissero et al.,1998, Latonnelle et a1.,2002b, Bennetau-Pelissero et a1.,2003). Dans les élevages de bovins, la zéaralénone a également longtemps été utilisée comme promoteur de croissance et réducteur de stress, ceci jusqu'à son interdiction par I'Union Européenne en 1985 (Laganà et a1.,2004).
Les mycæstrogènes et les phytæstrogènes ingérés par les animaux, sont par la suite éliminés de l'organisme via les urines. Ils passent alors dans les sols suite à l'épandage des fumiers puis, après lixiviation, dans les eaux de surface.
Sources industrielles
Une autre source de pollution par les hormones végétales et fongiques est industrielle. Il a, par exemple, été démontré que les effluents des usines de production des huiles végétales sont riches en phytostérols, comme le psitostérol (Dias et a1.,2002). Une autre étude réalisée par Jackson et aI. (2002), a également dévoilé qu'entre 4 et 3l Vo des isoflavones, utilisées dans la préparation de produits alimentaires à base de soja, sont également éliminés dans les effluents industriels. Ces isoflavones sont perdues au cours des différents processus de préparation
- 3 0 - Partie I. Analyse Bibliographique
(chauffage, broyage, etc.) (Jackson et aL,2002). L'étade de Dias et al. (2002), indique également que le psitostérol est présent dans les effluents d'autres industries non alimentaires comme les industries productrices de papiers et certaines industries pharmaceutiques (le B- sitostérol de soja peut être utilisé pour produire des cofticostéroïdes) (Dias et al.,2002).
Ces effluents industriels sont ensuite, comme les effluents domestiques, véhiculés jusqu'à des STEPS spécifiques ou des STEPS mixtes, c'est-à-dire traitant à la fois les deux types d'effluents (Pawlowski et al., 2004a).
I. A. - 1. 3. 3. Epuration des eaux usées
Les dosages réalisés sur des effluents bruts domestiques arrivant en STEPs, montrent la présence de phytæstrogènes et de myccestrogènes (Tableau 4, annexe 6) (Tilton et al., 2002, Laganà et a1.,2004). Les traitements subis en station d'épuration induisent une métabolisation des phytæstrogènes avec un rendement d'épuration qui varie environ entre 73 et 88 7o (Laganà et a1.,2004). Selon les auteurs de cette étude, les phytæstrogènes présents dans ces effluents, proviendraient des lavages des feuilles des végétaux au cours des phases d'irrigation ou de précipitations abondantes. Par ailleurs, d'autres études ont démontré qu'une partie des phytæstrogènes ingérés par I'homme étaient éliminés viales urines. Par exemple, en Angleterre, des doses en génistéïne, en diadzéïne, en entérolactone et en entérodiol variant de 0 à 784, de 0 à 1332, de 0 à 63640 et de 0 à 2850 nglml ont été mesurées sur un échantillon de 234 urines (Grace et aL.,2003).
Tableau 4 : Concentrations en phyto- et en mycæstrogènes (ngfl) présentes dans différents effluents bruts et traités de STEPs (3 STEPs) et dans diverses eaux de surface (2 points de prélèvements) (2001-2002) (Tilton et a1.,2002, Laganà et a1.,2004).
Composés Effluent brut Effluent traité 7o d'élimination Eau de surface P h y t æ s t r o g è n e 8 - 3 8 4 u 3 - 9 0 u 7 3 - 8 8 b 1 - < 5 0 u Mycæstrogène
n . d . - 1 8 u3 - 3 0 u 3 0 - 5 3 b n . d . - < 1 0 u
valeur minimale détectée - valeur maximale détectée ; o
valeur minimale estimée - valeur maximale estimée
Concernant la métabolisation des mycæstrogènes, elle semble difficile. En effet, un rendement de seulement 53 Vo peut être obtenu pour la zéaralénone et une rendement variant respectivement entre 30 et 38 Vo pour ses deux métabolites, l' -zéaralénol et le -zéaralénol,
Partie I. Analyse Bibliographique - 3 1
(Laganà et al., 2004). Pour les auteurs de cette étude, I'origine des mycæstrogènes dans les effluents bruts analysés, serait animale et proviendrait de leur utilisation en tant que promoteur de croissance (Laganà et a1.,2004) bien que ces mêmes auteurs précisent que leur utilisation a été interdite en Europe depuis 1985 et que les mesures présentées ont été réalisées en 2001 (Laganà et a1.,2004). Une autre étude, réalisée en Allemagne, fait également état de la présence d' -zéaralénol dans les effluents de deux STEPS, traitant à la fois des effluents industriels et domestiques, avec des concentrations comprises entre20 et 30 ng/l (Pawlowski et a\.,2004a).
