Structure d'un locus de résistance à la rouille chez une espèce hautement polyploïde, la canne à sucre (2n=ca 12x=ca 115)

(1)

Structure d'un locus de résistance

à la rouille chez une espèce

hautement polyploïde, la canne à

sucre (2n=ca 12x=ca 115)

Présenté par : ZINI Cyrille

Directrice de thèse :

Angélique D’Hont

(2)

Carte Génétique

Difficulté : seuls les marqueurs simples doses peuvent être utilisés.

- Exploitation de la synténie avec le riz et le sorgho.

- Région orthologue sur le chromosome 4 du sorgho.

- Région orthologue sur le chromosome 2 du riz.

Obtention d’une carte génétique fine.

Basée sur 700 descendants issus de l’autofécondation de R570.

Bru 1 F57P2V cBR37 R24P17 R195K17S cBR23 pPAP05H10 0,28 cM cBR33 F123K21D cBR32 2 recombinaisons0,28 cM

(3)

Carte Physique

1 7 2 3 5 6 X Région cible 164H22 ~110 kb 53A11 2F16 186A6 237P21 3E15 256D6 127H18 130G17 82G8 47H6 183A14 109O20 237G8 162A6 86O15 162L23 147P8 81O7 a b c d 64F5 175K8 50H6 137O5 4F22 14D2 α β γ δ ε Haplotype cible BAC homéologue de canne à sucre GAP GAP CIR12E3 ~125 kb CIR9O20 ~90 kb 15N23 ~120 kb 253G12 ~135 kb 25N7 ~90 kb 197G4 ~100 kb 142J21 ~135 kb 47B17 ~80 kb 28G16 ~70 kb 135P16 ~90 kb 4 CIR43P6 95D3 CIR12H16 ~95 kb 22M6 ~85 kb 2 banques BAC 123K21 91A1 24P17 149J14 195K17 BAC orthologue chez le sorgho R24P17V PSB0084 R91A1H R150O5S F143C6H F150O5V cBR37 F123K21D cBR33 R195K17 cBR23 pPAP05H10 0,28 cM 0,14 cM _Bru1 0,14 cM 0,14 cM Carte génétique du CG VII-1 cBR32 R15N23S X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 12E3-D10 12E3-A5

9O20-D10 9O20-F4 R9O20 R12E3 22M6-H5 12 E3-B6 12E3-H6 12 E3-D7 F12H16S

X X X X X X X X X X X X X X X X R12H16

(4)

Carte génétique de R570 VII-1 (sur 112 individus) Insertion Bru1 VII-1 0 m4m5 24,2 R137Sstd 24,2 aagctt19 26,1 atctt22 26,1 aaccac6 27,4 attcag 29,9 cBR8e 29,9 cBR20a 30,8 PAP05H10 30,8 cBR23 30,8 R195K17h 31,7 R15N23S 31,7 cBR32 31,7 F12H16S 31,7 b12E3D7 31,7 b12E3H6 31,7 b12E3B6 31,7 b12E3A5 31,7 R12H16 31,7 b12E3D10 31,7 R12E3 31,7 R9O20 31,7 b9O20F4 31,7 b9O20D10 31,7 cBR33 31,7 F123K21D 32,6 cBR37 32,6 F57P2V 32,6 R24P17eV 32,6 PSB0084 32,6 cBR47 32,6 cBR56a 33,5 actctg9r 33,5 CDSR29 33,5 aaccgt 33,5 aagcta23 33,5 acgctt17 59,8 acgcag6

2 000 nouveaux individus de l’autofécondation de R570 criblés

Pas de nouveaux recombinants

Bru1 Groupe d’homologie -4.7cM 1.8cM cBR8-F123K21D -1cM 1.8cM cBR20-R15N23S -2.7cM 0cM R15N23S-F123K21D -7.2cM 3.7cM 1.8cM cBR20-F123K21D 10.3cM -2.4cM cBR8-cBR56 -2cM 1.8cM cBR8-R15N23S Groupe VII-d Groupe VII-c Groupe VII-b Groupe VII-1 Locus

