Activités phosphatases bactériennes dans les nodosités de lignées de haricot contrastantes pour l’efficacité d’utilisation du phosphore pour la fixation symbiotique d’azote

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Activités phosphatases bactériennes dans les nodosités

de lignées de haricot contrastantes pour l’efficacité

d’utilisation du phosphore pour la fixation symbiotique

d’azote

Laurie Amenc

To cite this version:

Laurie Amenc. Activités phosphatases bactériennes dans les nodosités de lignées de haricot con-trastantes pour l’efficacité d’utilisation du phosphore pour la fixation symbiotique d’azote. Sciences agricoles. 2008. �hal-02822238�

Master Biologie, Géosciences, Agronomie, Environnement Spécialité : Biologie et Evolution des Plantes

Parcours : M2 Biologie Fonctionnelle des Plantes Année Universitaire 2007-2008

ACTIVITES PHOSPHATASES BACTERIENNE DANS LES

NODOSITES DE LIGNEES DE HARICOT CONTRASTANTES

EN EFFICACITE D’UTILISATION DU PHOSPHORE POUR LA

FIXATION SYMBIOTIQUE D’AZOTE

Laurie AMENC

UMR BSR, INRA Montpellier

Abréviations :

ACPs : phosphatases acides non spécifiques végétales APs : phosphatases alcalines non spécifiques végétales ADN : Acide

ADN : acide désoxyribonucléique

ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire ARN : acide ribonucléique

ARNm : ARN messager

BAP : phosphatases alcaline non spécifiques bactériennes CIAT : Centro Internacional de Agricultura Tropical DEPC : diethyl Pyrocarbonate

dNTP : désoxynucléotides

DsPTPs : Dual-specificity proteins tyrosine phosphatase EDTA : acide éthylène-diamine-tétra- acétique

FSN : Fixation symbiotique d’azote atmosphérique () NRT : transcription inverse sans transcriptase inverse NSAPs : phosphatases acides non spécifiques bactériennes P : phosphore

PAP : acide phosphatase pourpre

PPM : Protéines phosphatases métal dépendantes PPP : Protéine phosphatases spécifiques

PCR : Polymerase Chain Reaction réaction de polymérisation en chaine Pi : Phosphore inorganique ou minéral

PTKs : protéine tyrosine phosphatases kinases PTPs : protéines tyrosine phosphatases

RILs : Recombinant lines RT : transcription inverse

RT-PCR in situ : Reverse transcriptase - Polymerisation chain reaction sur tissus Ser/Thr : Serine/ Thréonine

Th : température d’hybridation Tm : température de melting

Abstract:

Phosphorus is an essential inorganic nutriment for all living organisms. It is a key substrate in energy metabolism in the plant cells and rhizobacteria. The symbiotic nitrogen fixation process requires phosphorus. Thus, inside nodules the bacteria require a large amount of Pi supposedly from organic P hydrolysed by phosphatases as enzymes catalysing the hydrolysis of ester link between inorganic P and various organic molecules. In this study, these proteins and the transcripts of one bacterial and one plant acid phosphatase genes and the transcripts of acid phosphatase gene were localised in nodule sections. The results show that acid phosphatases proteins are localized in inner cortex, distributed zone and infected cells around the inner cortex and infected zone. The bacterial transcripts are localized in vascular traces and infected cells. The plant transcripts are localized in vascular traces and the inner cortex. A model of the distribution of Pi from organic P within the nodule is proposed. Specifically, the expression of the acid phosphatase gene in the inner cortex suggests that this enzyme may be involved in the osmoregulation of nodule permeability to O2 and its consequence on the amount of N2-fixed through ATP-dependent nitrogenase activity. The bacterial acid phosphatase may contribute to the adaptation of the symbiosis to the deficiency of P. It is concluded that the in situ RT-PCR methodology can be applied to localise bacterial and plant transcripts in nodules, and too further explore whether other acid phosphatases are involved in the adaptation of the legume-rhizobia symbiosis to low P availability.

Sommaire :

Sommaire

I.A. Le phosphore et la fixation d’azote : ... 1

I.B. Les protéines phosphatases :... 3

I.C. Les phosphatases chez la bactérie: ... 4

I.D. Les phosphatases chez la plante: ... 6

II. RESULTATS:... 7

II.A. Localisation d’activités phosphatasiques sur coupes nodulaires :... 7

II.B. Localisation des transcrits bactériens sur coupes nodulaires par RT PCR in situ : . 8 II.C. Localisation de transcrits végétaux sur coupes nodulaires par RT PCR in situ :... 9

II.D. Vérification des séquences nucléotidiques visualisées en RT-PCR in situ :... 10

III. DISCUSSION: ... 11

IV. MATERIEL ET METHODES: ... 13

IV.A. Culture hydro-aéroponique de haricots: ... 13

IV.B. Préparation des sections de nodules: ... 14

IV.C. RT PCR in situ : ... 14

IV.D. Localisation des activités phosphatasiques :... 16

IV.E. Vérification des séquences amplifiées : ... 16

BIBLIOGRAPHIE :...I ANNEXES...I RESUME: ...P

I. Introduction :

Pendant la dernière décennie, l’intérêt des légumineuses à graines pour l’alimentation humaine a considérablement augmenté. Divers pays souhaitent augmenter leur autosuffisance en protéines végétales, et diversifier leurs systèmes de production céréalière en prenant en compte les contraintes écologiques apparues ces dernières années. Les légumineuses jouent un rôle important dans la sécurité alimentaire et la fertilité des sols, grâce en particulier à leur fixation symbiotique d’azote atmosphérique (FSN). Avec des taux annuels de 30 à 300 kg N fixés.ha-1 les légumineuses sont responsables d’environ 30% de l’azote atmosphérique fixé durant une année. Ce dernier, pour l’ensemble des écosystèmes terrestres, est estimé à près de 200 millions de tonnes par an, soit deux fois la production industrielle d’engrais azoté.

Cependant, le développement de la culture des légumineuses, en particulier en zones méditerranéennes et tropicales, est limité par une forte instabilité de leur rendement, ces cultures étant très sensibles aux contraintes biotiques et abiotiques. Parmi ces dernières la déficience des sols en phosphore (P) est un facteur limitant de la FSN. Les gisements mondiaux de P vont être épuisés durant le 21èmesiècle au rythme actuel de leur exploitation. Il devient important de choisir des cultures qui demandent peu d’apport de P durant l’itinéraire technique, et d’utiliser des variétés qui permettent de mieux gérer le P du sol.

L’objectif de ce travail est de déterminer si l’analyse de l’expression de gènes codant pour des phosphatases bactériennes et végétales sur des coupes nodulaires par la technique de Transcription Inverse couplée à la polymérisation en chaîne de l’ADN (RT PCR in situ), est influencée par les traitements P (P déficient versus P suffisant) et les génotypes de haricot (tolérant ou sensible à la déficience de P).

I.A. Le phosphore et la fixation d’azote :

Le P est un nutriment inorganique essentiel pour les être vivants. En effet, le P est un élément clef dans le métabolisme énergétique ainsi que dans la biosynthèse des acides nucléiques et des membranes. Il est requis pour l’activation de nombreuses enzymes. Après l’azote, le P est l’élément minéral ayant le plus d’impact sur la croissance des plantes et leur métabolisme. Seul le P inorganique soluble (Pi) est assimilable par les plantes. Or, dans les sols, le Pi ne se trouve qu’en concentrations très faibles (1 à 10 µmol.l-1). Cette concentration, 1000 fois inférieure à sa concentration dans les tissus végétaux (Schachtman et al., 1998), limite son prélèvement par les plantes. De plus, le Pi est peu mobile par diffusion (10-12 à

10-15 m3.s-1) dans le sol, ce qui crée autour des racines une zone qui est fortement appauvrie en Pi. Les plantes sont en compétition avec les microorganismes pour le Pi du sol.

