The role of Interleukin-6 in nervous regeneration and functional recovery in organotypic hippocampal slice cultures

Thesis

Reference

The role of Interleukin-6 in nervous regeneration and functional recovery in organotypic hippocampal slice cultures

HAKKOUM, David

Abstract

Le point commun des pathologies affectant le système nerveux central (SNC) des mammifères adulte est qu'elles aboutissent toutes à des pertes de fonction causées par des dommages qui sont le plus souvent irréversibles. Nous savons à présent que l'incapacité du SNC à recouvrer une activité fonctionnelle est principalement liée au fait que les pathologies conduisent souvent à une section des axones qui ne parviennent pas à régénérer. Par conséquent, l'étude et la compréhension des mécanismes de la régénérescence axonale constitue une thématique centrale de la neurobiologie. Le présent manuscrit s'inscrit dans cette perspective générale. Parmi ces mécanismes, la surproduction de l'interleukine-6 (IL-6) est très fréquemment corrélée aux traumatismes et maladies dégénératives du SNC. C'est la raison pour laquelle elle a fait l'objet de nombreuses études. Les conclusions de ces investigations sont loin d'être homogène (voire contradictoire), tant et si bien que l'on parle

"d'épée à double tranchant" pour évoquer cette cytokine. Toutefois, peu d'étude ont tenté de connaître le rôle [...]

HAKKOUM, David. The role of Interleukin-6 in nervous regeneration and functional recovery in organotypic hippocampal slice cultures. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2010, no. Sc. 4227

URN : urn:nbn:ch:unige-132226

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:13222

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:13222

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UNIVERSITE DE GENÈVE

Département de biochimie

Département de bioingénierie tissulaire

Professeur L.STOPPINI

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The Role of Interleukin-6 in Nervous Regeneration and Functional Recovery in Organotypic Hippocampal Slice Cultures

THESE

présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention Biochimie

par

David HAKKOUM

de Lyon (France) Thèse N

4227

Genève

Juin 2010

A toute ma famille,

À Mira, qui partage ma vie.

Remerciements

Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde gratitude au Docteur Luc Stoppini, pour m’avoir accueilli dans son équipe, pour sa patience et sa générosité et son optimisme qui est très contagieux. Mais je le remercie avant tout de m’avoir donné une formation ainsi que tout le matériel, les deux ayant grandement contribué à mener à terme cette thèse. Un grand merci au Professeur Dominique Muller de m’avoir accueilli dans son laboratoire et de m’avoir soutenu pour cette thèse qui n’aurait pas vu le jour sans son aide.

Je voulais remercier très chaleureusement Madame la Professeure Reika Watanabe Castillon ainsi que le Professeur Howard Riezman d’avoir assumé le rôle de directeur de cette thèse ainsi que le Professeurs Jean-Marc Matter et tout particulièrement Florianne Tschudi-Monnet d’avoir accepté d’être les membres du jury.

Ces remerciements s’adressent également à toutes les que j’ai pu rencontrer qui ont beaucoup compté dans ma formation: Sandrine Pouly, Chantal Alliod, Caroline Waltzinger et Rosy Bonfante, ainsi que Sebastien Wächsli lors de mon passage à SPRI (Serono). L’inoubliable Patrice Quintana avec qui j’ai eu l’immense joie de connaître une collaboration très étroite et fructueuse puisqu’ayant lors de notre premier papier et surtout pour les innombrables bons moments quotidiens.

Je tiens enfin à remercier les vrais amis que j’ai eu la chance de rencontrer au cours de mon aventure estudiantine: Il s’agit de John Donnelly Stephen Poplineau, Philippe Clerc, Alexis Couvreur, Omid Jamei, et surtout Camille Mary (pour son coaching efficace), pour tous les moments de joie et de fous rires. J’adresse mon immense reconnaissance à Bozi Areipour et Cyrille Moreau qui m’ont soutenu moralement et remotivé quand il y avait des coups de

« moins bien » et qui par conséquent ont joué une grande part dans la réalisation de ce manuscrit. Je ne l’oublierai jamais.

Ris, tout le monde rira avec toi.

Pleure, et tu seras le seul à pleurer.

TABLE OF CONTENTS

ABBREVIATIONS ...

RESUME DE THESE EN FRANCAIS ...

I.GENERAL INTRODUCTION ...

II. THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM ...

II.A. GENERALITIES ... 18

II.A.1 The human nervous system ... 18

II.A.2 The neuron ... 19

II.A.3 The Central nervous system environment ... 20

III. THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM REGENERATION

III.B THE REACTIVE SPROUTING VERSUS NERVOUS REGENERATION ... 24

III.C THE AXONAL GUIDANCE AND THE GROWTH CONE ... 27

III.C.1 The growth cone ... 27

III.C.2 The Growth associated protein-43 ... 32

III.D THE GLIAL INHIBITION AND THE INTRINSINC GROWTH STATUS ... 33

III.D.1 The glial inhibition of the central nervous system regeneration ... 33

III.D.2 The intrinsic growth status of CNS lesioned neurons ... 38

IV.THE INTERLEUKIN-6 AND CENTRAL NERVOUS

SYSTEM REGENERATION ...

IV.A. GENERALITIES ...

IV.B. THE CYTOKINES ...

IV.B.1. History of the cytokines and interleukins concept ... 42

IV.B.2 Nomenclature ... 43

IV.B.3Characteristics of the cytokines ... 44

IV.C. THE INTERLEUKIN-6 ...

IV.C.1 BIOCHEMISTRY OF IL-6 ...

IV.D SOMATIC FUNCTIONS OF IL-6 ...

IV.D.1 The cellular sources ... 54

IV.D.2 Cellular functions of IL6 ... 54

IV.E. ROLE OF IL-6 IN THE NERVOUS SYSTEM ...

IV.E.1 Resident brain cells sources of IL-6 ... 56

IV.E.2 Physiology and pathologies associated to IL-6 in CNS ... 56

IV.E.3 The Interleukin-6 in Central Nervous System regeneration and sprouting ... 59

IV.F. THE ORGANOTYPIC HIPPOCAMPAL SLICE CULTURES ...

IV.F.2 The hippocampus ... 61

IV.F.3 The organotypic hippocampal slice cultures... 62

IV.F.4 The organotypic hippocampal slice cultures and nervous regeneration/sprouting ... 63

V. RESULTS AND METHODS ...

V.A. ELECTROPHYSIOLOGICAL MONITORING OF HIPPOCAMPAL

SLICE CULTURES USING MEA ON POROUS MEMBRANE ...

V.B. NEUTRALIZATION OF THE MEMBRANE PROTZEIN NOGO-A ENHANCES GROWTH AND REACTIVE SPROUTING IN ESTABLISHED ORGANOTYPIC HIPPOCAMPAL SLICE CULTURES ...

V.C. INTERLEUKIN-6 PROMOTES SPROUTING AND FUNCTIONAL RECOVERY IN LESIONED ORGANOTYPIC HIPPCAMPAL SLICE

CULTURES ...