I. A. - I. 3. 4. Situation dans l'environnement
Milieu naturel
Plus de 20 Vo environ des phytæstrogènes et des mycæstrogènes sont déversés dans les écosystèmes aquatiques, soit jusqu'à 83 ng/l de génistéine, 16 ngll de diadzéine, 90 ng/l de sitostérol, 10 ng/l de zéaralénone, 30 ngll de -zéaralénol et 5 ngll d' -zéaralénol (Annexe 5).
Dans les eaux de surface, leur concentration tend à diminuer (Laganà et al., 2004, Pawlowski e/
al., 2004a), sûrement du fait des phénomènes de dilution, de biodégradation, de dégradation physico-chimique ou d'adsorption sur les sédiments.
Absorption par les poissons
Depuis plusieurs années, le soja est utilisé en pisciculture comme complément alimentaire (Bennetau-Pelissero et al., 1998, Latonnelle et a1.,2002b, Bennetau-Pelissero er c/., 2003). A ce jour, aucune étude n'a montré que les phytæstrogènes, présents dans le soja, sont bioccumulés dans les tissus des animaux. Cependant, l'apparition de perturbations morphologiques chez des animaux consommant, régulièrement, des phytæstrogènes, laissent supposer qu'ils les bioaccumulent (Bennetau-Pelissero et al., 1998, Bennetau-Pelissero et al., 2001, Latonnelle et a1.,2002b, Bennetau-Pelissero et a1.,2003). En effet, le développement de ces anomalies implique que le toxique perdure dans I'organisme.
- 3 2 - Partie I. Analyse Bibliographique
I. A. - 2. Les molécules d'origine industrielle
I. A. - 2. 1. Les alkylphénols
I. A. - 2. 1. 1. Rôles
Les alkylphénols polyéthoxylates (ApnEOs) et leurs monomères, les alkylphénols (les nonylphénols et les octylphénols) sont des substances anthropiques, très largement utilisées, dans divers secteurs industriels, depuis plus de quarante ans, comme par exemple (Bennie, 1999, Heemken et aL.,2001):
o Les surfactants non-ioniques pour le prétraitement de la laine,
r Les agents mouillants et assouplissants dans la production de cuir et de papier, r Les agents nettoyants dans les industries du métal,
r Les agents émulsifiants pour les pesticides et les peintures, r Les agents dispersants de certaines pulvérisations,
o Les agents plastifiants dans la production de plastique en PVC (Polychlorure de vinyle).
Depuis les années 1980, leur utilisation n'a fait que s'accroître. En 1989, les productions canadienne et américaine avaient atteint, respectivement, un seuil annuel de 5500 tonnes de nonylphénols et de 180000 tonnes d'alkylphénols (Blackburn et Waldock, 1995, Maguire, 1999).
Quant à la consommation anglaise en nonylphénols, jusqu'en 1990, elle s'étalait entre 16000 et 19000 tonnes par an, parmi lesquelles 6500 tonnes auraient été déversées dans I'environnement aquatique (Bennie, 1999). En Allemagne, en 1995,la consommation en alkylphénols s'élevait à 20000 tonnes, dont 14000 tonnes étaient des nonylphénols, et les 6000 tonnes restantes étaient composées entre autre d'octylphénols et de butylphénols. Dans ce pays, la majorité de la production des nonylphénols (11500 tonnes) était utilisée pour produire des alkylphénols polyéthoxylates, avec I à 40 unités éthoxylate (Heemken et a1.,2001).