Le P joue un rôle dans le métabolisme énergétique de toutes les cellules végétales et particulièrement celles liées à la FSN par des bactéries à l’intérieur de nodules qu’ils soient racinaires ou aériens, où est réalisée la majeure partie de la réduction de l’azote atmosphérique dans le cycle biogéochimique de cet élément. Il a été mis en évidence un lien entre la capacité à séquestrer le P de souches de Rhizobium trifolii et la compétition pour la nodulation. Le P a des effets importants sur la FSN (Robson, 1983), en particulier chez le haricot pour lequel Vadez et al. (1996 ; 1999) ont montré que la concentration en P dans les nodules est trois fois plus importante que celle des autres organes de la plante. L’accumulation du P dans les nodules est plus importante quand les plantes sont en conditions de P déficient qu’en conditions de P suffisant (Al-Niemi et al., 1998). Sous déficience en P, la concentration nodulaire en P est peu affectée alors que la matière sèche nodulaire est grandement réduite (Ribet et Drevon, 1995).

Le nombre de nodules et l’activité de la nitrogénase augmentent avec l’addition de P (Olivera et al., 2004). La disponibilité en P influence l’activité nitrogénase dépendante de la perméabilité nodulaire à l’oxygène (Ribet et Drevon, 1995). En se basant sur des expressions de gènes de nodules de plantes et l’analyses métabolique de nodules racinaires de Lotus

japonicus, Colebatch et al. suggèrent que les nodules racinaires sont en condition de P

déficient. Dans la symbiose rhizobienne, il convient de distinguer les phosphatases du microsymbiote (phosphatases bactériennes) et les phosphatases du macrosymbiote (phosphatases végétales).

Le P du sol se trouve majoritairement sous différentes formes (organiques et inorganiques), qui même si elles sont abondantes, ne sont pas utilisables par les plantes. La quantité de Pi dans la solution du sol est principalement régulée par ses interactions avec les surfaces organiques et inorganiques du sol. Ainsi 20 à 80 % du P du sol est complexé sous forme de composés organiques (Richardson, 1994). La mobilisation du P organique du sol est réalisée par des phosphatases excrétées par les racines ou les microorganismes. Ces enzymes permettent de solubiliser du Pi à partir de différentes formes de composés organiques. Une partie des microorganismes du sol solubilisateurs de Pi sont des bactéries fixatrices d’azote (Rhizobium, Bradirhizobium, Burkholderia…) (Rodriguez et Fraga, 1999 ; Dakota et Philips, 2002). La forme organique majoritaire du P du sol est l’acide phytique ou phytate (inositol

Figure 1: Le phosphore et la plante. Mécanismes de solubilisation du Pi à partir du P immobilisé sur les

particules de sol. Les plantes réalisent des associations symbiotiques avec des champignons (mycorhizes) et des bactéries (nodules). Elles développent un système racinaire plus important avec une augmentation du nombre et de la longueur de ses poils absorbants, de l’excrétion de composés organiques (acides organiques ; enzymes) et de protons. D’après Schachtman et al , 1998.

hexaphosphate). Un mécanisme universel de réponse à la carence en Pi chez les plantes supérieures (Raghothama, 1999) est l’augmentation de la production de phosphatases extracellulaires et intracellulaires (néo-synthèse). Certaines espèces de plantes excrètent des phytases (Li et al., 1997) mais la plupart des plantes sont vraiment limitées dans leur capacité à accéder au phytate dans la rhizosphère sauf en présence de microorganismes capables de déphosphoryler le phytate (Richardson et al., 2001, Goldstein et al., 1999).(Figure 1)

En réponse à de faible disponibilité de Pi dans la rhizosphère, les plantes ont développé des adaptations physiologiques (mobilisation du Pi de la vacuole vers le cytoplasme), morphologiques (augmentation des poils absorbants). Dans des conditions de déficience en Pi, 90 % du Pi total est prélevé par l’intermédiaire des poils absorbants. Des expérimentations de localisation in situ des transcrits ont montré que les gènes de transporteurs de Pi sont exprimés préférentiellement sur l’épiderme et dans les poils absorbants de la tomate. Les génotypes de haricots tolérants à la carence en Pi ont une architecture racinaire plus ramifiée avec une croissance plus importante par rapport aux génotypes sensibles à la déficience en Pi (Lambers

et al., 2006). Les plantes ont aussi développé des mécanismes biochimiques tels que

l’excrétion de protons et/ou d’acides organiques, l’activation de transporteurs de P, l’activation d’enzymes par l’augmentation de la production de phosphatases et l’activation de gènes codant pour des phosphatases pour mobiliser, absorber et utiliser le Pi de l’environnement (Figure 1). L’exsudation de protons et de composés organiques acidifie le sol autour des racines et permet de mobiliser du Pi à partir des formes complexées.

Des sélections variétales de Phaseolus vulgaris menées sur le caractère « tolérance à la déficience en P » ont permis d’identifier des lignées contrastantes dans l’utilisation du P (Vadez et al., 1996). La lignée 115, tolérante à la déficience en P, et la lignée 147, sensible à la déficience en P ont été choisies dans cette étude. La méthode de RT-PCR in situ sur coupe nodulaire a été utilisée pour localiser l’expression de gènes de phosphatases bactériennes et végétales et analyser leur relation avec l’efficacité d’utilisation du P pour la FSN.

I.B. Les protéines phosphatases :

Les protéines phosphatases sont des phosphatases capables de déphosphoryler un acide aminé d’une protéine. La phosphorylation et la déphosphorylation d’une protéine permettent de réguler son niveau d’activité et l’interaction de celle-ci avec ses partenaires. La diversité des réactions possibles dans la cellule est visible dans le nombre de protéines intracellulaires

Figure 2 : Classification des Protéines Phosphatases selon leur spécificité de substrat. Les Ser/Thr phosphatases

contiennent la famille des phosphoprotéines phosphatases (PPP) et la famille des ions métal dépendantes (PPM souvent appelé PP2C). Le groupe des PPP contient les sous-familles des PP1 (connues sous le nom de TOPP chez les plantes), des PP2A, PP2B et une nouvelle classe de phosphatases. Les PP2B ne sont pas présentes chez les plantes (Luan et al., 2003). La famille des phosphotyrosine phosphatases (PTP) contient des phosphatases de faible poids moléculaire (LMW) et d’autres protéines qui sont ou non des récepteurs. La famille des phosphatases à double spécificité (dual specificity phosphatases - DSPs) régulent la déphosphorylation des sérines, thréonine et tyrosine. (From Farkas et al., 2007).

qui sont susceptibles d’être réversiblement phosphorylées, grâce à la quantité de protéines kinases et phosphatases qui catalysent ces réactions cellulaires. L’interaction avec des protéines régulatrices est le mécanisme commun pour la régulation des protéines phosphatases.

Les protéines capables de réaliser le transfert d’un groupement phosphate peuvent être classées selon divers critères. Si l’on se place du point de vue enzymatique, on a 2 groupes : les phosphotransférases et les hydrolases. Les phosphotransférases, appelée aussi kinases ou phosphorylases réalisent la fixation d'un groupe phosphate à une molécule ce qui permet son activation et sa reconnaissance comme substrat (par exemple dans les réactions du métabolisme glucidique). Les hydrolases libèrent le groupement phosphorique des fonctions éthers, acétals et esters phosphoriques, ainsi que des liaisons O-O des peroxydes, des liaisons C-N des amides. Ces enzymes sans coenzymes ont un rôle inverse de celui des kinases. On distingue les hydrolases spécifiques des esters phosphoriques d’oses, comme la glucose-6-phosphatase, des hydrolases spécifiques d’autres esters ou anhydrides phosphoriques. Ces dernières regroupent les Protéines Phosphatases Spécifiques (PPP) et les Protéines Phosphatases non spécifiques qui portent des noms différents chez les bactéries et chez les végétaux, et qui comprend les phosphatases acides et les phosphatases alcalines (Deng et al., 2001 ; Jackson et Denu, 2001). Les PPP sont classées en deux groupes majeurs selon leur substrat spécifique : les sérine/thréonine phosphatases (Ser/Thr) et les tyrosines phosphatases qui sont communes à tous les organismes vivants (Figure 2).

