目 录
序 · · · （ i i i ） 作 者 介 绍 · · · （ v i ）
1 概 述 · · · （ 1 ）
1 . 1 A 群 链 球 菌 感 染 的 影 响 ···（ 1 ）
1 . 2 A 群 链 球 菌 的 结 构 和 抗 原 成 分 ···（ 1 ）
2 标 本 的 收 集 和 运 送 ···（ 4 ）
2 . 1 标 本 的 收 集 ··· ··· ···（ 4 ）
2 . 2 运 送 标 本 至 实 验 室 ···（ 4 ）
3 培 养 、 认 识 和 贮 藏 ···（ 1 0 ）
3 . 1 培 养 基 ·· · · （ 1 0 ）
3 . 2 培 养 方 法 ···（ 1 4 ）
3 . 3 培 育 条 件 ··· ···（ 1 5 ）
3 . 4 通 过 培 养 物 来 认 识 溶 血 性 链 球 菌 ···（ 1 5 ）
3 . 5 非 典 型 形 态 学 形 状 ···（ 1 7 ）
3 . 6 培 养 结 果 报 告 ···（ 1 8 ）
3 . 7 链 球 菌 的 保 存 ···（ 1 9 ）
4 L a n c e f i e l d 血 清 群 的 鉴 定 ···（ 2 1 ）
4 . 1 概 况 · · · （ 2 1 ）
4 . 2 初 步 鉴 定 ···（ 2 1 ）
4 . 3 群 抗 原 提 取 的 方 法 ···（ 2 2 ）
4 . 4 群 抗 原 提 取 方 法 梗 概 ···（ 2 5 ）
4 . 5 群 抗 原 检 测 方 法 ···（ 2 6 ）
4 . 6 快 速 分 群 方 法 ···（ 2 8 ）
5 A 群 链 球 菌 的 特 性 ···（ 2 9 ）
5 . 1 血 清 学 方 法 检 测 菌 株 的 特 性 ···（ 2 9 ）
5 . 2 非 血 清 学 方 法 检 测 菌 株 的 特 性 ···（ 2 9 ）
6 测 定 T - 蛋 白 的 凝 集 试 验 ···（ 3 2 ）
6 . 1 概 况 · · · （ 3 2 ）
6 . 2 供 凝 集 试 验 用 的 链 球 菌 悬 液 的 制 备 ···（ 3 3 ）
6 . 3 凝 集 试 验 的 实 施 ···（ 3 4 ） 6 . 4 结 果 评 价 ···（ 3 5 ） 7 通 过 M － 蛋 白 的 沉 淀 反 应 进 行 血 清 学 分 型 ···（ 3 7 ） 7 . 1 L a n c e f i e l d 热 盐 酸 M － 抗 原 提 取 物 的 制 备 ···（ 3 7 ）
7.2 在琼脂凝胶中进行 M－抗原的检测(Duchterlony 双向扩散试验) ···（38）
7 . 3 毛 细 管 沉 淀 试 验 ···（ 3 9 ）
8 应 用 血 清 混 浊 反 应 进 行 血 清 学 分 型 ···（ 4 1 ）
8 . 1 概 况 · · · （ 4 1 ）
8 . 2 混 浊 因 子 的 来 源 和 混 浊 因 子 分 层 ···（ 4 1 ）
8 . 3 琼 脂 方 法 检 测 混 浊 因 子 ···（ 4 2 ）
8 . 4 琼 脂 方 法 进 行 混 浊 因 子 抑 制 血 清 分 型 ···（ 4 3 ）
8 . 5 试 管 方 法 进 行 混 浊 因 子 检 测 和 抑 制 血 清 学 分 型 ···（ 4 5 ）
8 . 6 微 量 平 板 方 法 进 行 混 浊 因 子 检 测 和 抑 制 血 清 学 分 型 ···（ 4 5 ）
9 血 清 学 试 验 检 测 A 群 链 球 菌 抗 体 ···（ 4 9 ）
9 . 1 对 链 球 菌 抗 原 的 免 疫 反 应 ···（ 4 9 ）
9 . 2 利 用 和 处 理 人 血 清 进 行 血 清 学 调 查 ···（ 5 0 ）
1 0 抗 链 球 菌 溶 血 素 O 的 检 测 ···（ 5 1 ）
1 0 . 1 概 况 · ·· · · ··· ·· ·· ·· ·· · ··· ·· ·· ·· ·· · ··· ·· ·· · · ·· · ··· · · ·· ·· ·· · · ·· ··（ 5 1 ）
1 0 . 2 分 光 光 度 计 肉 眼 测 定 法 ···（ 5 1 ）
1 0 . 3 不 使 用 分 光 光 度 计 的 肉 眼 测 定 法 ···（ 5 7 ）
1 0 . 4 微 量 平 板 法 ···（ 5 9 ）
1 1 抗 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 B 的 检 测 ···（ 6 3 ）
1 1 . 1 概 况 · ··· · ·· ·· ·· · ·· ·· · · · ·· ·· · ·· · · · ·· ·· ·· · ·· ·· · ·· · · ·· · ·· ·· · · · ·· ·（ 6 3 ）
1 1 . 2 微 量 平 板 法 1 ···（ 6 3 ）