I. A. - 2. I. 2. Epuration des eaux usées
Pendant les processus de fabrication de différents produits industriels, les alkylphénols polyéthoxylates etlou les alkylphénols non utilisés sont éliminés dans les effluents bruts
Partie I. Analyse Bibliographique 3 3 -
industriels. Par ailleurs, une quantité non négligeable de ces mêmes composés serait éliminé dans les effluents domestiques. Ces derniers proviendraient de l'évacuation de plusieurs produits ménagers dans les égouts (Laganà et al., 2004). Ces deux types d'effluents seraient alors véhiculés par les eaux usées jusqu'aux STEPs pour être traités.
Les concentrations présentes dans les effluents bruts peuvent atteindre des taux de 320 ngll en 4-tert-octylphénol (4-OP) et 8768 ng/l en 4-nonylphénol (4-NP) (Blackburn et Waldock, 1995, Larsson et al., 1999, Kôrner et al., 2000, Bolz et al., 2001, Heemken et al., 2001, Inoue et a1.,2002, Kashiwada et aI.,2002,Todorov et a1.,2002, Hemming et a1.,2004, Laganà et al., 2004). Les taux d'épuration du 4-NP varient entre 40 et 85 7o (Kôrner et aI., 2000, Laganà et a1.,2004). Quant au 4-OP, son rendement d'épuration est au mieux de 13 7o, et, dans certains cas, les concentrations retrouvées après traitement peuvent être supérieures à celles des effluents bruts (Kôrner et a1.,2000) (Tableau 5, annexe 7).
Tableau 5 : Contamination par les alkylphénols (ngll) de différents effluents bruts et traités de STEPs (37 STEPs) et de diverses eaux de surface (155 points de prélèvements), entre 1994 et 2002 (Blackburn et Waldock, 1995, Larsson et al., 1999, Kôrner et a1.,2000, Bolz et a1.,2001, Heemken et al., 2001, Inoue et al., 2002, Kashiwada et al., 2002, Todorov et al.. 2002.
Hemming et a1.,2004, Laganà et a1.,2004).
Composés Effluent brut Effluent traité Vo d'élimination Eau de sur{ace
NPs < 3 0 - 1 8 0 0 0 0 "
4-NP 2t30- 8768 u 320 -22800^ 4 0 - 8 5 n.d. - 1466^
I N P n E O ( n = l à 2 ) 83100 -429000u 0,8 - 289 u
4-OP 180 - 320 u 280 -357 "
< 1 3 b n . d . - 1 8 9 uI O P n E O ( n = l à 2 )
0 . 4 - 8 4 ^
valeur minimale détectée - valeur maximale détectée; o valeur minimale estimée - valeur maximale estimée
Ceci peut être expliqué par la métabolisation bactérienne des alkylphénols polyéthoxylates présents dans les effluents bruts qui proviennent des industries métalliques, agro-alimentaires, pharmaceutiques et de production de résines plastiques, desservis par les STEPs concernées (Kôrner et a1.,2000). En effet, la métabolisation de ces molécules complexes entraîne la production d'alkylphénols (OPs etlou NPs) (Figure 2).
- 3 4 - Partie I. Analyse Bibliographique
l? = CsHrs: groupement nonylphenol R = CsIIro: groupement octylphenol
^na&oby./
(Y" - (cHz- cHz- o -):H
R^/
*9"-cIJz-
cIJz- o - cHz- cooH
AP2EO
I I
4 - ' ( o ' c H z - c H z - o H
t t l
À^//
APIEO
4 y O - ( C H : - C H r - O - ) n H
*\.JJ
n: grouPementéthoxYlate APnEO
I
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- (cHz- cHr- o -)n.r H
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AP(n-l)EO
AP2EC
* I
Oz-rao - CHz- CooH
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APlEC
A*é"\
(...o, y'naéronie
\ .\,J ''
AP
Figure 2 : Biodégradation des alkylphénols polyéthoxylates (APnEO) @ennie, 1999, Maguire,1999).