Deux principales familles de Ser/Thr phosphatases ont été définies grâce à leur spécificité de substrats et leurs propriétés pharmacologiques (Farkas et al., 2007). La famille des PPP (Phospho-Protéines Phosphatases) contient les protéines PP1, PP2A et PP2B dont les séquences protéiques sont très proches. La famille des PPM (Phospho-protéines Phosphatases Métal dépendantes) contient les PP2C et d’autres Ser/Thr phosphatases. Toutes les PPM sont Mg2+ dépendantes car elles ont un ion métallique Mg2+ dans leur domaine catalytique. Les protéines phosphatases, comme beaucoup d’autres molécules signal, peuvent être inhibées ou activées par de petites molécules non protéiques présentes naturellement dans la cellule (Luan, 2003).

Les protéines Tyrosines Phosphatases (PTPs) sont caractérisées par leur sensibilité au vanadate, leur capacité à hydrolyser le p-nitrophenyl phosphate (pNPP), leur insensibilité à l’acide okadaïque et le fait qu’elles ne nécessitent pas d’ion métal pour la catalyse. Le niveau

Figure 3 : Classification des phosphatases acides non spécifiques (NSAPs) et des phosphatases alcalines (BAPs)

chez les bactéries. Le groupe A de NSAPs st représenté par 3 phosphatases acides dont les ATPases. Les groupes B et C de NSAPs appartiennent à la superfamille des DDDD. Le groupe C contient des lipoprotéines à activités phosphatases.

de tyrosine phosphorylé dans les cellules est déterminé par la balance entre l’activité de protéines tyrosine phosphatases kinases (PTKs) et celle des protéines tyrosine phosphatases (PTPs). Les protéines Tyrosine Phosphatases (PTPs) sont divisées en deux groupes selon les acides aminés qu’elles phosphorylent : les tyrosines spécifiques PTPs et les Dual-specificity PTP (ou DsPTPs) (Figure 2). Les Tyrosines Spécifiques PTPs déphosphorylent spécifiquement la tyrosine. Alors que DsPTPs déphosphorylent la sérine/thréonine et la tyrosine.

I.C. Les phosphatases chez la bactérie:

Les bactéries ont la capacité à mobiliser le P du sol qu’il soit minéral ou organique grâce à des phosphatases, dont certaines sont régulées par PhoB, de même que les transporteurs de Pi du régulon Pho. Parmi les phosphatases bactériennes, on distingue celles qui sont exsudées, celles qui sont transmembranaires et celles qui sont cytosoliques. Les phosphatases sont aussi classées sur la base du pH optimum, acide, neutre ou alcalin, pour leur activité (Deng et al., 2001, 2002).

Les phosphatases acides non spécifiques bactériennes sont appelées NSAPs (non specific acid proteins). Ce sont des protéines excrétées dans le milieu où elles sont capables d’hydrolyser la plupart des liaisons phosphoesters sans spécificité de substrat. Les NSAPs sont des protéines mono- ou dimériques. On distingue les NSAPs A, B et C sur la base de leur poids moléculaire et de leur séquence en acides aminés (Figure 3). Les NSAPs de classe A ont un poids moléculaire autour de 25-30 kDa. Elles sont codées par six classes de gènes et sont subdivisées en trois sous-classes : A1 (PhoC et ses homologues), A2 (PhoN et ses homologues) et A3 (ATPases). Les NSAPs de classe B ont une séquence protéique très conservée contenant un motif protéique similaire à celui des NSAPs de classe A. Ce sont des protéines homotétramériques de 100 kDa. Elles correspondent à 4 classes de gènes qui ont été clonés et séquencés. Les NSAPs de classe C ont étés récemment identifiées comme étant des lipoprotéines bactériennes d’un poids moléculaire voisin de 30 kDa. Leur structure primaire, diffère de celle des NSAPs de classe A et de classe B. Celle-ci contient un peptide signal typique des lipoprotéines bactériennes. Leur structure primaire a une similarité de séquence protéique forte avec deux autres lipoprotéines qui n’ont pas d’activité phosphatase. Elle agit sur de nombreuses liaisons phosphomonoesters. Les protéines NSAPs de classe B et de classe C sont membres de la superfamille de phosphohydrolases que Rossolini et al., (1998) appelle

Tableau 1 : Gènes du régulon Pho chez E.coli d’après Vershinin et Znamenskaya, 2002

Figure 4 : Schéma représentant la régulation de l’expression des gènes du régulon Pho chez E.coli. Quand le P

est en excès dans le milieu, l’expression des gènes du régulon Pho est réprimée par la formation d’un complexe répresseur qui comprend les protéines régulatrices PhoR, PhoU (U) et Pst. Dans des conditions de P limitant, quand la protéine PstS n’est pas saturée avec du Pi, le système Pst change de conformation spatiale ce qui permet de séparer PhoRR du complexe répresseur et la formation spontanée de l’activateur PhoRA. PhoRA

s’auto-phosphoryle. Le transfert du groupe phosphoryle à PhoB forme PhoB~P qui induit la transcription des gènes du régulon Pho en se liant avec des séquences cibles de certains promoteurs. D’après Vershinin et Znamenskaya, 2002

La phosphatase alcaline bactérienne (BAP) est une phosphomonoestérase périplasmique codée par phoA. Le Pi qu’elle rend disponible dans le périplasme est ensuite transporté à travers la membrane interne dans le cytoplasme où il peut être assimilé. BAP est phosphite-dépendante. Elle est la seule enzyme capable d’hydrolyser directement le phosphite en Pi in

vitro et in vivo, de la même manière qu’elle hydrolyse les phosphates d’esters (Yang et al.,

2004).

Pour la régulation des phosphatases bactériennes décrites ci-dessus, on sait que la synthèse de la phosphatase alcaline BAP est déterminée par la voie Pho, en réponse à la concentration intracellulaire en Pi comme signal majeur. Cette voie régule aussi les 3 systèmes de transport du Pi : PstSCAB, transporteur de Pi à haute affinité chez E. coli (Yuan et al., 2006) ; PhoCDET, transporteur de Pi à forte affinité (Vershinina et Znamenskaya, 2002); OrfA-Pit, transporteur de Pi à faible affinité (Bardin et Finnan, 1998). Un seul de ces transporteurs est suffisant pour la fixation symbiotique de l’azote chez la luzerne. Le locus orfA-pit code pour un système de prélèvement alternatif qui est utilisé par les mutants chez qui PhoCDET n’est pas fonctionnel.

La régulation de la voie Pho s’opère avec le produit du gène phoB du régulon Pho qui chez

E . coli (van Voegelen et al., 1996) agit sur les gènes contenant des « PhoB boxes » (Tableau

1). Smith et Payne (1992) suggèrent que PhoB peut réprimer l’expression de protéines

périplasmiques de transport de peptides en conditions de P déficient, tandis qu’il active la transcription de nombreux gènes qui constituent le régulon Pho (Wanner, 1996). Les membres du régulon Pho, dont PhoA et PhoCDT, montrent une régulation hiérarchisée qui est sous influence du niveau d’activation de la protéine PhoB selon la Figure 4. L’induction des gènes du transporteur Pho est régulée par les protéines PhoB et PhoR qui constituent un système régulateur à deux composantes (Domogala et al., 1998). En condition de P suffisant, PhoR déphosphoryle phospho-PhoB. En condition de P déficient PhoR s’auto-phosphoryle et phosphoryle PhoB. Phospho-PhoB se lie aux Pho boxes. (White et Metcalf, 2007). La transcription de phoB comme celle du gène pstS est constitutive alors que la transcription du gène phoA est réprimée par l’addition de 2 mmol.l-1 de Pi à l’inverse de celle du gène phoC qui n’est pas réprimée par la concentration de Pi (Bardin et al., 1996). PhoB joue un rôle important dans la détermination du niveau de transcription d’orfA-pit. Quand la concentration en Pi est élevée (2 mmol.l-1), PhoB est inactif et l’expression d’orfA-pit est déréprimée et le système phoCDET n’est pas exprimé Inversement, en condition de carence,

Figure 5 : Classification des phosphatases non spécifiques chez les plantes. Les phosphohyrdolases non

spécifiques sont classées selon leur pH optimum. Les ACPs sont des phosphatases acides. Elles regroupent les phosphatases acides pourpres (PAPs) et les ATPases. Les APs sont des phosphatases alcalines.