Insertion Réduction des recombinaisons

Impact de l’insertion sur les recombinaisons

(5)

Sh197G04 Sh15N23 Sh135P16 Sh142J21 haplotype V Sch253G12 Sh53A11

ShCIR9O20 ShCIR12E03 haplotype VII

haplotype II haplotype IV haplotype VI haplotype I haplotype III Hom(oe)ologo us sugarcan e haplot yp es Ortholog o us regions insertion Triplication Rice Chr2 Sorghum Chr4 11.1a 11.b D D B I I I B C C C E E E E E E E E J J J A B E D E E E K K H H H H H L L L L 10 Kb LTR retrotransposons Non LTR retrotransposons Transposons Genes (A, B, C, D, E, F, I, J) (G, H, K) (L) Proteinase inhibitor 11.1a Gap 2 Gap 1

Annotation des BAC et homologie de séquences

(6)

Sh22M6_CIR12E3

ShCIR9O20 Sh164H22 Haplotype cible

INSERTION

Identification des gènes candidats

S-T kinase

Division cellulaire

Fragment

de gène

S-T kinase

S-T kinase avec

_frameshift

candidate

.Homologie de séquence avec Rpg1 de l’orge : gène de résistance à la rouille

. 2 S/T Kinase en tandem

. Résistance stable dans le temps comme Bru1.

Gap 1 Gap 2

(7)

Objectifs de la thèse

1) Compléter la carte physique de la région de Bru1.

2) Tester les gènes candidats.

(8)

Compléter la carte physique

- Essai de PCR Long range

. Définition d’amorces tests sur le BAC CIR 9O20 pour amplifier 5 Kb, 10 Kb, 20 kb. Témoin d’amplification de 10 Kb maximum sur BAC.

. Définition d’amorces entourant l’espace entre les BAC CIR 9O20 et 22M6 Témoin d’amplification de 10 Kb maximum sur génomique.

Pas d’amplification.

(9)

Compléter la carte physique

- Espace entre CIR 9O20 et 22M6

. Gène NADP-dependent D-sorbitol-6-phosphate déshydrogénase (S6PDH) 2 familles : S6PDH11.a (jaune) et S6PDH11.b (orange)

Sh22M6_CIR12E3 ShCIR9O20 Sh164H22 Sh253G12 Sh142J21 Sh53A11 Sh135P16 Sh15N23 Sh197G04 Haplotype cible haplotypes hom(e)ologues INSERTION ? Sc1001

Pas de nouveaux BACs identifiés appartenant à l’haplotype cible.

Gap 2

(10)

Compléter la carte physique

- Espace entre CIR 12E3 et 164H22

Gène identifié comme étant une glucanase sur 5 haplotypes

Sh22M6_CIR12E3 ShCIR9O20 Sh164H22 Sh253G12 Sh142J21 Sh53A11 Sh135P16 Sh15N23 Sh197G04 Haplotype cible haplotypes hom(e)ologues INSERTION ?

Pas de nouveaux BACs identifiés appartenant à l’haplotype cible.

Gap 2 Gap 1

(11)

Compléter la carte physique

• Construction d’une nouvelle banque avec BamHI

Bru1

Banque BAC Clemson HindIII 103 000 BAC

1.3 X

Bru1

Banque BAC CIRAD HindIII 110 000 BAC

1.4 X

Recouvrement de la région cible = 1,3X + 2(1,4X) + 2(1.6X) = 7.3 X

Bru1

Banque BAC CIRAD BamHI 120 000 BAC

1,6 X

7 nouveaux BACs identifiés appartenant à l’haplotype cible.