VI. CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES ...

VII. REFERENCES CITED ...

ABBREVIATIONS

APP: Acute-Phase Proteins APR: Acute Phase Response Arp2/3: Actin related protein 2/3 BBB: Blood Brain Barrier

BDNF: Brain Derived Neurotrophic Factor CAM: Cell Adhesion Molecule

CAP-23: cytoskeleton-associated protein of 23kDa CBM: cytokine binding module

Cdc42: Cell-division cycle 42 CNS: Central Nervous System DRG: Dorsal Root Ganglion CAM: Cell Adhesion Molecule

CREB: cAMP Responsive Element Binding Protein CSF: Colony Stimulating Factors

CSPG: Chondroitin Sulfate Proteoglycans CT-1: Cardiotrophin-1

ECL: Entorhinal Cortex Lesion ECM: Extracellular Matrix Molecule ERK: Extracellular signal-related kinase FN: Fibronectin

GAP: GTPase Activating Protein GAP-43: Growth Associated Protein-43 GC: Growth Cone

GDNF: Glial Derived Neurotrophic Factor GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor GFAP: Glial Fibrillary Acid Protein

GFP: Green Fluorescent Protein gp130: Glycoprotein 130

GPA: Growth Promoting Activity GTP : Guanine Triphosphate IL-6: Interleukin-6

ABBREVIATIONS

IL-6R: Interleukin-6 Receptor

JAK: Janus Associated Kinase or Just another kinase kDa: kiloDalton

KO: Knockout

LIF: Leukaemia Inhibitory Factor LIMK: LIM kinase

LPS: Lipopolysaccharide

MAG: Myelin Associated Glycoprotein MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MEA: Multi-Electrode Array

MIF: Macrophage Migration Inhibitory Factor NeuN: Neuronal Nuclei

NGF Nerve Growth Factor Ngr: Nogo receptor

NMDA: N-Methyl-D-Aspartate

OHSC: Organotypic Hippocampal Slice Cultures OMgp: Oligodendrocyte myelin glycoprotein OSM: Oncostatin-M

PC12: Pheochromocytome12

Rac1: Ras related C3 botulinum toxin substrate 1 Rho A: Ras homolog member A

ROCK: Rho-associates Coiled-coil forming Kinase

RT/PCR: Reverse Transcription/Polymerase Chain Reaction sIL-6Rα: Soluble IL-6 Receptor alpha

SCI: Spinal Cord Injury

SCL: Schaffer Collateral Lesion

STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription TNF-α: Tumor Necrosis Factor-alpha

YFP: Yellow Fluorescent Protein

RÉSUMÉ DE THESE EN FRANÇAIS

I. Introduction

Le point commun des pathologies affectant le système nerveux central (SNC) des mammifères adulte est qu’elles aboutissent toutes à des pertes de fonction causées par des dommages qui sont le plus souvent irréversibles. Par exemple, une personne dont la moelle épinière est sectionnée, suite à un accident de la route, ne remarchera jamais. Nous savons à présent que l’incapacité du SNC à recouvrer une activité fonctionnelle est principalement liée au fait que les pathologies conduisent souvent à une section des axones qui ne parviennent pas à régénérer. Par conséquent, l’étude et la compréhension des mécanismes de la régénérescence axonale constitue une thématique centrale de la neurobiologie. Le présent manuscrit s’inscrit dans cette perspective générale.

La question de savoir pourquoi les axones centraux ne repoussent pas (ou peu) commence néanmoins à trouver quelques explications. En effet, c’est au cours des années 1980, qu’il a été démontré que l’absence de repousse axonale est en fait imputable à l’inhibition exercée par des molécules qui sont exprimées (de façon constitutive ou consécutivement à une situation pathologique) par les autres cellules résidentes du CNS, les cellules gliales. Ainsi, l’absence de néoaxonogénèse est actuellement perçue comme un déséquilibre entre les signaux inhibiteurs exercée par le microenvironnement neuronal et la capacité intrinsèque des neurones (qui peut être déterminée par des facteurs externes au neurone) qui serait pourtant conservée pendant la période post-natale. Ces découvertes ont permis d'initié l’isolation de plusieurs de ces molécules inhibitrices et de leurs récepteurs ainsi que leur mode d’action offrant, par la même, des stratégies thérapeutiques potentiellement très prometteuses.

Cependant, si ces récentes avancées ont permis d’ajouter une dimension supplémentaire au problème de la régénérescence axonale, ce dernier est encore loin d’être totalement résolu. En effet, de nombreux processus et facteurs, qui sont initiés par le traumatisme initial même, ont été investigués plutôt en termes d’effet sur la survie des neurones qu’en termes d’impact direct sur la repousse axonale des neurones. Parmi eux, figure le processus d’inflammation qui est une des composantes les plus récurrentes d’un état pathologique. De façon très intéressante, nous savons à présent que l’encéphale est capable de présenter les caractéristiques types de l’inflammation et ce via ses propres cellules résidentes. Ce processus appelé « neuroinflammation » intervient très rapidement et comprend de nombreuses réactions cellulaires comme une activation des cellules

gliales (notamment la microglie et les astrocytes) combinée à la production de molécules telles que les cytokines, comme les cytokines proinflammatoires qui sont des molécules que l’on retrouve dans l’inflammation systémique.

Parmi ces dernières, l’interleukine-6 (IL-6) est probablement l’une des plus fréquemment corrélées aux traumatisme et maladies dégénératives du SNC. C’est la raison pour laquelle elle a fait l’objet de nombreuses études dont le but était d’établir un lien de causalité entre l’IL-6 et un état pathologique donné. Plus précisément, ces études visaient à savoir si IL-6 jouait un rôle neuroprotecteur ou neurodestructeur. Les conclusions de ces investigations sont loin d’être homogène (voire contradictoire). Tant et si bien que l’on parle d’«épée à double tranchant » pour évoquer l’interleukine-6. Toutefois, peu d’étude ont tenté de connaître le rôle direct d’IL-6 sur la régénérescence axonale et le recouvrement fonctionnel de tissus lésés ce qui constitue précisément l’objectif précis de la présente thèse.

Pour répondre à cette question nous avons étudié la régénérescence nerveuse de tranches organotypiques d’hippocampe qui ont été mécaniquement hémi-sectionnées. La mesure de la repousse axonale a été évaluée par la combinaison de diverses techniques telles que l’électrophysiologie via l’utilisation de réseaux d’électrodes multiples, par la mesure biochimique de marqueurs associés à la croissance axonale, et par l’imagerie confocale sur des tissus provenant de souris transgéniques et dont les neurones exprimaient une protéine fluorescente.

II. Etat de l’art

Si les vertébrés supérieurs, et en particulier l’espèce humaine, peuvent se prévaloir d’être dotés de capacités cognitives les plus vastes et complètes par rapport aux autres espèces, elle le doit à un système nerveux central (SNC) dont l’architecture, l’organisation et le fonctionnement sont d’une infinie complexité. Notre SNC qui comprend l’encéphale et la moelle épinière, est, en effet, composé de milliards de neurones qui constituent l’unité fonctionnelle du système nerveux. Ces derniers sont organisés en une multitude d’assemblées interconnectées qui forment ainsi un câblage incroyablement complexe.