PhoB est activé, l’expression d’orfA-pit est réprimé, alors que l’expression de phoCDET est activée par PhoB. La localisation de l’expression de phoCDET et orfA-pit montre des différences physiologiques caractéristiques des deux systèmes de transport.

I.D. Les phosphatases chez la plante:

Les phosphatases non spécifiques regroupent les phosphatases acides (ACPs) et alcalines (APs) non spécifiques qui sont ubiquitaires dans le monde vivant (Figure 5).

Les phosphatases acides (ACPs) catalysent l’hydrolyse de phosphates monoesters à un pH compris entre 4 et 7. Les ACPs sont impliquées dans la libération, le transport et le recyclage du Pi (Penheiter et al., 1997). Leur activité phosphatasique est stimulée par une déficience en P du milieu. Les ACPs jouent un rôle dans l’utilisation de composés phosphatés (Garcia et al., 2004). Les ACPs pourpres (PAPs) sont communes chez les plantes et appartiennent à la famille des phosphatases acides non spécifiques. Elles appartiennent au groupe des métalloenzymes car elles contiennent un centre actif avec deux ions (Fe3+ et Zn2+). Elles se distinguent des autres ACPs par leur couleur pourpre due au complexe de transfert de charge du métal au phénolate. Ce sont des protéines homodimériques avec des sous unités d’environ 55 kDa (Schenk et al., 2000). L’analyse de leur séquence protéique les classe dans le groupe de phosphatases associées à la membrane qui contient les protéines phosphatase de type 2 (PP2). Chez le riz et le soja, la PAP est réprimée par le Pi. Elle jouerait donc un rôle dans l’acquisition du Pi par l’hydrolyse de phosphoesters tels que le phytate.

Les APs (phosphatases alcalines) ont des similarités dans leur mécanisme réactionnel avec la famille de Ser/Thr phosphatases et la famille des PTPs. Les APs sont des phosphoestérases non spécifiques présentes chez des organismes très variables allant des levures aux mammifères. Les APs sont des phosphotransférases non spécifiques car elles ont un mécanisme d’hydrolyse qui est entre celui des Ser/Thr et celui des PTPs. Les phosphatases alcalines jouent le rôle de phosphotransférases pour générer de nouveaux phosphoesters. Elles utilisent trois ions métal dans leur site actif (deux atomes de zinc et un de magnésium).

Figure 6 : Assises cellulaires existant dans un nodule de la symbiose Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici. Le

cortex se divise en trois assises cellulaires : le cortex externe (CE) qui est en contact avec la solution du sol ; le cortex médian (CM) qui se situe entre le parenchyme contenant des cristaux d’oxalates et les traces vasculaires (TV) et le cortex interne (CI) qui se situe entre les traces vasculaires et la zone infectée (ZI), qui contient les cellules infectées avec les bactéroïdes et la zone de distribution (ZD).

Figure 7 : Localisation des activités phosphatasiques à pH acide sur coupes nodulaires de la symbiose Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici. Les activités phosphatase sont colorées en vert et les tissus nodulaires sont en bleu.

II. Résultats :

II.A. Localisation d’activités phosphatasiques sur coupes nodulaires :

La localisation des phosphatases acides et alcalines au sein de l’organe symbiotique entre

Phaseolus vulgaris et Rhizobium tropici CIAT899 a été révélé par l’hydrolyse d’un substrat

artificiel, l’ELF du kit Endogenous phosphatase detection® _{(Molecular Probes, Leiden, The}

Netherlands) qui précipite sous forme cristalline. Le cristal obtenu émet une couleur verte (420nm) à des longueurs d’ondes d’excitation entre 360 et 370 nm alors que les tissus symbiotiques émettent une couleur bleue. La distinction entre phosphatases acides et phosphatases alcalines est effectuée par la modulation du pH du tampon de l’ELF. Les images en niveaux de gris (Figure 6 B) sont analysées en fausses couleurs (Figure 6 C). Le nodule est composé de différents tissus (Figure 6 A) : la zone infectée par les bactéries (ZI) et le cortex. La zone infectée contient les cellules infectées par les bactéroïdes et les cellules de la zone de distribution (ZD). Le cortex est subdivisé en allant de l’extérieur vers l’intérieur en cortex externe (CE), cortex moyen (CM) et cortex interne (CI). Le cortex moyen et le cortex interne entourent les traces vasculaires (TV) qui sont des communications directes avec les parties aériennes de la plante.

Selon les résultats en fausses couleurs présentés dans la Figure 7 A, le marquage des activités phosphatases sous pH acide est localisé principalement dans le cortex interne, dans la zone de distribution et dans les cellules infectées de la zone infectée (ZI). Le cortex moyen est aussi marqué mais de façon plus discrète que le cortex interne. Les traces vasculaires ne présentent pas de marquage. Dans les cellules infectées, les phosphatases acides sont localisées dans un point plus ou moins central.

Le marquage est plus fort sous P suffisant (Figure 7 A) que sous P déficient (Figure 7 C). Il n’est pas localisé de la même manière en condition de P déficient (Figure 7 C). Le cortex interne est toujours fortement marqué mais la zone de distribution n’est pas marquée. Les cellules infectées de la ZI sont encore marquées mais le marquage est plus diffus dans la cellule. Il semble que ce soit les bactéroïdes qui soient marqués. Le cortex est marqué de façon similaire quelque soit la condition de P.

Le marquage varie selon les lignées de Phaseolus vulgaris. La lignée 115, tolérante à la déficience en P, a un marquage plus marqué (Figure 7 A ; C) que la lignée 147, lignée sensible à la déficience en P (Figure 7 B ; D), quel que soit le traitement P. En condition de P

Figure 8 : Localisation des activités phosphatasiques à pH alcalin sur coupes nodulaires de la symbiose

Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici. Les activités phosphatase sont colorées en vert et les tissus nodulaires en bleu.

Tableau 2 : Séquences des primers spécifiques utilisés pour la RT-PCR in situ et pour la vérification des

séquences amplifiées par clonage pour la bactérie symbiotique Rhizobium tropici CIAT899

Organisme Gène Amorces Séquence nucléotidique 5'-3' Tm

Rhizobium tropici

Phosphatase acide

Pac B dir1 CTGCTTACGAATGACGACGGC 57.1°C

Pac B dir2 GATTTCCGACAAGCATTTCGC 56.1°C

Pac B rev1 CCAGTTTCAAAGGCGTTACCG 56.2°C

Pac B rev2 TCGGGACGGCAGTTCGG 57.5°C

phosphatase alcaline

Pal B dir1 GCGCGACGATCCTTGCC 57.3°C

Pal B dir2 GCGGTCGTTKCYCAYACCC 57.4°C

Pal B rev1 CGGCGGCTGACGTCGA 57.3°C

Pal B rev2 RCGATCCCAATCGAGCGG 57.1°C PhoB

PhoB dir1 CGTTCTYCTKCGCTACAATCTCG 57.5°C

PhoB dir2 CCCGACCTTCTCATCCTYGAYT 57.1°C

PhoB rev1 GTSCGGATGACGTCSKGC 56,7°C

Figure 9 : Comparatif de validité de la technique de RT PCR in situ sur coupes nodulaires de la symbiose Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici avec les amorces PAcB2 spécifiques d’une

Figure 10 : Localisation des transcrits bactériens sur coupes nodulaires de la symbiose Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici par RT PCR in situ avec les amorces PAcB2 (rev et dir)

spécifiques d’une phosphatase acide bactérienne. A et C (lignée tolérante 115) et B et D (lignée sensible 147) désignent les lignées de Phaseolus vulgaris utilisées pour cette expérience. P suffisant (A ; B) et P déficient (C ; D) présentent respectivement 250 et 75 µmolPi.sem-1.pl-1. Les transcrits sont colorés en vert et les tissus nodulaires fluorescent en bleu.

suffisant, les tissus marqués sont légèrement différents pour la lignée 147 (Figure 7 B). Il y a peu de marquage dans le cortex interne. Il est inexistant dans la zone de distribution. En condition de P déficient, le cortex interne et les cellules infectées sont plus marqués pour la lignée 147 (Figure 7 D) que pour la lignée 115 (Figure 7 C).