Les quantités importantes de 4-OP (ou de 4-NP) nouvellement formées peuvent alors masquer la biodégradation des OPs et des NPs présents dans les effluents bruts. Ceci pourrait expliquer que, dans les effluents traités de trois STEPs américaines, des molécules de nonylphénol mono- et diéthoxylates (NP2EO, NPIEO) sont également détectées à des concentrations cumulées comprises entre 83100 et429N0 nglml (Tableau 5, annexe 7) (Todorov et a1.,2002).
Quelques études font également état de I'accumulation des alkylphénols dans les boues activées (Kôrner et al., 2000, Bolz et al., 2001). Kôrner et al. (2000) ont ainsi mesuré une concentration en 4-NP égale à 30000 pg/kg de matière sèche. Par contre, dans l'étude deBolz et aI. (2001\, les concentrations en 4-NP détectées sont plus faibles et varient entre 2500 et 3700 pglkg de matière sèche. Ces alkylphénols lorsqu'ils sont épandus avec les boues, peuvent alors polluer les sols, puis les eaux souterraines et de surface.
Partie L Analyse Bibliographique 35
I. A. - 2. 1. 3. Situation dans l'environnement
Milieu naturel
La pollution des eaux de surface par les alkylphénols mono ou diéthoxylates et par les alkylphénols, est essentiellement due au déversement des effluents traités provenant des STEPs (Bolz et a\.,200I). Quand ces polluants se retrouvent dans I'eau, ils se partagent entre la colonne d'eau et les sédiments. Ainsi, dans les rivières anglaises Aire et Calder, il aété estimé que 30 à 4O Vo des octylphénols peuvent s'adsorber sur le sédiment en suspension (Johnson et al.,1998).
De même, dans plusieurs fleuves et rivières d'Allemagne, des concentrations en alkylphénols et alkylphénols mono ou diéthoxylates, adsorbées sur les sédiments, comprises respectivement entre 17-1378 pg/kg et 30-1797 pglkg de matière sèche ont été mesurées (Bolz et al., 2001, Heemken et a\.,200I).
Les concentrations solubles mesurées dans les fleuves et les rivières varieraient, entre non détectable (n.d.) et 1466 ng/l et n.d. et 189 nglI, pour le 4-NP et le 4-OP, respecrivement (Tableau 5, annexe 7). Mais d'après l'étude de Blackburn et aL (1995), ces quantités ne correspondent qu'à la partie immergée de I'iceberg. En effet, dans cette étude, des taux de 180000 ng/l en NPs, tous isomères confondus, solubles et adsorbés sur des particules en suspension, ont pu être mesurés (Blackburn et Waldock, 1995).
Ces pollutions de l'eau et des sédiments seraient responsables de la pollution de plusieurs estuaires. Ainsi, en Allemagne, I'estuaire du fleuve Elbe et une partie de la côte de la mer du Nord où se déverse ce fleuve, sont pollués par du 4-oP (16 ngll), du 4-NP (63 ngll), et des alkylphénols mono ou diéthoxylates (63 et 2I ngL). Sept estuaires anglais présentent également une pollution par des NPs (solubles ou adsorbés) avec des concentrations pouvant atteindre 320nglml (Blackburn et Waldock, 1995). Ceci est possible car la demi-vie des alkylphénols dans les écosystèmes aquatiques est très longue : environ l0 jours pour les octylphénols (Johnson et al.,1998).