Cependant, loin de cette fascination béate il existe un constat cruel puisque quasiment sans appel qui peut s’énoncer comme suit: les pathologies du SNC adulte comme des lésions de la moelle épinière, l’ischémie cérébrale, les maladies neurodégénératives comme Alzheimer ou encore la

maladie de Parkinson, aboutissent toutes à des dommages qui sont très souvent irréversibles. En d’autres mots, le SNC est très vulnérable aux pathologies et possède surtout une capacité de recouvrement fonctionnel extrêmement limitée. Nous savons aujourd’hui que ce deuxième aspect est rendu compte par deux faits. Le premier est que le processus de neurogénèse est quasiment absent chez les mammifères. Cette absence de renouvellement cellulaire peut quelque fois être compensée par un « bourgeonnement collatéral» d’axones de neurones intacts mais ce processus s’avère être largement très limité, surtout en cas de traumatisme sévère comme les lésions de la moelle épinière (Cafferty et al. 2008).

Le deuxième aspect est que les neurones échappant à la mort cellulaire présentent un axone sectionné qui ne repousse qu’à des distances infiniment courtes ce qui a pour conséquence une perte du nombre de connexions synaptiques et donc une perte définitive de fonction. En d’autres termes, la perte de fonction des neurones adultes du SNC engendrée par une lésion est rendue compte par le fait qu’ils présentent une inaptitude à effectuer les processus de régénérescence axonale et de reconnexion synaptique subséquente. Il apparait donc clairement que comprendre la problématique de la régénérescence nerveuse est une question cruciale en vue de perspectives thérapeutiques.

C’est, de manière générale, la thématique principale abordée dans manuscrit.

Le cône de croissance

Pour appréhender les ressorts de la régénérescence axonale il est important de comprendre les mécanismes mis en jeu lors du développement du système nerveux. Car la régénération désigne, ni plus ni moins, une inaptitude à récapituler les processus de croissance et de guidance axonale et de synaptogénèse se déroulant lors de l’embryogénèse. En termes mécanistiques, les processus combinés de croissance et de guidance permettant la mise en place du câblage axonale est assurée par une structure sensori-motrice clé qui est localisée à l’extrémité de l’axone, le «cône de croissance ». Plus précisément, le cône de croissance est équipé de récepteurs dont le rôle est d’intégrer les différents signaux chimiques rencontrés que sont: les facteurs neurotrophiques comme le NGF (pour Nerve Growth Factor) et les molécules chemoattractives ou chémorépulsives.

Le cône de croissance initie ensuite la transduction de ces signaux, via une voie de signalisation spécifique, mettant en jeu RhoGTPases, connues pour agir sur la dynamique cytosquelettique (en interaction avec les molécules de la matrice extracellulaire) qui est elle-même responsable de l’extension ou de la rétraction des cônes de croissance (Dent & Gertler 2003, Luo 2002, Kalil &

Pendant la période post-natale, ces cônes de croissance ont été observés et ils sont localisés à l’extrémité des axones lésés. Cependant ils présentent un aspect « dystrophique » ce qui laissait initialement penser qu’ils étaient la résultante d’une accumulation de matériels cytoplasmiques et par conséquent non fonctionnels. Cette idée semble, par ailleurs, confortée par la mise en évidence de protéines dites « associées à la croissance » comme GAP-43 (pour growth associated protein- 43). GAP-43 est localisée dans les cônes de croissance et exprimée par tous axones en train de croitre. De plus, l’expression de GAP-43 disparait progressivement chez les neurones post-nataux et réapparait uniquement chez la très faible population de neurones ayant régénéré (Skene &

Willard 1981). Ces travaux menés sur GAP-43 suggèrent assez fortement que l’absence de repousse axonale chez les neurones matures est plutôt due à la perte progressive de leur propre capacité à ré- exprimer des facteurs associés à la repousse axonale. En d’autres termes, la non-régénérescence est uniquement lié au vieillissement des neurones.

L’inhibition gliale de la régénérescence axonale des neurones centraux

Ce concept a été brusquement remis en cause au début des années 1980. Il se trouve, en effet, que la capacité de repousse axonale des neurones du système nerveux périphériques (SNP) est, quant à elle, conservée jusque très tard dans la vie d’un individu. En partant de cette observation David et Aguyao ont eu l’idée de fournir à des neurones centraux lésés des segments nerveux issus du SNP qui faisaient office de pont. Par cette expérience de greffe, ils ont mis en évidence que les axones traversaient le pont périphérique et stoppaient leur croissance dés qu’ils entraient en contact avec leur environnement d’origine (David & Aguayo 1981). Ainsi, ils démontrèrent que si les axones lésés issus du SNC évoluent dans un environnement périphérique, ils sont capables de repousser.

Autrement dit l’environnement des neurones du SNC, lorsqu’il est considéré dans sa globalité, exerce une activité inhibitrice sur la régénérescence axonale. En fait, l’environnement cellulaire des neurones adultes centraux diffère de celui du SNP et du SNC prénatal. Plus exactement, il est composé des cellules gliales que sont les astrocytes, les oligodendrocytes et la microglie qui prolifèrent et se différencient durant la vie post-natale amenant par conséquent un changement progressif mais radical dans l’environnement des neurones. Le concept d’ « inhibition gliale de la régénérescence axonale » était donc né.

Ce nouveau paradigme initia donc la recherche de l’identité des facteurs moléculaires et leurs mécanismes sous-tendant ce processus. C’est donc à partir des années 1990 que des facteurs environnementaux inhibiteurs ont été isolés. Ces derniers sont exprimées par les cellules gliales.

Certains de ces facteurs se sont révélés être d’origine oligodendrocytaire ou myélinique. Le plus connu d’entre eux étant Nogo-A, une molécule localisée dans la myéline et qui fut isolée par Martin Schwab en 1990. La neutralisation de Nogo-A à l’aide d’un anticorps spécifique s’est révélée promouvoir la régénérescence axonale de neurones spinaux de rat (Schnell & Schwab 1990).

D’autres sont d’origine astrocytaire et sont surexprimés en réaction à une lésion. En effet, consécutivement à une lésion, les astrocytes se multiplient et migrent vers le site de lésion formant une cicatrice astrocytaire qui est connue pour jouer un rôle globalement néfaste au regard de la régénération (Morgenstern et al. 2002). Dans le même temps ces astrocytes réactifs sur expriment des molécules appartenant à la famille des chondroïtine sulfate et dont la digestion enzymatique favorise la repousse axonale (Davies et al. 1997).

Les récepteurs neuronaux de ces inhibiteurs transduisent le signal inhibiteur via la voie des GTPases Rho-A. Ces GTPases activent à leurs des kinases, les Rho kinases (ROCK) qui favorisent la dépolymérisation de l’actine provoquant ainsi l’effondrement du cône de croissance et par conséquent l’arrêt de la repousse axonale (Filbin 2003). Par ailleurs, il a été montré que si la protéine kinase-A (PKA) était activée (via l’AMPcyclique, ou un facteur de croissance) avant que les neurones soient lésés, la repousse axonale se produisait comme s’ils « ignoraient » l’environnement inhibiteur (Cai et al. 1999). En effet, la PKA inactive les GTP ases RhoA. Cela signifiait que l’état intrinsèque des neurones au moment de la lésion déterminait également sa repousse subséquente.