A pH alcalin, les phosphatases alcalines ont moins d’activité qu’à pH acide (Figure 8 et

Figure 7). Le marquage est localisé dans des cellules infectées de la ZI (Figure 8 A). De plus,

ce marquage n’est pas distribué uniformément dans la ZI. A l’inverse des phosphatases acides, il n’y a pas de marquage des phosphatases alcalines dans le cortex. En particulier, il n’y a aucun marquage significatif du cortex interne. La déficience en P n’a pas d’effet significatif sur le marquage (Figure 8 A ; C). La variation du marquage entre les deux lignées est assez faible.

II.B. Localisation des transcrits bactériens sur coupes nodulaires par

RT PCR in situ :

Afin de localiser sur coupe nodulaires les transcrits de trois gènes bactériens codant pour une phosphatase acide (PAc) et les protéines PhoA, PhoB, deux couples d’amorces ont été dessinés par gène (Tableau 2). Les amorces sont nommées 1 ou 2 selon leur position sur le gène. Le couple d’amorces 1 permet l’amplification d’un grand fragment d’acide nucléique. Le couple d’amorces 2 permet d’amplifier un fragment de 350 à 500 pb à l’intérieur du premier fragment. Les séquences d’amorces spécifiques ont été dessinées à partir des séquences provenant de Rhizobactéries décrites sur le site Rhizobase (http://bacteria.kazusa.or.jp/rhizobase/) pour la phosphatase acide (dénommée PAcB dans cette étude), la phosphatase alcaline PhoA et la protéine régulatrice du régulon Pho PhoB. Les amorces ont été dessinées de manière à pouvoir réaliser des nested PCR lors de la vérification des séquences amplifiées par clonage et séquençage.

Avec les amorces PacB2dir et rev, aucun signal n’est observé dans les coupes des contrôles négatifs sans transcription inverse (Figure 9 A; B) alors que l’on peut voir une localisation de transcrits dans les coupes après RT (Figure 9 C ; D). Le signal correspondant à l’amplification du gène est localisé dans les cellules infectées de la zone infectée du nodule. En revanche aucun signal n’est détecté dans les cellules végétales non infectées de cette zone.

Tableau 3 : Séquences des primers spécifiques utilisés pour la RT-PCR in situ et pour la vérification des

séquences amplifiées par clonage pour le haricot (Phaseolus vulgaris).

Organisme Gène Amorces Séquence nucléotidique 5'-3' Tm

Phaseolus vulgaris Phosphatase acide (AB116720)

PAc PV 1 (dir) CTTATGAAAGATCATATCGTTTCTCC 61°C PAc PV 2 (rev) CTTGCTTCAAAGTTTTTGGATCCACA 62°C PAc PV 3 (dir) GCTCATGCACGTGCCACTCTAC 57°C

Figure 11 : Comparatif de validité de la technique de RT PCR in situ sur coupes nodulaires de la symbiose Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici avec les amorces PAcPV spécifiques d’une

Figure 12 : Localisation des transcrits végétaux sur coupes nodulaires de la symbiose Phaseolus vulgaris – Rhizobium tropici par RT PCR in situ avec les amorces PAc PV3 et PAc PV2

spécifiques d’une phosphatase acide pourpre de Phaseolus vulgaris. A et C (lignée tolérante 115) et B et D (lignée sensible 147) désignent les lignées de Phaseolus vulgaris utilisées pour cette expérience. P suffisant (A ; B) et P déficient (C ; D) présentent respectivement 250 et 75 µmolPi.sem-1.pl-1. Les transcrits sont colorés en vert et les tissus nodulaires fluorescent en bleu.

L’expression varie selon les traitements P et les variétés. En condition de P déficient, le signal est très faible dans les cellules infectées pour la lignée 147 (Figure 10 D). En condition de P suffisant, le signal est plus important chez 147 (Figure 10 B) où le signal permet de distinguer les cellules infectées des cellules non infectées. On retrouve cette intensification du signal chez la lignée 115 (Figure 10 A ; C). La lignée 147 a un faible marquage (Figure 10 B ; D) comparativement à celui de la lignée 115 (Figure 10 A ; C) indépendamment du traitement P. On peut classer, grâce à l’intensité du signal, les lignées et les traitements. Il y a croissance de l’intensité du marquage entre la lignée 147 en P déficient, la lignée 147 en P suffisant, la lignée 115 en P déficient et la lignée 115 en P suffisant.

La localisation de transcrits bactériens avec la technique de RT PCR in situ n’a pu être réalisée que pour l’expression du gène amplifié par les amorces PAcB2 car des séquences amplifiées nettes pour les couples d’amorces PhoA1, PhoA2, PhoB1 et PhoB2 n’ont pas été obtenues par PCR classique.

II.C. Localisation de transcrits végétaux sur coupes nodulaires par

RT PCR in situ :

Afin de localiser sur coupe nodulaires les transcrits d’un gène codant pour une phosphatase acide végétale, des amorces spécifiques ont été dessinées à partir de la séquence nucléotidique de l’ARNm d’une phosphatase acide pourpre (accession AF236109) (Shenk et al., 2000) et de la séquence décrivant le gène codant pour une phosphatase acide (accession AB116720) (Yoneyama et al., 2004). Ces deux séquences ont une homologie de plus de 98 %. Trois amorces ont été dessinées (Tableau 3) pour avoir deux couples d’amorces avec une seule amorce inverse. Les amorces PAcPV3 et PAcPV2 permettent l’amplification d’une séquence de 280 pb et les amorces PAcPV1 et PAcPV2 l’amplification d’une séquence de 150 pb à l’intérieur de celle-ci.

Il n’y a pas de signal dans les coupes des contrôles négatifs sans transcription inverse (Figure 11 A ; B) alors que l’on peut voir une localisation de transcrits végétaux dans les coupes après RT (Figure 11 C ; D). Les transcrits d’un gène codant pour une phosphatase acide chez Phaseolus vulgaris se localisent dans les cellules végétales du cortex interne, les

Figure 13 : PCR de vérification de l’insertion des produits PCR de PAcB2 (Rhizobium tropici, phosphatase acide couple d’amorces n°2) dans le vecteur PGEMT puis dans E.coli.

Tableau 4 : Résultat du blast de la séquence du clone 2H de PAcPV sur le site NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast

Accession Description Max

score Total score Query coverage E value Max ident AB116720 .1

Phaseolus vulgaris gene for acid phosphatase,

complete cds 669 669 96% 0.0 100%

AB116719 .1

Phaseolus vulgaris mRNA for acid phosphatase,

complete cds 265 517 76% 1e-67 99%

AY151271 .1

Glycine max cultivar Wenfeng7 purple acid phosphatase-like protein (Pap3) mRNA, complete cds

217 397 75% 3e-53 93%

AY151275 .1

Glycine max cultivar Mengjin1 purple acid phosphatase-like protein (Pap3) mRNA, complete cds

217 397 75% 3e-53 93%

AY151274 .1

Glycine max cultivar Jixian11 purple acid phosphatase-like protein (Pap3) mRNA, complete cds

217 397 75% 3e-53 93%

AY151273 .1

Glycine max cultivar Zaoshu6 purple acid phosphatase-like protein (Pap3) mRNA, complete cds

217 397 75% 3e-53 93%

AY151272 .1

Glycine max cultivar Union purple acid

phosphatase-like protein (Pap3) mRNA, complete cds

217 397 75% 3e-53 93%

AJ458943. 2

Lupinus luteus mRNA for acid phosphatase

traces vasculaires et les cellules infectées (Figure 12). Dans les cellules infectées le marquage est diffu dans la cellule. Les cortex médium et externe ne sont pas marqués.