1 1 . 3 微 量 平 板 法 2 ···（ 6 7 ）
1 2 链 球 菌 抗 透 明 质 酸 酶 抗 体 的 检 测 ···（ 7 2 ）
1 2 . 1 概 况 · ·· · · ··· ·· ·· ·· ·· · ··· ·· ·· ·· ·· · ··· ·· ·· · · ·· · ··· · · ·· ·· ·· · · ·· ·· （ 7 2 ）
1 2 . 2 透 明 质 酸 酶 滴 定 法 ···（ 7 2 ）
1 2 . 3 人 血 清 抗 透 明 质 酸 酶 抗 体 的 检 测 ···（ 7 4 ）
1 3 间 接 杀 菌 试 验 进 行 抗 M 蛋 白 抗 体 的 测 定 ···（ 7 6 ）
1 3 . 1 概 况 · ·· · · ··· ·· ·· ·· ·· · ··· ·· ·· ·· ·· · ··· ·· ·· · · ·· · ··· · · ·· ·· ·· · · ·· ··（ 7 6 ）
1 3 . 2 杀 菌 试 验 方 法 1 ···（ 8 0 ）
1 3 . 3 杀 菌 试 验 方 法 2 ···（ 8 3 ）
1 3 . 4 用 杀 菌 试 验 进 行 M － 蛋 白 血 清 学 分 型 ···（ 8 8 ）
1 3 . 5 用 间 接 杀 菌 试 验 评 估 M － 蛋 白 含 量 ···（ 8 8 ）
1 4 供 血 清 学 分 群 和 血 清 学 分 型 抗 血 清 的 制 备 ···（ 8 9 ）
1 4 . 1 分 群 抗 血 清 ···（ 8 9 ）
1 4 . 2 T － 蛋 白 凝 集 抗 血 清 ···（ 9 1 ）
1 4 . 3 M － 蛋 白 分 型 抗 血 清 ···（ 9 4 ）
1 4 . 4 混 浊 因 子 分 型 抗 血 清 ···（ 9 6 ）
参 考 文 献 · · · （ 9 8 ）
序
在二十世纪结束的时候，化脓性链球菌 (Lancefield A 群 ) 的感 染及其化脓性和非化脓性的疾病在全世界无论什么样的气候、生 态和人文条件都可以发生，而且它仍然是重要的医疗和公共卫生 问题。
上呼吸道的 A 群链球菌感染，特别是在小孩是最常见的细菌 感染。而且，在许多正经历工业化的国家，A 群链球菌感染后的 非化脓性疾病，如急性风湿热和链球菌感染后急性肾小球肾炎是 构成发病率和死亡率的重要因素。在这些发展中国家，那儿居住 着世界上三分之二的人口，对于风湿性心脏病这种复杂病例，心 外科手术是无能力使其恢复正常的，因此，对诊断和和治疗这种 感染给我们增加了难度。风湿热的活动和严重的全身性 A 群链球 菌的感染，如链球菌毒性休克综合征，丹毒，坏死性筋膜炎，在 北美斯堪的纳维亚、英国和其它工业化国家已有报道。这对于初 级管理医生，感染性疾病的专家以及公共卫生专家无疑是一种挑 战。
临床微生物实验室或免疫学实验室和参考实验室对于保证 A 群链球菌感染的正确实验室诊断有着极其重要的作用，因为，这 对于国家控制风湿热，风湿性心脏病，急性链球菌感染后肾小球 肾炎和严重侵袭性 A 群链球菌感染是很重要的。
这本手册对于“友好的用户”提供了有关 A 群链球菌感染的实
验诊断的综合知识。这对于 A 群链球菌感染的实验室评价所通常
需要的程序具有良好的参考和指导作用。本书所包括的内容不仅 有关于细菌学的方法，而且也有关于血清学评价和链球菌抗体试 验，和一些其它重要技术的描述，例如，供链球菌血清学分型使 用的抗血清的制备 ( 许多抗血清购买不到 ) 。本书特别具有价值的方 法是作者们所工作的两个参考实验室广博经验的结晶，也包括来 源于出版文献的程序和建议。虽然其它的方法已被使用，但这本 手册所收集的方法都是一些已被报告有效的方法。
链球菌参考菌株和诊断血清能从美国明尼阿波利斯世界卫生 组织血清库获得，或从捷克共和国布拉格世界卫生组织链球菌参 考和研究协作中心获得 ( 世界卫生组织血清库是由世界卫生组织在 布拉格、明尼阿波利斯、新德里、里昂、罗马、圣彼得斯堡的国 家链球菌研究中心的世界卫生组织协作中心协作实验的结果 ) 。
世界卫生组织在促进链球菌感染的实验室标准化技术方面一 直起着积极的作用。最初的一套实验指南(链球菌感染其及并发症 的 微 生 物 学 诊 断 方 法 手 册 ， 世 界 卫 生 组 织 未 出 版 的 文 件 WHO/BAC/80/1) 由 R.R.Facklam 博士撰写，后由 J · Rotta 博士撰写。
1980 年由世界卫生组织发出并被广泛用于全球的实验室。随着实
验技术的众多进展和人们对 A 群链球菌感染的认识，在布拉格和
明尼阿波利斯的世界卫生组织链球菌参考和研究协作中心已经赋
予这本手册以崭新的内容并扩大了它的范围，包括添加的对临床
实验室，参考实验室和研究实验室有用的程序，世界卫生组织对
于作者们编写这本新的出版物所作出的贡献表示感激，因为全世
界的实验室和研究工作者将分享他们的知识和技术。
瑞士、日内瓦 世界卫生组织