C’est pourquoi, le mode de pensée qui oriente la recherche et la réflexion scientifique actuelle est que la limitation de la repousse axonale du SNC est le fruit d’un déséquilibre entre les capacités intrinsèques des neurones, qui sont plus ou moins conservées au cours de la vie post-natale, et d’un environnement qui exerce une inhibition sur cette repousse.

L’ensemble de ces avancées concernant ces inhibiteurs, leur récepteurs ainsi que leur voie de signalisation (la voie des ROCK kinases) ont d’hors et déjà permis d’envisager des stratégies thérapeutiques. L’anti-Nogo, par exemple, semble efficace non seulement chez le macaque dont les nerfs cervicaux sont lésés (Freund et al. 2006) mais est aussi actuellement testée en d’essais cliniques (Schwab et al. 2006). Cependant, la problématique de la repousse axonale des neurones centraux apparait loin d’être totalement comprise. En effet, les composantes de l’inhibition ciblées sont souvent « modèle-spécifiques » et s’avèrent souvent efficaces in vitro et non in vivo (Ruff et al.

2008).

Rôle de l’interleukine-6 sur la repousse axonale des tranches organotypiques d’hippocampe

Disséquer les évènements cellulaires et moléculaires post-lésionnels est d’une importance cruciale en vue d’appréhender la régénérescence nerveuse. Parmi ceux-ci figurent les évènements moléculaires et cellulaires qui sont initiés par le traumatisme initial et qui sont susceptibles d’aboutir à des dommages dits « secondaires » (Lu et al. 2000). Ces réactions aboutissant aux dommages secondaires sont d’une extrême complexité car elles sont à la fois sont multiples, souvent interdépendantes et possèdent de surcroit un pattern d’expression temporel bien défini.

Parmi ces composantes, figure le processus de d’inflammation qui a longtemps été considéré comme étant l’apanage de tous les tissus à l’exception du cerveau. De manière générale, l’inflammation est la réponse cardinale de défense d’un organisme en réponse à un traumatisme ou à un agent infectieux. A l’échelle de l’organisme elle se caractérise par l’enflure de tissus, des rougeurs, de la fièvre et des douleurs. En termes mécanistiques, l’inflammation comporte l’invasion des tissus malades par les cellules circulantes du système immunitaire telles que les lymphocytes et les macrophages ainsi que l’induction de médiateurs inflammatoires tels que les radicaux libres et également des cytokines (Streit et al. 1999).

Pendant longtemps on a pensé que le système nerveux était dépourvu de la capacité à générer les processus inflammatoire. Cette idée a radicalement changé. En fait, en réponse à une pathologie ou un traumatisme, le cerveau est capable de présenter très rapidement (à l’échelle de l’heure voire de la minute) de nombreuses caractéristiques de l’inflammation systémique et cela avant même que les leucocytes envahissent le parenchyme cérébral. Cette « neuroinflammation » comprend une cascade de réactions cellulaires comme débutent par une activation des cellules microgliales (Lucas et al.

2006). Plus précisément, une fois activées, les cellules microgliales et astrocytaires sécrètent une variété de molécules dont les cytokines qui participent à l’orchestration de nombreuses réactions cellulaires et moléculaires responsables de l’inflammation (Munoz-Fernandez & Fresno 1998). Ces cytokines sont nommées « cytokines proinflammatoires ». Par conséquent, étudier la contribution individuelle de ces cytokines proinflammatoires aux mécanismes post-lésionnels est donc un enjeu majeur en vue de comprendre les mécanismes pathophysiologqiues du SNC.

Une des cytokines proinflammatoires que l’on retrouve le plus souvent dans les pathologies du SNC est l’interleukin-6 (IL-6) . Au niveau biochimique, IL-6 est une glycoprotéine de 21-28 kiloDaltons (kD) (Fuller et al. 1987). IL-6 possède deux récepteurs, un de 80kD (gp80 ou IL-6Rα) sur lequel IL-6 se fixe uniquement (ce récepteur existe également sous forme soluble ce qui permet de stimuler les cellules qui sont dépourvues de la forme membranaire d’IL-6R). Un autre récepteur, le

gp130 (glycoprotéine de 130 kD), qui lie le complexe IL-6/ IL-6Rα, et qui est responsable de la transduction du signal (Kamimura et al. 2003). Les voies de signalisation activées par l’IL-6 sont les voies des ERK/MAPKinases et JAK/STAT d’où par ailleurs la mise en évidence d’effets physiologiques contradictoires d’IL-6 sur un processus donné (Fukada et al. 1998).

IL-6 est une molécule pléiotropique car connue pour jouer un rôle dans de nombreux processus physiologiques comme l’hématopoïèse, le métabolisme osseux, le système endocrinien, l’inflammation systémique (Kamimura et al. 2003). Dans le cerveau, IL-6 et son récepteur sont exprimés localisés dans de nombreuses structures et aires cérébrales dont, l’hippocampe, le cervelet, le striatum (Gadient & Otten 1994a) . Au niveau cellulaire, ils sont exprimés par les toutes les types cellulaires du cerveau. Dans des conditions physiologiques, le niveau d’expression d’IL-6 reste très faible. En revanche, dans la plupart des pathologies du CNS comme l’ischémie cérébrale, les traumatismes crâniens, la maladie de Parkinson, Alzheimer, les tumeurs, les lésions de la moelle épinière, la sclérose en plaque, le niveau d’IL-6 augmente considérablement. C’est pourquoi, IL-6 est connue pour être un marqueur d’un état pathologique donné. Ainsi un nombre important d’études visant à connaitre sa contribution exacte dans les atteintes fonctionnels du système nerveux central ont été entreprises. Les résultats et conclusions de celles-ci sont très souvent discordants quant à l’effet d’IL-6 sur la survie neuronale. C’est la raison pour laquelle IL-6 est qualifiée de

« épée à double tranchant » (Gadient & Otten 1997).

Si l’IL-6 a fait l’objet de nombreuses investigations concernant son impact final sur la mort cellulaire, peu d’études se sont posées la question de savoir si IL-6 pouvait agir sur la repousse axonale et le recouvrement de l’activité fonctionnelle. C’est précisément le travail entrepris au cours de cette thèse. Pour se faire, nous avons étudié l’effet d’IL-6 sur la repousse d’axones sectionnés en utilisant des tranches organotypiques d’hippocampe de souris. En effet, les tranches organotypiques sont connues pour être des modèles valables pour l’étude de l’inflammation chronique car les cellules résidentes, qui sont toutes conservées, maintiennent leur capacité à produire et répondre à l’IL-6 (Pizzi et al. 2004, Huuskonen et al. 2005).

III. Résultats et méthodes

Ce travail de recherche mené sur la régénérescence, a fait l’objet de la publication de trois papiers.