Le marquage est moins important en condition de P suffisant (Figure 12 A ; B) qu’en condition de P déficient. En condition de P déficient (Figure 12 C ; D), le marquage est plus fort dans le cortex interne et les traces vasculaires. Par contre, il est réduit dans les cellules infectées. Certaines cellules non infectées sont marquées alors qu’elles ne l’étaient pas en conditions de P suffisant. L’intensité du marquage est beaucoup plus importante pour la lignée 147 (Figure 12 B ; D) que pour la lignée 115 (Figure 12 A ;B) quelle que soit la nutrition P.

II.D. Vérification des séquences nucléotidiques visualisées en RT-PCR in

situ :

Afin de vérifier que les gènes amplifiés sur les coupes nodulaires correspondent bien aux séquences de phosphatases à partir desquelles ont été faites les amorces, des RT-PCR in vitro on été réalisées sur extraits d’ARNm de culture bactérienne et de nodules.

Des extraits d’ARNm ont été obtenus à partir de 25 ml de culture de CIAT 899 en conditions de P suffisant ou de P déficient. Les résultats PCR après RT sont donnés Figure 13. La PCR sur colonie avec les amorces PAcB2dir et PAcB2rev a révélée 13 clones positifs. Les amplifias étaient de tailles différentes. Six clones ont été choisis en fonction de la taille de l’insert et sont en cours de séquençage. L’identification des séquences amplifiées par les couples d’amorces PAcB1, PhoA1, PhoA2, PhoB1 et PhoB2 n’a pu être menée à bien car il n’a pas été obtenu de clones avec les produits PCR correspondants après la ligation.

Des extraits d’ARNm ont été obtenus sur 100 mg nodules de Phaseolus vulgaris en conditions de P suffisant et en conditions de P déficient (Cf. matériel et méthodes IVD). Les résultats des PCR après RT sont donnés annexe 9. Apres transformation, 43 clones de PV PAc (phosphatase acide Phaseolus vulgaris) ont été obtenus (annexe 10). La digestion enzymatique de ces 43 clones, avec MboI, n’a révélé qu’un seul profil de restriction sur gel de polyacrylamide (annexe 11), suggérant que ces 43 clones sont identiques. Cette conclusion est soutenue par l’obtention de 2 séquences identiques dans le séquençage de 2 des 43 clones . L’alignement avec les séquences de phosphatase acide ayant servi à dessiner les amorces spécifiques a montré que la séquence amplifiée par le couple d’amorce P3/P2 est bien une phosphatase acide de Phaseolus vulgaris.(Tableau 4)

III. Discussion :

Le résultat essentiel de notre travail est que la technique de RT PCR in situ permet de visualiser, pour la première fois à notre connaissance, des transcrits bactériens à l’intérieur du nodule, organe de la symbiose rhizobia-légumineuse (Figure 11). S’agissant de marquage de gènes du microsymbiote van Aarle et al. (2007) ont montré la localisation de l’expression de gènes fongiques sur du mycélium en culture pure. Seddas et al. (2008), ont réalisé la RT PCR in situ sur un gène (Lsu rRNA) codant pour la grande sous-unité ribosomale de

Glomus intraradices en symbiose aves des tissus végétaux (Medicago truncatula). Dans notre

travail, le signal plus intense dans les cellules infectées proches du cortex interne et des invaginations de la zone de distribution dans la zone infectée révèle une hétérogénéité de la zone infectée du nodule quant à l’expression du gène d’une phosphatase acide bactérienne. L’effet stimulant de la déficience en P sur l’expression de ce gène (Figure 12) est comparable à celle observée pour les activités phosphatases acides dans les cellules infectées (Figure 7). Cette similarité est une confirmation circonstancielle de la validité de la méthode de RT PCR in situ. Ce résultat suggère que cette phosphatase acide bactérienne serait impliquée dans la réponse de la symbiose à la déficience en P. Si la fonction de cette phosphatase est de libérer du Pi pour le métabolisme bactéroïdien, alors nos observations conduiraient à conclure que les bactéroïdes sont carencé en P, et ce d’autant plus que l’apport de P est limitant. Elles suggèreraient aussi que l’état de disponibilité de P pour les bactéroïdes varie selon les cellules de la zone infectée. De plus, l’expression plus forte de ce gène sous déficience en P pour la lignée tolérante 115 comparée à la lignée sensible 147, suggère qu’il serait un facteur d’adaptation de la symbiose à la déficience en P. Notre observation montre que les phosphatases alcalines, présentes en faible quantité dans le nodule, sont exprimées majoritairement dans les cellules. Cela suggère que des phosphatases alcalines joueraient aussi un rôle pour les bactéroïdes.

Notre travail montre aussi que la RT PCR in situ est utilisable pour la visualisation de transcrits végétaux dans un organe symbiotique où c’est la première fois à notre connaissance que cela est réalisé. Des visualisations par RT PCR in situ de l’expression de gène végétaux ont été réalisées sur Arabidopsis thaliana (Cellier et al., 2004; Wieczorek et al., 2008) y compris par Wu et al. (2007) sur des apyrases (ATPases). Dans le nodule, l’expression de gènes codant pour une phosphatase acide dans les cellules du cortex interne pourrait être

augmente sous déficience en P, comme c’est le cas du signal de PAcPV. De plus, la perméabilité nodulaire exige un fort métabolisme énergétique car elle est présumée dépendre d’une osmorégulation forte. La demande en ATP pourrait être à l’origine de l’hydrolyse de P organique pour fournir du Pi au métabolisme énergétique. Le Pi ainsi libéré pourrait être utilisé dans les cellules du cortex interne et/ou diffuserait par voie symplastique vers la zone infectée (zone de distribution et cellules infectées). Cette interprétation est cohérante avec les résultats de la Figure 12 où il y a activation de la transcription de PAcPV en condition de P déficient dans la zone de distribution. Le P organique fourni aux cellules nodulaires proviendrait des parties aériennes par les traces vasculaires où les phosphatases acides débuteraient la libération du Pi. Le P organique serait transféré aux cellules du cortex interne. Il diffuserait via la zone de distribution vers aux cellules infectées où il serait hydrolysé par des phosphatases acides végétales et par des phosphatases acides bactériennes. Il y aurait alors compétition entre ces deux types de phosphatases acides pour l’hydrolyse du P organique. Cette compétition est visible Figure 10 où l’on peut remarquer la diminution des transcrits bactériens quand le P disponible diminue alors que dans les même tissus, les transcrits végétaux augmentent ainsi que la quantité de phosphatases acides. La variation d’intensité du signal suggère l’existence d’un gradient de P dans le nodule depuis les traces vasculaires vers les cellules du cortex interne, la zone de distribution puis les cellules infectées. La localisation des transcrits de pacB2 dans les traces vasculaires, alors que l’activité des phosphatases à pH acide ne se retrouve pas dans ces tissus, suggère la possibilité de rhizobia endophytiques dans les traces vasculaires.

La disponibilité en P du milieu joue un rôle sur la quantité d’enzymes phosphatases acides puisqu’en P déficient, les cellules végétales et bactériennes ont moins de phosphatases acides qu’en P suffisant (Figure 12). Le génotype joue un rôle sur la quantité de phosphatases acides présente dans le nodule puisque la lignée tolérante (115) présente un plus fort marquage que la lignée sensible (147). Cela suggère que la capacité d’une lignée à augmenter le nombre de ses phosphatases acides joue un rôle dans la tolérance à la déficience en P.