监督和控制疾病发生和传播部 E.Tikhomirov
(唐由凯 译 ／ 游红波 校)
作者介绍
在鉴定和控制 A 群链球菌感染中，实验室的作用是极其重要 的，这对于微生物学实验来说同样如此，它担负着对来自上呼吸 道 A 群链球菌的培养，以及测定抗体滴度的任务。尽管新的抗菌 药物的发展，但过去十年的经验已经显示，A 群链球菌的感染仍 然是重要的，并且可以预料未来的情况可能仍是如此。在二十世 纪结束之时，人们对这些感染的了解是不完全，因此应将注意力 放在临床实验室和研究实验室的活动方面。在布拉格和明尼阿波 利斯的世界卫生组织链球菌协作中心都已注意到，要求提供咨询，
培训实验室人员，提供实验试剂 ( 许多试剂可免费获得 ) 的人数正在 增长。
由于 A 群球菌感染的临床和流行病学问题的再现以及技术问 题的容量，从而大大地促进了这本手册的出版，我们确信，在我 们两个实验室所获得的经验对于其它的实验室将具有价值，有助 于其它地方诊断工作的准确性和标准化。本书所收录的方法，在 临床微生物学实验室，免疫学实验室和研究实验室是最常用的方 法，并为那些工作在更边远地区的实验室人员提供了广泛的指导。
大多数方法是用于我们两所实验室所编辑并发现这些方法是行之 有效的，但有许多参考书和已出版的文献中建议值得借鉴。有时，
描述了两种不同的方法，一种是来自明尼阿波利斯，另一种来自
于布拉格，这些仅仅反映了我们不同的实践并没有专门暗示那一
种方法可选用而不选用另一种方法。
这本手册描写详细，在某种程度上压缩了 1980 年由 Richard
Facklam 博士撰写的后由 Jiri Rotta 博士撰写的世界卫生组织内部
文件 (WHO/BAC/80/1) ，虽然许多传统的技术仍然相同，但在临床
实验室和研究实验室已有很多的变化。因此，这本手册所包含的 许多技术在 1980 的文件中没有包含进去，除此之外，还为有兴趣 的用户提供了另外的信息即大量的参考文献。对于目前的内容而 言，在某种程度上我们尽量做到对于所有水平的读者都能够理解 并容易做到。
我们感谢由 Facklam 和 Rotta 博士在 1980 撰写的文件所提供 的指导，他们最初文章的许多内容被逐字引用，我们手册的每一 位作者对扩展它们的内容作出了贡献，当然还有其它的同事们，
由于太多就不单个提及。我们十分感谢他们的建议和慷慨地为我 们提供资料。
我们特别感激世界卫生组织监督和控制疾病发生和传播部的
Evgueni Tikhomirov 博士，为我们完成这项工作提供的鼓励和机
会，特别感激世界卫生组织出版办公室的 Sarah Ballance 夫人对于 原稿的仔细编辑工作，谢谢二位。
美国，明尼阿波利斯 捷克共和国，布拉格 世界卫生组织 世界卫生组织
链球菌参考和研究协作中心 链球菌参考和研究协作中心 Dwight R.Johnson
Edward L.Kaplan
Jaroslav Sramek Ruth Bicova Jiri Havlicek
Helena Havlickova
(游红波 译 ／ 唐洪凯 校)
1 、概述
1.1 A群链球菌感染的影响
Lancefield A群化脓性链球菌(A群链球菌)是世界各地常见的重要的人类病原菌，引起各种各样
的感染和并发症(但不排除其它原因)，通常发生在儿童、少年和年青的成人。A群链球菌的感染可呈 现地方性或流行性。在人类，A 群链球菌感染的主要入侵门户和它们居留的主要部位是上呼吸道，
链球菌性咽扁挑体炎是所有细菌性咽喉感染最常见的，如果伴随有典型的皮疹，它就被称之为“猩红 热”。在大多数情况下，“链球菌咽喉炎”是一种自限性感染，但它可进一步发展引起脓肿(在扁桃体或扁 桃体周围组织和咽后的组织)或颈部淋巴腺炎，窦炎，中耳炎，乳突炎甚至脑膜炎。在下呼吸道，A 群链球菌可引起肺炎。确诊咽部感染，一个有意义的内容就是证实链球菌抗体浓度的升高，在临床 上咽部感染表现为轻型甚至是隐性感染，虽然这样，但与后来后遗症的发病有联系，或许是有毒的 链球菌传播的活跃来源，这和“慢性带菌者”不大相同[1]。
由A 群链球菌所引起的原发皮肤感染即脓疮疱(脓皮病)是最常见的，特别是在热带地区，其它 的表现包括丹毒，源于小的损伤或伤口的局部化脓性感染，以及蜂窝组织炎(包括肛门周围的蜂窝组 织炎)，一些罕见或严重的坏死性筋膜炎或肌炎与皮肤感染有关。原发性链球菌感染的第三个部位是 女性的生殖道，外阴炎和产褥热，虽然不常见，但在许多国家仍能见到。
咽喉，皮肤和生殖道感染可发展成为威胁生命的败血症、链球菌毒性休克综合征或转移性化脓 性感染如关节炎、骨髓炎、腹膜炎甚至急性心内膜炎。
A 群链球菌是唯一的在感染过程中的后期发生非化脓性后遗症的细菌，如肾小球肾炎，它可以 发生在由致肾炎菌株的咽喉感染或皮肤感染之后，风湿热仅发生在咽喉感染之后。在许多发展中国 家，风湿性心脏病是一个主要的公共卫生问题[2]。虽然在经济发达国家的人口中，它已经变得相对 地少见，但风湿热的散在发病，局部暴发确有发生，并提醒人们，A 群链球菌的感染将继续威胁着 人们的身体健康。