Le premier d’entre eux, Electrophysiological Monitoring of Hippocampal Slice Cultures using MEA on Porous Membrane (Hakkoum et al, 2005) est un des chapitres d’un livre (Recent Advances in Network Electrophysiology) dédié à l’électrophysiologie réalisée sur réseaux d’électrodes multiples (MEA, pour Multi Electro Array). Dans ce chapitre, nous avons exposé les possibilités techniques offertes par l’appareillage électrophysiologique que nous utilisons en routine pour enregistrer l’activité électrique extracellulaire des tranches organotypiques. Cet outil permet d’enregistrer simultanément les potentiels de champs des neurones du tissu à huit sites différents (chacune enregistrant l’activité de populations de neurones) en sélectionnant huit électrodes parmi les quarante du MEA. Les enregistrements s’effectuent dans des conditions proches de celles d’un incubateur à CO2 (stérilité et température contrôlée) et permettent de suivre l’activité fonctionnelle de tissus entiers jusqu’à plusieurs jours. Lors des sessions d’enregistrements nous stimulons les neurones de CA3 et enregistrons l’activité évoquée en CA1. Les amplitudes de ces réponses évoquées sont hautement stables au cours du temps (en condition contrôle) permettant de mener des expériences pharmacocinétiques (temps d’action, effet maximum de la molécule ainsi que sa réversibilité) que nous illustrons avec des bloqueurs spécifiques de l’activité électrique. Dans une des sections figure également le paradigme expérimental mis au point au cours de cette thèse pour mesurer le recouvrement fonctionnel des tissus après leur lésion ainsi que le profil comparé de recouvrement fonctionnel à deux âges différents. Ce protocole consiste à, dans un premier temps, enregistrer l’activité évoquée initiale de tissus à l’aide d’un MEA. Lors de cette première session d’enregistrement, quatre électrodes enregistrent l’activité en CA3 et, quatre autres celles des neurones de CA1. Une photo du positionnement de la tranche est prise. Puis le tissu est placé sur un réseau d’électrode collé sur un pétri de façon à respecter sa position initiale lors de l’enregistrement.

La lésion est réalisée à l’aide d’une lame de rasoir entre les groupes d’électrodes. A la seconde session d’enregistrement de l’activité évoquée, le tissu est replacé dans la chambre d’enregistrement. Lors de l’analyse, le ratio des amplitudes (avant et après lésion) des activités pour les deux pools d’électrodes est établi. Le ratio des activités évoquées en CA3 indique la toxicité éventuelle d’une molécule et le ratio des activités en CA1 indique la repousse/bourgeonnement. Avec ce protocole, l’expérimentateur enregistre les mêmes régions avant

et après lésion et peut savoir si une absence de repousse est due à une toxicité de la molécule testée.

C’est avec cette méthode que nous avons établi le profil de récupération fonctionnel chez des tranches organotypiques de souris ce qui constitue la base de travail de ce projet de recherche.

Le deuxième papier, Neutralization of the membrane protein Nogo-A enhances growth and reactive sprouting in established organotypic hippocampal slice cultures, est le fruit d’une collaboration menée avec le Docteur Luis Craveiro travaillant au sein du laboratoire du Martin Schwab (Craveiro et al. 2008). Schnell et Schwab avaient auparavant démontré que Nogo-A est un inhibiteur myélinique de la repousse axonale (Schnell & Schwab 1990). A l’époque cette étude avait été réalisée à l’aide d’un anticorps spécifique (IN-1) neutralisant l’antigène Nogo après section des faisceaux d’axones de la voie corticospinale chez le rat. Le but principal de ce papier était de savoir si Nogo-A exerce son activité inhibitrice au sein du CNS non lésé et/ou uniquement après une section des axones de neurones centraux. Pour ce faire nous avons neutralisé Nogo-A à l’aide d’un anticorps monoclonal, dont l’antigène est la partie 11C7 du domaine inhibiteur Nogo- 66 de Nogo-A (Liebscher et al. 2005). Cette étude fut réalisée dans deux conditions : sur des tissus non lésés et des tissus lésés (condition contrôle). Ma contribution personnelle fut de mesurer le recouvrement fonctionnel de tissus lésés et également non-lésés (contrôles), en utilisant la méthode décrite dans le premier papier. Nous avons également procédé, par western-blot, à l’analyse du contenu GAP-43/βactine des tissus enregistrés (trois expériences indépendantes). Par l’électrophysiologie nous avons mis en évidence que l’application de l’anti-11C7 améliore considérablement la récupération fonctionnelle des tissus lésés (environ 70% de l’activité initiale versus 30% pour le groupe control, IgG) sans qu’il y ait de différence dans le niveau d’activité enregistré en CA3. On observe, en parallèle, un plus grand contenu en GAP-43/βactine chez les tissus traités avec l’anti-11C7. Le marquage présence de marquage GAP-43 en CA1 mis en évidence par immunohistochimie confirme ce dernier résultat. En revanche, chez le groupe non lésé aucune différence n’apparait pour les deux paramètres mesurés. Cependant des différences de marquage très nettes apparaissaient quand on mesure le contenu de protéines du cytosquelette axonale comme NF-68(Neurofilament-68) et MAP-2 (Microtubule Associated protein).

La conclusion générale de ces travaux est que Nogo-A exerce son activité inhibitrice de façon tonique dans le système nerveux adulte. Une autre conclusion, même si elle apparaît plus accessoire, est que les tranches organotypiques possèdent un pouvoir prédictif élevé de l’effet d’une molécule testée in vivo.

Le dernier papier, Interleukin-6 Promotes Sprouting and Functional Recovery in lesioned Organotypic Hippocampal Slice Cultures, est le papier principal de ce travail de recherche (Hakkoum et al. 2007).

Ce travail débuta par un travail de validation de l’utilisation de tranche de souris dans un modèle de régénérescence axonale/sprouting qui avait déjà été mis au point chez le rat (Stoppini et al. 1993).

Tout comme chez le rat nous avons mis en évidence que le profil de récupération fonctionnelle des tranches de souris était âge-dépendant (une versus trois semaines in vitro).

Comme base de travail, nous avons établi la cinétique comparée de libération d’IL-6 dans le surnageant au cours des trois premiers jours après la lésion chez des tranches lésées versus non- lésées. La mesure s’est effectuée par ELISA. En situation de lésionnelle, la libération d’IL-6 après lésion apparaissait beaucoup élevée que la situation contrôle puis atteint une valeur contrôle au troisième jour. Nous avons donc procédé à deux expériences miroirs l’une de l’autre : bloquer, à l’aide d’un anticorps neutralisant, ou fournir de l’IL-6 aux tissus. Les effets de ces traitements étaient mesurés par western-blot de GAP-43, NeuN (et la β-actine comme control) et par l’enregistrement des potentiels évoquées à l’aide des MEAs. La partie technique la plus difficile était de visualiser les fibres. En effet, l’épaisseur des tranches d’hippocampe empêche souvent la pénétration des anticorps primaires comme GAP-43 (...) Ce problème a été « contourné » grâce une expérience de coculture entre des semi tranches CA1 issues d’une lignée de souris dont tous les neurones expriment le gène GFP (Feng et al. 2000) et semi-tranches CA1 issues de souris de type sauvage. Il était possible, à l’aide de l’imagerie confocale, de visualiser, et suivre dans les temps, les fibres traversant le site de lésion. Ultérieurement l’intensité de fluorescence en CA1 était mesurée.