En conclusion, la RT PCR in situ permet la localisation de transcrits bactériens et végétaux au sein d’un même organe symbiotique. Afin de confirmer les résultats obtenus, nous souhaitons localiser les transcrits végétaux et bactériens sur des coupes nodulaires d’un plus grand nombre de lignées contrastantes dans l’utilisation du P afin d’établir s’ils interviennent dans l’efficacité d’utilisation du P pour la fixation d’azote. Notre laboratoire ayant participé à

la découverte d’autres gènes codant pour des phosphatases acides chez le pois chiche, notre objectif suivant est d’élargir, chez Phaseolus vulgaris, notre étude à certains de ces gènes. Mais il nous avons une disparition aléatoire de cellules infectées lors des étapes de la RT PCR in situ. Il serait intéressant, pour résoudre ce problème technique, de réaliser la RT PCR in situ sur des coupes plus épaisses (100 µm) et/ou sur lames. Serra et al. (2008) ont réalisé la RT PCR in situ sur tissus entiers avec des traitements protéiques pour permettre la visualisation des ADNc par microcopie confocale. Il pourrait être intéressant de tester leurs méthodes préparatoires sur notre modèle d’étude avec des nodules entiers et sur un deuxième modèle du laboratoire qui est la symbiose mycorhizienne entre Hebeloma cylindrosporum et

Pinus pinaster.

IV. Matériel et méthodes :

IV.A. Culture hydro-aéroponique de haricots:

Les lignées de Phaseolus vulgaris BT21138-115-1-1-M-M-M, dénommée couramment 115, et BT21138-147-1-1-M-M-M, dénommée couramment 147, ont été sélectionnées dans la descendance du croisement parental des lignées BAT477 et DOR364 réalisé au Centre International de l’Agriculture Tropicale (CIAT, Cali Colombie). Les graines sont stérilisées avec 3% d’hypochlorite de calcium durant 5 à 7 min puis rincées dans de l’eau distillée stérile (Vincent, 1970). Les graines sont mises à germer sur papier filtre stérile pendant 48 h à 28 °C. Le Rhizobium tropici CIAT899, provenant du CIAT est un rhizobia avec une haute

capacité d’infection symbiotique et de fixation de l’azote atmosphérique de la plupart des lignées de haricots (Vadez, 1996). L’inoculum contient 109 bactéries.ml-1 préparé selon Vincent, 1970. Les plantules sont inoculées pendant 30 min sous agitation dans 100 ml de solution bactérienne.

Les haricots sont cultivés en serre à 25/20 °C durant 16/8 h jour/nuit avec une complémentation à 400 µmol de photon.m-² .s-1, et 70% d’humidité relative durant le jour. La solution nutritive est composée de : CaCl2 (1,65 mmol.l-1) ; MgSO4,7 H2O (1,00 mmol.l-1) ; K2SO4 (0.70mmol.l-1) ; FeEDDHA (8.3 mg l-1) ; H3BO3 (4 µmol.l-1) ; MnSO4, H2O (6 µmol.l-1) ; ZnSO4,7 H2O (1 µmol.l-1) ; CuSO4, 7 H2O (1 µmol.l-1) ; Na2MoO4,7 H2O (0,1 µmol.l-1). La solution est renouvelée toutes les deux semaines jusqu’à 4 semaines de cultures, puis chaque semaine. Un ajout d’urée est réalisé les deux premières semaines à raison de 2 mmol.l-1 la première semaine de culture et de 1 mmol.l-1 la deuxième semaine

(Hernandez et Drevon, 1991, modifié). Par la suite les plantes sont cultivées dans une solution nutritive sans azote. Le P est ajouté chaque semaine dans la solution nutritive sous forme de KH2PO4 à raison de 250 µmol.semaine-1.plante-1 pour le traitement P suffisant et de 75 µmol.semaine-1.plante-1pour le traitement P déficient. L’aération de la solution de culture est assurée par un flux permanent d’environ 400 ml min-1l-1d’air comprimé. Le pH est ajusté à 7 avec CaCO3.

IV.B. Préparation des sections de nodules:

Pour la RT PCR in situ, des nodules de 3 à 5 mm de diamètre sont récoltés 5 semaines après inoculation et lavés dans de l’eau traitée au DEPC (1 ml.l-1). Les deux extrémités des nodules sont excisées selon l’orientation transversale par rapport à la racine afin d’exposer directement la zone infectée et le cortex au fixateur à température ambiante pendant deux h sous vide dans un fixateur (paraformaldéhyde 4% (w/v) ; éthanol 45° ; acide acétique 5%), (van Aarle et al., 2007 modifié). Les nodules sont conservés toute la nuit à 4°C dans le fixateur. Par la suite les nodules sont lavés 2 fois 5 min puis 2 fois 10 min dans de l’eau traitée au DEPC avant d’être inclus dans de l’agarose low melting 9 % dans du PBS (Na2HPO425 mmol.l-1; NaCl 0,65 mmol.l-1; pH 7,5) (Cellier et al., 2004). Des sections de 50 µm sont réalisées avec un vibratome (Micro-cut H1200 Vibrating Microtome Bio-rad, Marnes la Coquette, France). Elles sont lavées 3 fois avec de l’eau traitée au DEPC à 65 °C et conservées dans 20 µl à température ambiante.

Pour la localisation des activités phosphatases, des nodules de 3 mm de diamètre sont récoltés 5 semaines après inoculation et lavés dans de l’eau traitée au DEPC. Les deux extrémités des nodules sont excisées selon l’orientation transversale par rapport à la racine afin d’exposer directement au fixateur (éthanol) la zone infectée et le cortex. Les nodules sont conservés à 4°C dans le fixateur jusqu’à la manipulation. Par la suite, les nodules sont inclus dans de l’agarose low melting 9% dans du PBS (Cellier et al., 2004). Des sections de 50 µm sont réalisées avec au vibratome (Micro-cut H1200 Vibrating Microtome Bio-rad, Marnes la Coquette, France).

IV.C. RT PCR in situ :

La RT-PCR est réalisée avec les amorces spécifiques de chacun des gènes étudiés (Tableau 2 et 3). Nous avons choisi d’amplifier des séquences de 280 à 400 pb selon le gène étudié. L’alignement de séquences a été réalisé avec le logiciel ClustalW2®sur le site internet

d’European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) (Cf. annexes 4 ; 6 et 8). Les séquences des primers sont décrites dans les Tableau 3 et Tableau 2. Les primers ont été dessinés pour avoir une Tm (Température de melting) assez proche et une Th (Température d’hybridation lors de la PCR de 60 °C).

Il est ajouté, aux 20 µl contenant les sections de nodules, 19 µl de mélange de transcriptase inverse réalisé avec le buffer de la MMLV transcriptase inverse® de Proméga, le primer reverse (0,3 nmol.µl-1), des dNTP (1 nmol.µl-1) selon les recommandations du fournisseur. Ces 39 µl sont incubés 5 min à 65 °C. La MMLV transcriptase (5 U.µl-1) inverse®est ajoutée après que les tubes aient été incubés 2 min dans la glace (Koltai et Bird, 2000, modifié). Les tubes sont incubés 1 h à 42 °C dans le thermocycleur (Mastercycler personal, Eppendof, Hamburg, Allemagne). Les coupes sont lavées 3 fois avec 100 µl d’eau traitée au DEPC (1ml.l-1) agitation et conservées dans 20 µl d’eau traitée au DEPC (1ml.l-1). Un mélange PCR avec primer reverse (0,1 nmol.µl-1), primer dir (0,1 nmol.µl-1), dNTP (1 nmol.µl-1), DIG-11 -dUTP (0,1 nmol.µl-1) (Roche, Basel, Switzerland) et de la Taq Poly®0,125 U.µl-1(Invitrogen, Carlsbad, USA) en conditions du fournisseur sont ajoutés aux 20 µl de sections nodulaires. Le cycle PCR suivant est réalisé : 30 cycles à 92 °C : 30 s, 60 °C : 30 s, 72 °C : 45s. Un contrôle négatif (NRT) est réalisé sans transcriptase inverse. Après la PCR les coupes nodulaires sont rincées 3 fois avec 200 µl de PBS sous agitation puis incubées 30 min sous agitation dans 100 µl de tampon de blocage (PBS additionné de BSA 2% ; Triton 0,3%) et conservées à 4°C toute la nuit. La solution de blocage est remplacée par 100 µl de tampon AP (BSA 2 %; PBS; triton 0,3%; anti- DIG (75.10-5.U µl-1) (Roche, Basel, Switzerland). Les coupes sont incubées dans le tampon AP durant 1 h 30 min à l’obscurité à température ambiante puis rincées 3 fois avec du PBS.