A 群链球菌是急性细菌性咽炎的主要病因[4]，如果可能的话，单独根据临床症状和体征将链球 菌咽炎和非链球菌咽炎区别开来是困难的，因此，可靠的细菌学鉴定方法对于准确的诊断和合适的 治疗是必不可少的，适量的抗生素治疗基本上可以除去风湿热的危险，或许能减少化脓性并发症的 发生率，加速恢复(如果早期开始)并可预防进一步传播或感染的扩散。
必须记住，急性风湿热或链球菌感染后急性肾小球肾炎的准确诊断需要A群链球菌在先感染的 证据，但采用血清学方法来证明抗链球菌抗体的升高是最好的手段，虽然，抗体的测定临床上在疾 病的早期对于诊断可能是没有用的。
1.2 A群链球菌的结构和抗原成分
A 群链球菌的细胞结构包括几种重要的成分，最外层是由透明质酸组成的荚膜，链球菌在荚膜
产生的数量上和自身产生的透明质酸酶方面有很大的差别，其透明质酸酶可破坏荚膜。链球菌的细 胞壁在荚膜缺乏时是最外层，细胞壁外有毛发样突起或伞状突起，它是由M.T和R蛋白抗原以及脂 磷壁酸组成。R或T蛋白，虽然它们是非常有用的流行病学标志，但它们的生物学功能仍不清楚。
研究显示，脂磷壁酸容易使A群链球菌粘附在粘膜上，M蛋白是A群链球菌的主要毒性因子，它具 有保护A群链球菌避免吞噬细胞的吞噬作用。在Lancefield分类表中，根据M蛋白的抗原性不同，
有80个血清型已被正式认可。除此之外，已描述了许多暂时的 M型，并且许多菌株，携带仍没有 被赋予特性的M蛋白，其特性仍然不清，抗M蛋白的抗体与型特异性免疫有关，链球菌M蛋白的 模型见图1。
图1 链球菌M蛋白的推荐模型(5)
被盘绕的卷曲M蛋白的羧基端(C端)作为膜锚固定在细胞膜上，从膜锚区伸向氨基端(N端)，M 蛋白是由埋置在细胞壁中的丰富的脯氨酸/甘氨酸区所组成，后面有四个区由重复的氨基酸组成(被命
名为A-D)，在不同的M蛋白中B-D区的氨基酸序列显示出高度的恒定性，而A区(N端的一短的氨
基酸序列)是高变区，并认为每一种M蛋白分子是不同的[6、7]。混浊因子(OF)是一种与某些M蛋白 血清型有关的一种具抗原性的型特异性酶。它能使不同的哺乳动物血清产生混浊，并能被用来鉴定 某些M型。目前，至少有27种被正式认可的M型被认为能产生混浊因子，但是确实有许多特性还 没搞清楚。
细胞壁本身(细胞骨架)由肽聚糖(由短肽交叉连接的 N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸的重复单位
构成)和C多糖(由N-乙酰葡糖胺和鼠李糖多聚体构成)组成，血清学分群由具抗原性的这种C多糖结
构来决定。在目前的A群链球菌的常规分类上，胞浆膜(细胞壁下)和胞浆本身的抗原未被利用。
A群链球菌产生许多毒素和酶，其中有具有抗原性的链球菌致热外毒素(即红疹毒素，有A、B、 C 三个血清型)，引起猩红热皮疹。链球菌溶血素 S，是一种氧(O2)稳定性，非抗原性的毒素，它是 在需氧培养的血琼脂平板表面生长的链球菌菌落周围产生溶血环的重要原因。链球菌溶血素O是一 种可逆转的对氧不稳定的具有心肌毒性作用的细胞毒溶血素，因为这种溶血素在氧存在时不具有溶 血活性，因此表现为在需氧培养的平板上菌落生长在刺入琼脂的亚表面，它可刺激机体产生抗链球 菌溶血素 O 的抗体，这种抗体被用来作为诊断感染的依据。其它的细胞外抗原如脱氧核糖核酸酶
B(DNA酶B)、透明质酸酶、链激酶、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸酶(NAD酶)刺激机体所产生的抗体，
和细胞壁碳水化合物的抗体及抗多糖类的抗体也被用于实验室试验的诊断之中。用于证实A群链球 菌感染最常用的抗体试验是抗链球菌溶血素O和抗DNA酶B，这两种试验的试剂有商品供应。另 一种是抗透明质酸酶试验。
(唐由凯 译 ／ 张连生 游红波 校)
2 、标本的收集和运送
2.1 标本的收集
用药棉或合成纤维制成的拭子从咽喉、鼻、皮肤损伤处、伤口或其它受感染的人体部位收集标 本，如果受感染部位或损伤处自身不湿润，拭子在使用前应该用无菌水或盐水弄湿。
咽喉部采样，用拭子准确地在两侧扁桃腺上(或扁挑腺凹窝)和咽后壁上轻微施加压力，很快的擦 拭，拭子应避免太多的唾液污染，因为已经观察到唾液中口腔微生物的存在能竞争抑制A群球菌的 生长，拭子取材最好在直视下完成，并借助压舌板来完成，如果有渗出物存在，应采取渗出物。
鼻部采样，应将拭子插入每一侧的前鼻孔，在其内面周围擦拭。采取咽喉标本和鼻拭子无论什 么时候都是很方便的，这对于检测上呼吸道少量的A群链球菌是重要的。在特殊的流行病学环境(例 如在医院中流行)，A群链球菌可以从携带者的直肠、肛门周围或阴道排出[8、9]，因此，当怀疑这些 部位有感染时，对这些部位取样可能是必要的。