(12)

Compléter la carte physique

(13)

Sh197G04 Sh15N23 Sh135P16 Sh142J21 haplotype V Sch253G12 Sh53A11

ShCIR9O20 ShCIR12E03 haplotype VII

haplotype II haplotype IV haplotype VI haplotype I haplotype III Hom(oe)ologo us sugarcan e haplot yp es Ortholog o us regions insertion Triplication Rice Chr2 Sorghum Chr4 11.1b 11.2 D D B I I I B C C C E E E E E E E E J J J A B E D E E E K K H H H H H L L L L 10 Kb LTR retrotransposons Non LTR retrotransposons Transposons Genes (A, B, C, D, E, F, I, J) (G, H, K) (L) Proteinase inhibitor

Régions où s’alignent les sondes Sc1002, Sc1012, Sc1032

11.1a

Gap 2 Gap 1

Marche sur chromosome

Région où s’aligne la Sc1002, Sc1012 et Sc1032

(14)

(15)

Test du gène candidat

• Gène de référence : Actine

Sorgho génomique R570 génomique cDNA R570 cDNA sensible

Taille attendue pour

cDNA

• Résultats avec les couples

d’amorces spécifiques.

R570 génomique cDNA R570 R570 génomique R570 génomique R570 génomique

pa cDNA R570 pa cDNA R570 pa cDNA R570 pa cDNA sensible pa cDNA sensible pa cDNA sensible pa cDNA sensible pa STK3 (347 pb) STK4 (504 pb) CDS : 297 pb STK5.1(413pb) CDS : 312 pb STK5.2 (11810 pb) CDS : 447 pb cDNA R570 jp cDNA R570 jp cDNA R570 jp cDNA R570 jp cDNA sensible jp cDNA sensible jp cDNA sensible jp cDNA sensible jp

• Définition de 5 couples d’amorce spécifiques.

• Extraction d’ARN puis RT-PCR.

(16)

Test du gène candidat

• Conclusion

- Amplification sur ADN génomique à la taille attendue.

- Pas d’amplification sur les cDNA.

-Collaboration avec un laboratoire Australien : transformation de canne à

sucre sensible pour tester notre gène candidat.

• Gène Rpg1 :

- Identifié dans une banque de 500 000 clones de cDNA : 3 clones

correspondaient à Rpg1.

- Exprimé constitutivement dans l’orge mais à un faible niveau

d’expression.

(17)

Origine de l’insertion

. R570 = cultivars modernes de canne à sucre . Hybride entre S. officinarum et S. spontaneum.

. Hypothèse testée : l’insertion proviendrait de S. spontaneum

. Criblage d’une collection de clones de Saccharum avec deux marqueurs PCR diagnostiques (9O20D11/RsaI, R12H16) :

- 72 clones S. officinarum. Espèce domestiquée - 31 clones S. spontaneum. Espèce sauvage

- 14 clones S. robustum. Espèce sauvage

- 10 clones S. barberi. Hybride naturel entre S. officinarum et S. spontaneum. - 8 cultivars modernes.

(18)

* Présence de S. officinarum non pure dans la collection (Jannoo et al, 2007. TAG).

- moitié des clones présentant les marqueurs : 5 clones sur 10.

S.officinarum S. spontaneum S. robustum S.barberi _hybridescultivars

Nombre d'accessions 72 31 14 10 8

Présence des marqueurs

9O20D11/Rsa1 et R12H16 13%* 13% 14% 80% 43%

Pour officinarum, 8 % des clones présentent les deux marqueurs. Origine de l’insertion

(19)

Bandjarmasin

Hitam Loethers

POJ 100 Kassoer

POJ2364

EK 28

POJ2878

Black

Cheribon Chunnee

POJ213 Kansar Co213 H 32/8560 Co214 RF 72 R31 R 445 R570 1 0 1 ND 0 0 0 1 0 0 1 1 ND 1 ND ND ND 1 Rouge : S. spontaneum Vert :S. officinarum

1 : marqueurs PCR présents (9O20D11/RsaI,

R12H16)

0 : marqueurs PCR absents (9O20D11/RsaI,

R12H16)

ND : Non Déterminés

M4600 Striped Mauritius

Saretha Spontaneum indien ?

1 ND ND ND Black Cheribon Glagah 0 _ND POJ100 EK02 0 0 Lahaina B.fiji 0 ND Croisement pour la nobilisation de la canne ?

Les résultats ne nous permettent pas de réfuter ou de confirmer notre hypothèse Origine de l’insertion