- 3 6 - Partie I. Analyse Bibliographique
Eaux de consommation
Concernant les eaux de boisson, une étude effectuée sur 4 eaux minérales japonaises, a démontré la présence de 4-NP et de 4-OP dans trois d'entre-elles, à des concentrations moyennes de 40 ngfl et 50 ng/I, respectivement (Inoue et al., 2002). Or, d'après Lee et al. (2004), tn traitement au chlore, comme celui effectué pendant les processus de potabilisation de l'eau, suffirait à éliminer 220 Ttgl de 4-NP (Lee et aI., 2004). Les rivières japonaises contenant
1000 fois moins de 4-NP (Kashiwada et al., 2002), les eaux de boissons n'auraient, théoriquement, pas dû être contaminées. Ce paradoxe peut provoquer une certaine inquiétude vis-à-vis de pays tels que l'Angleterre, I'Allemagne et I'Italie, où les concentrations en 4-NP dans les eaux de surface peuvent être plus élevées que celles mesurées au Japon (Annexe 7) (Blackburn et Waldock , 1995 , Bolz et al. , 2001 , Laganà et aI., 2004).
Absorption par les poissons
Iæs alkylphénols présents dans les eaux de surface, sous forme soluble ou adsorbée sur les sédiments, peuvent être ingérés par les poissons. Une partie de ces toxiques va alors s'accumuler dans les tissus. Ainsi, des poissons exposés à 5,36 pg/l de 4-NP, pendant 28 à 3l jours, concentrent dans leurs tissus, environ 3,8 pg/g de cette molécule ce qui correspond à un facteur de bioconcentration (BCF) de 550 (Villeneuve et al., 2002). Cette concentration est supérieure à celle des hormones stéroïdiennes, El (3,6-30), 82, (5,8-6I) et E3 (1,8-13), et également à celle de l'hormone de synthèseEE2 (l7O-332) (Lai et aL.,2002).
Les alkylphénols s'accumulent principalement dans les muscles et le foie. Pedersen et al.
(2003) montrent ainsi que 0,33 mg et 0,14 mg de OPs peuvent se fixer respectivement dans les muscles et le foie de truites arc-en-ciel, considérant que les muscles représentent environ 67 Vo de la masse totale des animaux contre 3 7o pour le foie, le facteur de bioconcentration du foie semble supérieur à celui des muscles. Cependant, les quantités bioaccumulées sont très faibles par rapport aux quantités ingérées, à savoir 150 mg. Une grande propoftion des OPs ingérés est donc éliminée via les selles ou les urines. Ces toxiques peuvent alors être à nouveau libérés dans les eaux: 16 Vo de la quantité ingérée par les poissons a en effet été retrouvée dans I'eau (Pedersen et al., 2003).
Partie L Analyse Bibliographique - 3 7 -
I. A. - 2. 2. Le bisphénol A
I. A. - 2. 2. I. Sources de pollution
Sources industrielles
Le bisphénol A (BPA) est un composé aromatique bicyclique qui entre dans la production des polycarbonates, des résines époxy et résines polyester styrène. Ces polymères et ces résines sont utilisés dans la fabrication d'amalgames dentaires, de vernis pour le traitement de surface des boîtes de conserve et comme agents retardant des produits inflammables ou explosifs (Safe et Gaido, 1998, Lindholst et al., 2000, Laganà et aI., 2004). En 1993,la production annuelle mondiale en BPA, était de 640000 tonnes parmi lesquelles, environ 109 tonnes furent déversées dans I'environnement: 3,5 x l0-5 Vo dans I'air, 24Vo d,ansles sols et75 7o dans I'eau (43Vo dans la colonne d'eau et 32 Vo dans le sédiment) (Lindholst et al., 2000). Cette production ne cessa d'augmenter par la suite. En 1995, I'Allemagne produisait déjà à elle seule, 210000 tonnes et quant à l'union européenne, elle était responsable de 30 Vo de la production mondiale (Fromme et a1.,2002). La contamination de I'environnement se fait pendant les processus de fabrication industrielle, mais le BPA peut également être libéré par le produit fini (Fromme et a1.,2002).
Source hamaine
Le BPA présent dans les résines ou les amalgames utilisés en odontologie peut être libéré dans la salive. Il est alors absorbé au niveau des intestins et passe dans le sang. Après une étape de conjugaison avec I'acide glucuronique dans le foie, le BPA est, finalement, rejeté dans les urines à des concentrations comprises entre 220 à 450 pglml (Kawaguchi et al., 2004).