从皮肤损伤和伤口处能收集到浆液性材料，对皮肤上的囊泡在用70%乙醇消洁之后并无菌穿刺 术取样。对脓疱病结痂的病例，用 70%的乙醇擦拭皮损处，再用无菌针头，无菌操作移去脓痂，并 用一弄湿的拭子在皮损部取样。据报告另一种方法是成功的，其方法是在原位置保留结痂，在结痂 的两侧边缘用手指拉长皮肤以便从结痂下面取一小滴脓性材料，这一小滴脓材料应被收集在干拭子 的尖端上，拭子不应接触皮肤，在这个程序之前清洁皮损处认为是不必要的。不管使用什么方法，
其目的总是从新鲜的皮损处更好的获取材料，以便进行链球菌的纯培养。较久的皮损处常常含有链 球菌和葡萄球菌。
因为丹毒有一完整无损的表面，所以可以尝试从主要皮损的边缘进行针头吸引术，方法为皮内 注射小量(0.1毫升)无菌生理盐水进入皮损部位的区域并立即抽取该液体反回到注射器中，然而，使 用这种技术获取A群链球菌的成功率是相当低的，因为被回收的液体量少，所以，将标本接种于血 琼脂培养平板上或注入营养丰富的液体培养基中，如血清肉汤或血液肉汤，能够获得满意效果，对 于大泡的丹毒，在清洁后，应将水泡液吸入注射器中。
对于扁桃体周围脓肿，化脓性淋巴腺炎，窦炎，中耳炎，骨髓炎或其它局部A群链球菌感染的 病例，采取标本的标准方法是用注射器抽取标本进入注射器中。
2.2 运送标本至实验室
在标本收集和实验室检查标本之间的任何延迟都将可能增加假阴性结果，最好是将标本立即接 种到血琼脂平板上。如果要耽搁几小时的话(时间限定处决于所用拭子材料的特性，环境因素和营养 基质)应该使用一种运送培养基(例如Stuart·s培养基)、滤纸条方法或硅土凝胶运输系统。
2.2.1 运输培养基
不能立即接种的标本，推荐使用一种运输培养基以防止链球菌丧失活力，如果接种延迟48小时
以上可使用分别在2.2.2部分和2.2.3部分所描述的滤纸条法或硅土凝胶法。所使用的Stuart·s运输培 养基培养运输系统有商品供应，已经成功地使用了许多年，按照下述方法在实验室也能制备出Stuart·s 培养基[10]。
设备和用品
——带螺旋帽的试管
——PH计或PH试纸
——高压灭菌锅
试剂
——厌氧盐溶液
无氯(除离子)蒸馏水 900ml 10%氯化钙水溶液 20ml 20%甘油磷酸钠水溶液 100ml 1mol/L 氢氧化钠(调至 PH 至 7.2) 12~15ml 巯基乙酸 2ml
——琼脂溶液
无氯(除离子)蒸馏水 1000ml 琼脂 6g
——0.1%美蓝水溶液 4ml
方法
1、混合厌氧盐溶液各成分，加入足够的氢氧化钠，调PH大约至7.2。
2、融化琼脂将其加入到厌氧盐液中。
3、检验PH，如果必要，调PH至7.3~7.4。
4、加入4ml美蓝溶液并充分混合。
5、分装至带螺旋帽的试管中(几乎装满试管)并高压灭菌121℃，15分钟，高压灭菌后冷却，培 养基应该呈无色。
6、使用时，应将咽喉拭子插入此种培养基中，折断或切断拭子杆并用螺旋帽封紧试管口，迅速 送往实验室。
2.2.2 滤纸条方法
在一滤纸条上使标本干燥并维持标本在干燥状态之中，能延长A群链球菌的生命力[11~13]。在标 本中维持这些细菌相对优势率和剩余的菌群也是必要的，在随后的滤纸条培养在血琼脂平板表面的
过程中，应将滤纸条用营养液完全浸透。细菌生长在滤纸条和含有薄层肉汤的琼脂表面之间，在这 些条件下，既使微弱的A群链球菌菌株也常常产生明显的溶血。
滤纸条的制备 设备和用品
——将滤纸(例如Whatman1号)切成2×6cm大小的滤纸条
——将玻璃纸(非吸水纸，耐蒸汽消毒)切成3×13cm大小的玻璃纸条
——铝箔，0.015mm厚，大小10×20cm，并在二分之一处折叠使其成双层
方法
1、用铅笔在滤纸条的一面作上记号。
2、在将近一半处折叠玻璃纸，留出稍微长一点的上边，以便用手指打开没有被污染的滤纸条。
3、将滤纸条插入被折叠的玻璃纸中，使铅笔标记面对着较短面。
4、将在铝箔中装有滤纸的玻璃纸包起来，以便铝箔的封闭处在滤纸的平坦面。
5、高压灭菌被包起来的铝箔小包121℃，30分钟。
6、高压灭菌后，在使用前，要让滤纸条用品完全干燥。
7、假若被消毒灭菌的滤纸用品保持完全干燥，那么，它们可以使用许多年，不需要再消毒灭菌。
运送标本到滤纸上 设备和用品
——预先制备的滤纸条用品并消毒灭菌
——供作记号用的圆珠笔或标签笔(沾水笔)
——脱脂药棉或合成纤维咽喉拭子
方法
1、用圆珠笔(或铅笔)在外层的铝箔包上标记滤纸条用品。
2、展开铝箔包，滤纸条面朝上方检查平坦面(未用铅笔标记面)。 3、用拭子收集标本。
4、按图2所示立即转移标本到滤纸条上，移去滤纸条上的铝箔提起玻璃纸上边，将沾有标本的 拭子移到滤纸条的未标记面，尽可能多将拭子轻压在滤纸条上，滚动带有标本的拭子。再用拭子的 顶端反复地接触滤纸条剩余部分。
5、再将玻璃纸盖面返回到它原来的位置，并使标本完全干燥5~15分钟，其时间取决于环境中
的相对湿度。
6、将外面的铝箔包再折叠起来，将滤纸条用品包保持在室温干燥处直到送往实验室。
图2 转移链球菌标本到滤纸上以供运输
评述
·如果当地邮政管理部门允许的话，被涂有标本的滤纸条用品包能放在普通信封内邮寄。