A la lumière de l’ensemble de ces paramètres mesurés nous en avons conclut que l’IL-6 s’avère être une molécule favorisant purement la repousse axonale (et/ou le sprouting) et non la survie de neurones. Dans cette revue, la discussion de l’article porte essentiellement sur le mode d’action théorique d’IL-6.

IV. Conclusions

En moins d’un siècle, des étapes décisives ont été franchies dans la compréhension des mécanismes de la régénérescence axonale. La recherche dans ce domaine a été ponctuée de découvertes majeures qui nous ont fait passer du constat d’impuissance au sentiment d’espoir.

La règle générale qui s’est dégagée est que non-régénérescence est qu’elle est liée à la perte du statut intrinsèque des neurones du SNC à régénérer (comme la diminution de l’AMPc) qui se combine à une action inhibitrice de l’environnement. Cette inhibition peut être de deux natures. Elle peut être tonique, comme celle exercée par Nogo-A (Craveiro et al. 2008), c'est-à-dire que celle-ci s’exerce de façon permanente garantissant ainsi la stabilité d’un câblage axonale en condition normale. Ou encore, elle est post-lésionnelle donc réactionnelle, comme l’expression de chondroïtin sulfate par les astrocytes réactifs se trouvant sur le site de lésion et formant une cicatrice.

Cette problématique était, et est, encore d’une complexité extrême. Une des raisons est que, en fonction du modèle expérimental l’absence de régénérescence nerveuse peut être plutôt liée à la composante « perte de capacité intrinsèque » qu’à la composante « inhibition gliale » et vice versa.

La deuxième raison, est qu’elle implique un nombre considérable de cellules, de molécules avec, pour chacune, des fenêtres temporelles d’action spécifique et qui varient en fonction du type de pathologie et de leur intensité. L’inflammation, qui est une réaction très rapide et cardinale de l’organisme en réponse à une atteinte de son intégrité fonctionnelle, en est le parfait exemple. Nous savons maintenant que le cerveau, via ses propres cellules, est capable d’orchestrer cette réaction, c’est le processus de neuroinflammation. Cette réaction impliquant des réactions moléculaires dont la production de cytokine proinflammatoires comme l’interleukin-6.

Etant donné l’implication d’IL-6 dans les pathologies du SNC il est capital de comprendre son rôle dans les pathologies du SNC. Ceci a été réalisé mais avec des paradigmes expérimentaux mettant en jeu la mort cellulaire et non la repousse axonale.

C’est la question à laquelle nous avons tenté de répondre au cours de ce travail de thèse. Pour ce faire nous avons utilisé des tranches organotypiques d’hippocampe de souris. En effet, les cultures organotypiques d’hippocampe constituent une technologie in vitro actuellement très utilisées pour investiguer les mécanismes pathologiques du SNC car combinant les avantages techniques de l’in vitro et une complexité proche de l’in vivo (Hakkoum et al. 2008, Noraberg et al. 2005). A ceci s’ajoute qu’elles conservent de très nombreuses caractéristiques fonctionnelles, morphologiques, structurales, développementales, ainsi que tous les types cellulaires du SNC de l’animal (Stoppini et al. 1991, Buchs et al. 1993). Par conséquent les tranches organotypiques d’hippocampe constituent

un modèle relevant pour étudier les mécanismes régénérescence axonale et/ou de bourgeonnement collatéral. Le protocole consiste à sectionner mécaniquement un faisceau d’axones, les collatérales de Schäffer, des neurones pyramidaux localisés en CA3 et qui établissent des contacts synaptiques avec l’arborisation dendritique des neurones pyramidaux localisés en CA1. En utilisant ce modèle, il a été établi qu’il existe une perte de la capacité des neurones de CA3 à reconnecter les dendrites de CA1 au fur et à mesure de leur maturation (Stoppini et al. 1993). Postérieurement, il fut montré qu’en fournissant à des neurones matures CA3 un environnement contenant les neurones de CA1 d’un âge moins avancé, la repousse axonale était considérablement améliorée (Stoppini et al. 1997).

Cette expérience démontra que l’inhibition gliale est la principale responsable du déclin des tranches à régénérer. Cette conclusion a été confortée au cours de ce travail de recherche avec l’étude de la repousse axonale en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine Nogo-A.(Craveiro et al. 2008). C’est donc avec un modèle in vitro dont le pouvoir prédictif est élevé que nous avons mesuré l’effet d’IL-6.

Pour ce faire nous avons fait appel et développer plusieurs approches et technologies complémentaires. Par exemple, la mesure de courants extracellulaires en utilisant des MEAs qui a été combiné à la mise au point d’un protocole expérimentale permettant d’obtenir des données très précises. Des mesures biochmiques comme l’ELISA et la mesure de protéines spécifiques de la repousse axonale, comme GAP-43 et également, des expériences de coculture en utilisant des souris transgéniques dont les neurones expriment de la fluorescence (GFP). En définitive, à travers l’étude d’IL-6, nous avons développé des outils et méthodes permettant d’acquérir un maximum d’informations fiables sur un même tissu au cours du temps.

Finalement, nous avons montré qu’IL-6 exerce une action bénéfique sur la repousse axonale et le recouvrement d’activité fonctionnelle. Etant donné l’implication d’IL-6 dans les maladies nerveuses, cette mise en évidence est d’importance. C’est pourquoi la question de savoir comment IL-6 exerce cette action prorégénératrice est une question à laquelle nous n’avons pas répondu mais qui mérite de l’être dans le futur.

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I.GENERAL INTRODUCTION

The word “generation” reports to the creation of all existing items in the universe. This notice alone exposes the task that the neurobiology in the nervous regeneration field is facing: nothing else than realizing a divine act! This purpose is exaggerated since most of our tissue like the skin, the muscles or the liver is able to spontaneously repair after having been damaged. However it is not extreme concerning the adult central nervous system (CNS) neurons in “superior” vertebrates.

Illustration 1. The Edwin Smith surgical papyrus.

The earliest known reference to CNS injury is from an Egyptian text written about 2500 B.C. “When you examine a man with a dislocation of a vertebra of his neck, and you find him unable to move his arms, and his legs…Then you have to say: a disease one cannot treat” (from Case & Tessier-Lavigne 2005 ).

Among all organs of our body, the nervous system and more precisely its central subdivision is probably the most complex from an anatomical and physiological point of view. Indeed it treats and generates information from the extra and intra-corporal environment; it is the seat of the cognitive functions like the learning and the memory, the speech, the movement etc. In brief it is in charge with functions that are essential given that they ultimately permit to act in an appropriate manner on our natural and social environment. But such a high complexity possesses its counterpart: once the neurons that composed the CNS are injured they are unable to regenerate leading subsequently to a definitive loss of function. This observation is simple but unfortunately still remains of actuality;

the nervous system regeneration problematic is far to be understood and by consequence to be solved. Therefore several workers on this field, like Fry, wonder if the regeneration of neurons of the central nervous system is simply not else than a “mission impossible” (Fry 2001).

II. THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

II.A. GENERALITIES

II.A.1 The human nervous system

One aspect that distinguishes low vertebrates from mammals, and particularly mankind, is their capacity to perform highest cognitive functions including learning, memory language and to generate subtle sensory-motor transformations according to various and complex stimuli. These highly complex functions, as well as more basic ones, such as the homeostasis of physiological parameters (e.g. glycemia, thermic regulation), lies on a precise nervous system organization and physiology that are still not fully understood. However at the beginning of the 20^th century thanks to the observations the Spanish neurobiologist of Ramon y Cajal, it is now common knowledge that these functions are supported by populations of neurons, which hence individually constitute the

“primary functional unit” of the nervous system.

Thereby the neuronal cells have been, and still continue, to be the object of intensive studies. In vertebrates the neurons, as represented in figure 1, are found in the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS). The CNS consists of the takes, among other, the highest cognitive functions and the comprises all other nerves and neurons that do not lie within the CNS and its main function is to connect the CNS to the limbs (muscles) and organs.

Figure 1: Central and Peripheral nervous system.

The central nervous system is composed of the brain and the spinal cord while the peripheral nervous system is composed.nerves that do not lie within the CNS and connect this latter to rest of the body (Fro

Figure 2: Structure of the spinal cord

The spinal cord is responsible for transmitting signals between the encephalon and the body. It is divided in four regions: cervical, thoracic, lumbar and sacral. The spinal segments are connected to the brain through a number of long axonal pathways: the ascending pathways which transmit sensorial informations to the brain (in red) and the descending pathways which transmit motor information to the body (blue). Therefore, an injury to the spinal cord has devastating consequences such as paraplegia or quadriplegia. (Adapted and modified from (Yiu & He 2006)

II.A.2 The neuron

The oversimplified morphology of a neuron consists of a cell body (or soma) containing the nucleus, and several neurite extensions which differentiate either into a dendritic tree or an axon (figure 3). The neuron when compared to other cells possesses the characteristic to be endowed with excitable membranes which confers to the neuron the capacity to generate and propagate electrical activity. These electrophysiological properties are more precisely due to a spatial distribution of high density of voltage-gated channels that are expressed all along the axonal membrane. Generally a given neuron receives electrical input at the dendritic tree and cell body and propagates it along the axon. A neuron is, in general, connected to other neurons and transmits the electrical output to them across the synapse (via the release of neurotransmitters or electrical activity).

Figure3: Typical morphology of a neuron

Generally a given neuron receives electrical input at the dendritic tree and cell body and propagates it along its axon which is endowed with voltage gated channels. The axon of the neurons can be coated with myelin sheath is responsible of the saltatory conduction of the electrical signal that is by consequence sped-up. Arrows indicate (Adapted from www.health.com)

Indeed from now on we are quite familiar with the basic functioning of a single neuron thanks to the advances of electrophysiological tools such as the Patch-clamp technique for example.

In contrast, despite major advances in functional and imagery techniques of CNS investigation, we are still at the prehistory regarding the running of the whole human brain. In substance we know that it stands on an infinitely complicated CNS “meta-architecture” that consists of millions of neuronal networks which frequently overlap. In addition throughout life duration a given neuronal assembly exhibits plasticity i.e. it is susceptible to be slightly reorganized at the synaptic level consecutively to precise electrical stimulations pattern (e.g. Theta burst stimulation). This plasticity involves, among others, rapid biochemical changes at synaptic level membranes and/or dynamic remodeling of the synaptic connections and lead to an increase of the synaptic weight of connected neurons (De Roo et al. 2008a). This synaptic plasticity process is of importance since it has been revealed to be one of the underlying mechanisms of the “mnemonic engram” in the brain.

II.A.3 The central nervous system environment

CNS physiology cannot be described only in terms of “highly complex neuronal networks” i.e. in terms of neurons alone. This is an understatement because neural cells are far to be the exclusive resident cell type of the nervous system (Figure 4). This is a euphemism because neurons represent only less than 10% of the cellular population that compose the nervous system.

In fact neuronal populations are supported by glia (in reference from the Greek that literally means

“glue”) which were initially described in 1891 by Cajal. Their role remained mysterious for a long time. Burt now the glia is now largely recognized to play an essential role since providing support, nutrition, oxygen, to insulate neurons from other cell types, to destroy pathogens, to remove cellular debris and to contribute to the propagation of the electrical signal. The glia is regroups two principal families: the macroglial and microglial cells.

Figure 4: Illustration of the multiple interactions existing between the neurons and the other cells in a section of the spinal cord.

The macroglia

The macroglial cells family reunites the astrocytes (or “astroglia”), the oligodendrocytes which are exclusively found in the CNS and also the Schwann cells, the functional equivalent of the oligodendrocytes but only present in the PNS.

The astrocytes (figure 5) are the major cell types of the CNS; they represent 70% of of the CNS cells. The astrocytes are histologically identified by their expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP). To date, the astrocytes are known to provide nutrients such as glucose, to regulate the

chemical environment of the neurons (ions concentrations) and to recycle and synthesize neurotransmitters and to constitute one major element of the blood brain barrier (BBB).

Figure 5: Schematic representation of an astrocyte (left panel) and human astrocyte (right) stained with anti- GFAP. Representing more than 70% of the CNS cells, the astrocyte to provide nutrients such as glucose, to regulate the chemical environment of the neurons (ions concentrations) and to recycle and synthesize neurotransmitters and to constitute one major element of the blood brain barrier (Fro

The oligodendrocytes (in CNS, figure 6) and the Schwann cells (in PNS) are the cells that produce a complex that consist of 80% lipid fat and 20% protein that is called the myelin. The myelin coats the axon of the neurons at several distance (one oligodendrocytes can myelinate several neurons whereas the Schwann cells myelinate a single neuron). This ensheathment, since constituting an electrical insulating, is responsible for the saltatory conduction of the action potentials between two myelin ensheathments (the nodes of Ranvier, see figure 3) and thus increases considerably the speed conduction of the information. The major proteins found in the myelin (figure 7) are the myelin basic protein (MBP), the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), the myelin associated glycoprotein (MAG) and proteolipid protein (PLP).

.

Figure7: The myelin sheath.

Left panel: electronic microscopy of a myelinated axon. Right panel: schematic representation showing the protein content in the myelin sheath.

The microglial cells

The term”microglia” refers to cells that reside in the CNS which share many properties of macrophages in other tissues (Rock et al. 2004). Thus are also called brain “brain macrophage” and can phagocytes in order to clean-up CNS debris. The microglia has the particularity to exhibit various morphologies depending of their state of activation. They are ramified when they are inactivated (resting microglia) or amoeboid when activated (the reactive microglia). They are mobile within the brain and multiply when the brain is damaged and produce inflammatory reaction in response to CNS insults.

III. THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM REGENERATION

III.A GENERAL CONSIDERATIONS

The hyper complexity of the CNS organization combined with local dynamic and local remodels explains why the human kind is endowed with the most hyper-sophisticated cognitive functions of the animal kingdom. However, as remarked Cajal, one striking feature of such a highly developed nervous system is that: “Once development was ended, the founts of growth and regeneration of the axons and dendrites dried up irrevocably. In adult centres the nerve paths are something fixed, ended, immutable. Everything may die, nothing may be regenerated”. In more prosaic terms, the other hallmark of the adult mammalian CNS is related to its extreme vulnerability to injuries and to recover from them. Definitely it is of common knowledge that injuries of all kind like traumatic brain injury, Stroke, cerebral ischemia, neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson Diseases, Multiple Sclerosis (etc.) lead to more or less irreversible damages and a definitive alteration of CNS function. This statement remains such of veracity that when we meet people victim of a spinal cord injury (SCI), we perfectly know, that they are condemned to remain in a wheelchair for the entire rest of their life. This cold statement reflects our actual impotence to resolve definitely the nervous injury related problematic.

III.B THE SPROUTING VERSUS NERVOUS REGENERATION

Basically the weakness of superior vertebrates CNS to functionally recover is firstly attributable to the fact that, after birth, dead neurons are almost never substituted by new neurons. In mammalians the neurogenesis occurs mainly at the prenatal period. At the adulthood this process still exists but is localized in few seats (e.g. the subventricular zone) while in low vertebrates, like birds, the neurogenesis is persistent and rather widespread distributed in all CNS (Kaslin et al. 2008).

Consequently the massive neuronal death following injury results de facto in the degeneration of the axons and their synaptic contacts. This leads finally to an alteration or even more to the annihilation of the entire function (motor, language, memory etc.). Therefore, in absence of neuronal turn-over, the character more or less reversible of the injury is primarily determined by the nature and the duration of the injury (e.g. transient ischemia duration).

However it is also dependent on the endogenous mechanisms of functional recovery (in term axonal growth and synaptic contact replacements) generated by non-dying neurons. Indeed following an injury the nervous system is capable to trigger mechanisms of auto-repairing displaying thus a kind of flexibility. These processes are the axonal sprouting and the regeneration (figure 8).

Figure 8: Reactive axonal sprouting versus regeneration.

After an injury, the CNS can mobilize a number of responses. If neurons degenerate as represented in A, the response is that the axons of healthy neurons sprout and form new connections with the target of the dead neurons. A second possibility, represented in B is that the severed axon regenerate but this does not occur. The damaged cells can increase collateralization on available target cells, thus the circuit is rebuilt (Adapted from Siegel, 1999)

In fact most of the time, a substantial number of neurons survive inside and also in the vicinity of the lesion site. Some of them are spared and functional. Concerning this category of neurons, they can sprout axons and establish new synaptic contacts (reactive synaptogenesis process) with the primary target of the dead or lesioned neuron (Yiu & He 2006). Under some circumstances this mechanism which is also named “reactive collateral sprouting” appears to be relatively efficient to compensate the disappearance of synaptic contacts. For example it explains why the triggering of the Parkinson disease associated symptoms (that is caused by massive death of dopaminergic neurons of the Substantia Negra) occurs only once more than half of the neurons are dead.

Nevertheless the axonal sprouting possesses a very limited efficiency in case of severe lesion such as spinal cord injury (SCI) or for advanced phase of neurodegenerative disease since such a mechanism, indeed, involves small populations of neurons (Cafferty et al. 2008).

However, a majority of neuronal cells are lesioned and exhibit a complete axonal transection and thereby become functionally ineffective. Generally in these neurons the distal part of these sectioned axons undergoes Wallerian degeneration while the proximal part becomes atrophic and forms at its extremity a “dystrophic growth cone” (Figure 9) or, as described by Cajal, quiescent

“dystrophic endballs”.

Figure 9: Schematic representation of the sequence leading to the formation of a growth cone.

Injuries to CNS neurons lead often axonal transection and generate debris such as the myelin sheath that wrapped the sectioned axon. While the distal degenerates (Wallerian degeneration), the proximal part of the axon becomes atrophic and forms a dystrophic growth cone that is most of the time incapable to establish new synaptic contacts.

In mammals these axotomized neurons are most of the time incapable to generate de novo long distance axonal extensions in order to reestablish synaptic contact(s) with their primary synaptic target(s). In brief, adult mammalian CNS neurons do not spontaneously regenerate following injuries. This latter sentence matches the Cuvier’s (1769-1832) principle. In fact, adult low vertebrates such as fish and amphibians can regenerate part of their body including significant portions of their CNS (Ferretti et al. 2003, Kaslin et al. 2008). In contrast mammalian central neurons progressively lose this capacity along with the progression of the ontogenesis: they display an age-dependent capacity to regenerate or, in other words, they lose their intrinsic regenerative abilities.

Implicitly this also indicates that mature neurons are incapable to recapitulate the developmental- related mechanisms that govern and lead to the set-up of the axonal wiring and synaptogenesis.

This is the reason why the analysis and comprehension of the mechanisms responsible of the building of the nervous system is susceptible to provide supportive informations about the CNS regeneration problematic in view of potential therapeutics.

III.C THE AXONAL GUIDANCE AND THE GROWTH CONE

III.C.1 The growth cone

In fact one can primarily consider that in both analog “situations” (i.e. developmental versus lesional neurons) the finality is similar in terms of axonal motility and synaptogenesis and thereby that the basic mechanistic and factors employed by embryonic and mature neurons is a fortiori identical. Indeed in both contexts the common point is the formation of a “growth cone”.

The growth cone is the structure localized at the extremity of the developing/regenerating axons which is both responsible of the perception of the environment and which also guides the axonal extension to its final destination. It is thus of interest to consider the determinants that act on this key structure during development. The growth cones were initially observed in the 1890s by Cajal and envisioned that it was “....endowed with exquisite chemical sensitivity, rapid ameboid movements and a certain motive force thanks to which it is possible to proceed forward and overcome obstacles met in its way…until it reaches its destination. To summarize, Cajal by simply observing static images, knew that this “club shaped structure”, has a sensor and motor function that consist of exploring the environment and guiding the axon to its final destination where it establishes synaptic connections.

Description

The growth cone is localized at the end of the developing neuron (figure 10). Their basic structure is composed of two main regions: a central core that is rich in bundled microtubules and a periphery that is rich in F-actin (F for fibrillar) filaments that derived from polymerization of monomeric G- actin (G for globular) (Dent & Gertler 2003, Kalil & Dent 2005, Huber et al. 2003). In the peripheral region we distinguish two structures: the lamellipodia localized at the proximal part of the growth cone and the filopodia, a “finger-like” shaped structure localized at tip of the growth cone. In lamellipodia, F-actin is organized in cross-linked network forming a meshwork (or “veil- like” structure). This organization is gradually replaced toward the leading edge of the growth cone by F-actin organized in bundles.