Le kit de détection ELF-97® endogenous phosphatase detection kit® _{(Molecular Probes,}

Leiden, The Netherlands) est utilisé (van Aarle et al., 2001) pour détecter la phosphatase alcaline conjuguée à l’anti-DIG (van Aarle et al., 2007). Cette méthode a été mise au point pour avoir une sensibilité élevée de la détection de phosphatase en comparaison des méthodes basées sur les sels de tétrazolium et leurs précipités (van Aarle et al., 2001). Le substrat ELF est dilué au 1/40èmedans le tampon de détection alcalin fourni. La solution est mixée et filtrée (0.22 µm filter; Millex®-GV, Millipore, Bedford, USA), avant d’être ajoutée aux coupes nodulaires à raison de 40 µl par tube. Les coupes sont incubées 20 min dans le noir. Les échantillons sont lavés 3 fois 10 min avec du tampon d’arrêt (PBS ; EDTA 25 mmol.l-1; Lévamisol 5 mmol.l-1; pH 8,0) avant d’être montés sur lames de microscopie.

Les observations sont réalisées sur un microscope à épi-fluorescence (BX61 microscope, Olympus, Hambourg, Allemagne) équipé avec une lampe au mercure. Le filtre utilisé permet de visualiser des longueurs d’ondes d’excitation à 360 à 370 nm et d’émission à 420 nm. Les images sont prises avec la caméra Color view II et le logiciel Analysis (Soft Imaging System) software. Elles sont analysées avec le logiciel ImageJ.

IV.D. Localisation des activités phosphatasiques :

Les coupes sont lavées 3 fois avec de l’éthanol à 60 °C et conservées dans 100 µl d’éthanol à 4 °C. On utilise le kit ELF et le substrat est dilué au 1/10ème dans le tampon de détection alcalin fourni (pH 8) pour la visualisation de l’activité des phosphatases alcalines ou dans un tampon acide (acétate de sodium 25 mmol.l-1; pH 5,4) pour la visualisation de l’activité des phosphatases acides (van Aarle et Plassard, soumi pour publication). La solution est mélangée et filtrée (0.22 µm filter; Millex®-GV, Millipore, Bedford, USA), avant d’être ajoutée aux coupes nodulaires. Les coupes sont incubées 30 min dans le noir. Les échantillons sont lavés 3 fois 10 min avec du tampon d’arrêt (PBS ; EDTA 25 mmol.l-1; Lévamisol 5 mmol.l-1; pH 8) avant d’être montés sur lames de microscopie.

Les observations sont réalisées sur un microscope à épi-fluorescence (BX61 microscope, Olympus, Hambourg, Allemagne) équipé avec une lampe de mercure. Le filtre récupère les longueurs d’onde d’une excitation de 360 à 370 nm et d’émission de 420 nm. Les images sont réalisées avec la caméra Color view II et prises avec le logiciel Analysis (Soft Imaging System). Elles sont travaillées avec le logiciel ImageJ. Les photos obtenues grâce au logiciel de microscopie CellP®sont des photos en 255 niveaux de gris. Elles ont été traitées en fausses couleurs sur le logiciel ImageJ par le module « Lookup Tables » avec l’option « Green Fire Blue ». Le logiciel attribue à chaque niveau de gris une intensité de rouge, de bleu et de vert.

IV.E. Vérification des séquences amplifiées :

L’extraction d’ARNm de nodules de Phaseolus vulgaris, cultivés en conditions hydro-aéroponiques (Cf. IV.A.), a été réalisée avec le kit RNAeasy mini kit® (Qiagen, Hilden, Allemagne, Hilden, Allemagne) à partir de 100 mg de nodules frais d’un mélange des lignées 115 et147. Quatre conditions différentes ont été utilisées : P déficient ; P suffisant enrichis soit en cortex soit en zone infectée.

L’extraction d’ARNm a été réalisée à partir de 25 ml de cultures cellulaires de

Rhizobium tropici CIAT899 cultivées 48 h sur milieu YEM : K2HPO4 (500 mg.l-1) ; MgSO4,7H2O (200 mg.l-1) ; NaCl (100 mg.l-1) ; Mannitol (10 g.l-1); extrait de levure (0,4 g.l-1) puis lavées avec du milieu MZP avec zéro P ( milieu YEM sans P). Elles sont transférées soit dans du milieu YEM (condition de P suffisant) soit dans du milieu MZP (condition –P). Après 12h de culture, les cellules ont été centrifugées 30 min à 4 °C à 13 000 rpm puis le culot congelé à -80°C jusqu’à l’extraction proprement dite.

L’extraction d’ARNm a été réalisée avec le kit RNAeasy bacteria kit® (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fournisseur pour les bactéries et le kit RNAeasy plant mini kit®(Qiagen, Hilden, Allemagne) pour les nodules. La réverse transcription a été réalisée avec l’enzyme MMLV® de Proméga (Madison, USA) en conditions normales d’utilisations recommandées par le fournisseur mais avec 5 µl d’extrait d’ARNm et le primer reverse (rev) (0,3 nmol.µl-1) spécifique à chacun des gènes étudiés. La PCR a été réalisée en conditions préconisées par le fournisseur de la Go-Taq (Proméga, Madison, USA) avec 1 µl de réaction de reverse transcription et les primers spécifiques (0,2 nmol.µl-1) à chaque gène étudié. Le cycle PCR réalisé est le suivant : 95 °C : 2 min ; [95 °C : 45s ; 60 °C : 1 min puis la température descend de 1 °C par cycle ; 72 °C : 1 min ; 15 cycles ; [72 °C : 2 min puis 60 °C : 1 min ; 72 °C : 1 min] 25 cycles ; 72 °C : 10 min ; 4 °C : 10 min. Les produits de PCR ont été visualisés sur gels d’agarose 2% dans du TAE avec une migration de 2 h à 100 V puis coloré au BET.

La ligation a été réalisée dans le vecteur pGEM-T avec le kit pGEM-T Easy Vector systems ®(Proméga, Madison, USA) en conditions normales d’utilisation recommandées par le fournisseur. Le clonage a été réalisé dans des cellules compétentes JM109® (Proméga, Madison, USA). Une PCR sur clones dite « de vérification des inserts » a été réalisée avec les primers spécifiques des gènes étudiés (95°C : 2 min ; [95 °C : 45 s ; 60 °C : 30 s ; 72 °C : 30 s] 30 cylces ; 72 °C : 10 min). La migration s’effectue sur gel d’agarose 2% pendant 1 h 30 min à 100 V.

Les produits de la PCR sur clones à partir de gènes de Phaseolus vulgaris avec les primers P2 et P3 ont été digérés avec l’enzyme MboI (Proméga, Madison, USA) en conditions normales d’utilisation recommandées par le fournisseur puis visualisés sur gels de polyacrylamide 7% (SDS 0,1% ; bisacrylamide 7% ; ammonium persulfate 1,5% ; Tris-HCl pH 8,8) ayant migré 6 h 30 min à 100 V et coloré au BET.

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