·干燥标本的培养可延长至7天，在链球菌计数上不会有太多的减少，即使标本来自细菌数稀少 的慢性携带者。
·因为潮湿可以减少滤纸条上A群链球菌的活力，所以，在热带和亚热带国家的雨季，这种技术 可能失败，在密闭的容器内用干燥剂(硅土凝胶)保持或寄送标本，以避免湿气，能够减少失败。
培养涂有标本的滤纸条。
设备和用品
——镊子
——本生灯或酒精灯
——血琼脂平板(见3.1.3部分)
——培养箱(37℃)
方法
1、在实验室打开滤纸条用品包。
2、用无菌镊子(在酒精灯上烧灼)取出滤纸条。
3、将滤纸条面向下(铅笔标记面朝上)放置在血琼脂平板表面上。滤纸条应该接近于平板的边缘，
在滤纸条下面应不留有气泡。
4、需氧培养平板37℃，4~5小时。
5、在初次培养之后，用无菌(烧灼)镊子移动滤纸条，放置滤纸条在同一平板的中三分之一上几 秒钟，最后，转移滤纸条到同一平板的剩余的三分之一处，总是面向下。
6、37℃培养过夜。
7、在过夜培养之后，检查β-溶血性链球菌。
评述
·在涂有标本的滤纸条所接触的第一和第二区域产生典型的单个细菌菌落，最后所接触的区域过 夜培养，通常有混合性微生物生长，如果β-溶血性链球菌存在于滤纸条下面，它们仅表现为透明清 晰的溶血带，仅仅表现这种特征的溶血就意味着链球菌的存在。在滤纸条下面只有金黄色葡萄球菌 菌株与这种链球菌β-溶血极为相似。
·如果在血琼脂平板的头二个区域没有发现链球菌菌落，但在滤纸条下面有明显的溶血，那么至 少要取有β-溶血的一个菌落进行次代培养。在分离试验之前，只要简单地从β溶血位置移开滤纸条，
用一金属接种环接触典型溶血带的中央就足够了，再转种到另一新鲜的血琼脂平板上。
·如果延长培养24小时，在原平板上任何地方都没有看见溶血带，在它的“过夜”位置中替换滤纸 条。
·研究发现，采用滤纸条技术所获得的结果与拭子立即接种和在丰富培养基中的附加培养相结合 的结果同等，用传统的原始标本接种的方法，一半的培养结果是可能获得的。
2.2.3 硅土凝胶干拭子
硅土凝胶系统是以滤纸条方法为基础，但在包装之前要消除供干燥标本的不利因素[14]。在2.2.2 部分讨论过，在用滤纸条运送标本的期间，潮湿的存在将对链球菌的活力有害，将标本放置在硅土 凝胶干燥剂中能消除这个问题，虽然，被制备的硅土凝胶邮寄容器似乎不再有商品来源，但按下述 方法在实验室里能容易被制作：
设备和用品
——带螺旋帽的试管，其长度足以容纳咽喉拭子
——硅土凝胶，网眼大小12~28，等级08
——药棉或合成纤维咽喉拭子
——高压灭菌锅
——干烤箱
——培养箱 方法
1、加入足够的硅土凝胶到试管内以覆盖咽喉拭子的头部(深度大约2cm)。 2、松驰地盖上试管，并高压灭菌121℃，15分钟以消毒灭菌。
3、在干烤箱内干燥试管(松开螺旋帽)。
4、冷却后，牢固地拧紧螺旋帽，并贮藏直到需要使用为止。
5、在采取咽喉标本后，立即将咽喉拭子插入试管内，以致拭子头部完全被硅土凝胶所覆盖，在 送往实验之前，牢固地拧紧试管帽。
6、在实验室收到标本后，仔细地将拭子从试管中取出，将拭子浸入Todd-Hewitt肉汤试管之中，
然后在血琼脂平板上划线，再返回拭子到 Todd-Hewitt 肉汤管中培育过夜(35~37℃)并且直到获得培 养结果为止。
评述
·硅土凝胶能与指示蓝(大约3~5%，等级46)混合作为干燥指示剂。
·有可能被污染的硅土凝胶颗粒可粘住拭子，并在实验室冒充一个可能的微生物因子，如果在试 管内有任何的松散颗粒存在，应该将拭子从试管中拿走。
2.2.4 琼脂上A群链球菌的运送
虽然血琼脂平板上的链球菌的运送是常见的，但这种方法是不理想的，除非血琼脂平板被牢固 地密封，要不然琼脂就有干燥的危险，因而便会使链球菌的活力丧失，邮寄包裹的粗野处理常常可 看到损坏平板的结果。另外，在许多国家用血琼脂平板运送培养物是不合法的。因此使用装入带螺 旋帽或玻璃瓶中的血琼脂斜面或巧克力琼脂斜面或高层琼脂是较好的。这些培养基能很好的密封以 防脱水。如果用足够的垫料进行保护的话，是完全可以防止粗野处理所导致的损害。这些方法最适 合链球菌纯培养物的运送，并已非常成功的用在许多研究之中。
血液琼脂和巧克力琼脂斜面容易从商家购得，也容易在实验室制备，琼脂斜面的优点是，细菌 在其上生长容易看见。在运送前，检查斜面上的污染常是可能的，缺点是暴露琼脂表面，容易受到 有害的脱水作用的影响，然而在正常条件下，很好地密封试管并且相对短的运送时间，脱水就不是 一个重要问题，用血琼脂或没有血液的血琼脂基原填满一个小瓶就能制备高层琼脂。不用血液的优 点是更容易看得见高层琼脂接种后链球菌在琼脂中的生长情况，用接种环从血琼脂平板取几个菌落，
然后垂直穿刺接种环到琼脂底部。当接种环被移开时琼脂关闭了穿刺周围，形成了一个有利于细菌 生长和非常稳定的水含量环境，在这些条件下链球菌的活力通常将完全保持几个星期。
(陈佩伟 译 ／ 唐由凯 游红波 校)
3 、培养、认识和贮藏
3.1 培养基
链球菌营养要求高，除了复杂的营养成分如肉汤液和葡萄糖之外，培养基应该含有缓冲液以预 防在生长过程中产酸而杀死链球菌。
3.1.1 非选择性肉汤培养基
Todd-Hewitt肉汤
用于培养A群链球菌的标准培养基是改良的Todd-Hewitt肉汤[15]，它是由牛心浸液、胰蛋白胨、
葡萄糖、盐和缓冲液组成，并有商品出售，如果必要的话，Todd-Hewitt肉汤也能用原成分制备。当 培养链球菌是供M蛋白分型或制备疫苗或生产抗-M蛋白的抗体，Todd-Hewitt肉汤用胰蛋白胨是必 要的，以抑制消化和破坏M蛋白的具有活性的蛋白酶产生，也有报告胰蛋白胨可刺激M蛋白的合
成[17~19]。据报告在Todd-Hewitt肉汤中加入2%的酵母浸膏可提高链球菌数量将近3倍，加入3%的
酵母浸膏并摇动培养可增加液体重4~5倍，并伴有M蛋白产量的增加[20]。
设备和用品
——加热器
——高压灭菌锅
——漏斗
——滤纸或脱脂棉
试剂
——去脂牛肉或牛心
——蒸馏水
——胰蛋白胨
——氢氧化钠，10mol/L
——碳酸氢钠
——氯化钠
——磷酸氢二钠
方法
1、剁碎牛肉或牛心，每450克加1升蒸馏水，充分搅拌并保持在4℃过夜。
2、加热至85℃，维持这一温度30分钟，并不断的搅拌。
3、趁热用滤纸或脱脂棉过滤，用蒸馏水补充因蒸发所丢失的水份。
4、每一升加20克胰蛋白胨，用10mol/L氢氧化钠调PH至7.0(大约每升需要3毫升) 5、每升培养基加
碳酸氢钠 2g 氯化钠 2g 葡萄糖 2g 磷酸氢二钠 1g 6、煮沸培养基15分钟
7、趁热用滤纸过滤。
8、消毒灭菌，高压灭菌115℃，10分钟。
9、最后调PH至7.8，并在4℃下贮藏培养基。
血清肉汤
在Todd-Hewitt肉汤中加入20%(V/V)正常小牛或马血清制备血清肉汤并无菌分装至要求容量(例
如6ml)的试管中，35~37℃培养过夜检查有无污染并在室温下再次过夜，如果没有任何污染迹象，
然后在4℃下保存直到需要使用时，如果防止水份蒸发(例如放置在塑料袋中)可以储存许多周。
血液肉汤
血液肉汤是在Todd-Hewitt肉汤中加3~5%(V/V)脱纤维绵羊、马或兔血制备而成，应进行无菌检 查并按血清肉汤所描述的方法保存。
3.1.2、选择性肉汤培养基
Pike·s培养基
一些研究者发现Pike·s培养基(21)能抑制葡萄球菌和革兰氏阴性细菌的生长，可增加来源于咽喉 培养物A群链球菌的数量。
设备和用品
——试管
——吸管2.0ml、0.15ml和0.10ml
——脱脂棉或合成纤维咽拭子
——培养箱 试剂
——血浸液肉汤 Pike使用含1%胰蛋白胨、0.02%葡萄糖和5%兔血的牛心浸液肉汤。
——叠氮钠，浓度为1:1000(0.1g/100ml)的水溶液，高压灭菌121℃，15分钟。
——结晶紫，浓度为1:25000(4mg/100ml)的水溶液，高压灭菌121℃，15分钟。
方法
1、准备可分量血液肉汤2ml的试管
2、每支试管加入0.15ml经高压灭菌的叠氮钠(最终浓度67μg/ml)。
3、每支试管加入0.10ml经高压灭菌的结晶紫(最终浓度1.7μg/ml)。
4、用拭子收集标本。
5、将拭子插入含Pike·s培养基的试管中，35~37℃培养过夜。
6、将次代培养肉汤接种到一标准的血琼脂平板上，并象原代培养那样进行培养。
评述
·Pike观察到在加入叠氮钠之后2天，这种肉汤开始失去它的生长抑制能力。
·Nakamizo和Sato曾报告使用含有叠氮钠但不含结晶紫的营养肉汤可获得好的结果，他们所用
肉汤的附加成份是酵母浸膏，大量氯化钠，活性炭，皂甙，尿素酶和樟脑(22)。
3.1.3 非选择琼脂培养基
标准琼脂培养基
许多琼脂培养基可使A群链球菌满意生长，尤其是当供给血液或血清的时候。常用的琼脂培养 基是含有5%绵羊血液的胰蛋白酶大豆琼脂。已有许多培养基并不是实验室制品，而是从供应商那里 购买，琼脂培养基可能通过购买而获得或者混合各成分(琼脂，肉浸膏，缓冲液等)进行制备。然而，
无论是在实验室制备培养基或者是从商业生产厂家购买，第一批新的培养基应该进行测试，检验链 球菌是否能在其上良好地生长并有典型的菌落形态和溶血特性的能力。血琼脂培养基被用于溶血的 评价，不应该添加葡萄糖，因为葡萄糖可抑制β-溶血。凝结温度应该是≤48℃
设备和用品
——陪替氏培养皿
——吸管或注射器，供加血液至琼脂中使用。
——高压灭菌锅
——水浴箱，37℃(随意的)及48~50℃
试剂
——血琼脂基质
——脱纤维血液(绵羊、马、兔，见3.4部分)
将采集血液装入含有1~2层玻璃小珠(直径5mm)的无菌的烧瓶中，慢慢振摇直到血凝块形成(约 10分钟)将脱纤维血液慢慢倒入一个无菌的容器内。在4℃下贮藏可保存5天，在使用前无菌检查。
方法
1、根据厂商的说明书制备血琼脂基质，高压灭菌121℃,15~30分钟,在水浴箱中冷却至48~50℃。
一些实验室在高压灭菌前比较喜欢加热至100℃融解琼脂基质。
2、温血至室温(20~22℃)如果喜欢可至37℃。
3、在48~50℃在无菌血琼脂基质中加入5~7%温血。
4、彻底混合，倾注于平皿中3~4mm厚，在琼脂表面应避免出现气泡。
5、在移动琼脂平板前,放置在水平表面，让琼脂完全凝固,每一批琼脂平板应取一个在35~37℃ 培养，作为无菌检查。
6、可将琼脂平板留在工作台上过夜干燥，密封在塑料袋中4℃下贮藏，被贮藏的琼脂平板所使
用的寿命将取决于血液的质量，琼脂基质的成份和贮藏的条件。
3.1.4 选择性琼脂培养基
选择性培养基也能从商家获得或按下述方法制备
结晶紫琼脂
以上述Pike·s培养基的原理为基础3.1.2部分含有结晶紫的血琼脂平板在培养物可能有葡萄球菌 过度生长的情况下是很有用处的，例如，在皮肤和皮肤损伤的培养物中，和人群中鼻咽培养物中常 有大量的葡萄球菌，高浓度的溶血性葡萄球菌完全可以掩蔽链球菌的溶血。
设备和用品
——标准的琼脂培养基，如上所述
——吸管(5ml)，供加入结晶紫到琼脂中使用
试剂
——标准琼脂培养基，如上所述
——结晶紫水溶液，浓度为1:10000，高压灭菌121℃，15分钟
方法
1、象制备标准的血琼脂平板那样制备血琼脂基质，高压灭菌121℃30分钟并冷却到48~50℃。
2、温血并象制备标准血琼脂平板那样加入到血液琼脂基质之中。
3、对于500ml血琼脂，加入无菌的结晶紫溶液5ml最终浓度为1:1000000( 1μg/ml)。
4、完全混合并象制备标准血琼脂平板那样倒平板。
含粘菌素和萘啶酮酸或牛磺酸的哥伦比亚琼脂
来自各感染部位的链球菌培养物可能带有革兰氏阴性细菌，如果使用抑制性的抗生素进行培养，
通常是更易获得成功，含有粘菌素(10μg/ml)和萘啶酮酸的哥伦比亚琼脂(15μg/ml)对革兰氏阴性细菌 有较好的抑制作用[23]。但它不能抑制葡萄球菌和棒状杆菌，然而含有粘菌素(10μg/ml)牛磺酸的哥伦 比亚琼脂(15μg/ml)除抑制革兰氏阴性细菌之外还抑制葡萄球菌和棒状杆菌[24]。
磺胺甲 唑—甲氧苄胺嘧啶琼脂
一些研究者发现在标准的血琼脂平板之中加入磺胺甲 唑和甲氧苄胺嘧啶可增加A群链球菌的 分离率[25、26]。这种培养基由含有5%的绵羊血和磺胺甲 唑(23.75μg/ml)及甲氧苄胺嘧啶(1.25μg/ml) 的胰蛋白酶大豆琼脂组成。
3.2 培养方法
为了正确的进行拭子接种，最好使用一整个血琼脂平板，然而，如果接种仔细的话，可使用标 准大小平板的一半。滚动拭子标本横过近平板边缘约3×2cm大小的区域，从这个区域用灭菌的接种 环播散三或四个划线区以很好的获得单个菌落(图3)。另外用接种环进行几处斜面穿刺进入琼脂的接 种是重要的。这就使得细菌在琼脂表面下面在几乎厌氧的条件下生长并使在需氧条件下常产生弱溶 血的菌株形成更明显的β-溶血带，亚表面溶血是由于氧不稳定性的链球菌溶血素O所引起，如果要 成功地分离出小量的A群链球菌，血琼脂平板不必太干燥。
图3 β-溶血性链球菌原代培养的划线接种技术
最初接种富含A群链球菌的标本，对于急性链球菌感染的诊断是十分满意的。标本来源于新近 被诊断为急性风湿热或急性肾小球肾炎的病例，为了从零星的菌落中发现A群链球菌，滤纸条技术 是非常重用的。另外的方法是，最初的接种应该使用既具选择性又具有丰富营养的培养基Pike·s培 养基、血清肉汤或血液肉汤。在初次接种之后，在营养丰富的培养基中35~37℃过夜，并使用新鲜 的血琼脂平板再次接种，其方法是转移一非常小的菌落到新鲜的血琼脂平板上并用接种环充分地分 散它以获得单个的菌落。如果营养丰富的肉汤培养基被用作非选择性，对于健康病原携带者，与用 拭子取材之后立即进行最初的接种进行比较，使用营养丰富的培养基可增加A群链球菌的检出率达 15~20%。
液体标本大概不富含A群链球菌，例如来源于脓肿的脓液，或来自播散边缘的吸出液体，液体 标本可直接接种于营养丰富的液体培养基之中，如果被采集的标本量少，也可用注射器吸1ml的液 体培养基进行冲洗收集标本，在接种到血琼脂平板之前，37℃孵育15~18小时(如果必要的话可更长)。
虽然唾液培养可培养出溶血性链球菌，但详细的研究已经显示咽喉培养物可能是更可靠的[27]。 未经稀释的唾液培养物(0.1ml可覆盖一个血琼脂平板)常常使口腔细菌大量过度生长，以致每毫升只 含少于106链球菌的标本要形成典型的A群链球菌菌落是罕见的。
因为研究的唯一目标是分离β-溶血性链球菌，所以选择性培养基是有用的，例如结晶紫血琼脂 平板，可抑制葡萄球菌的生长，可供鼻拭子和来自于皮肤损伤处标本的培养，含有抗生素的更复杂 的选择性培养基不但能抑制革兰氏阴性细菌，而且也能抑制几乎所有的非链球菌的革兰氏阳性细菌，
对于分离链球菌无任何不利影响，通过减少甚至消除竞争性细菌的过度生长，对来源于仅含少量A 群链菌的标本，选择性培养基能增加成功的可能性。
3.3 培养条件
将标本接种在血琼脂平板上(最好用绵羊血)35~37℃在需氧条件下，适合地过夜孵育对大多数标 本的细菌学检查已被广泛地接受。在含有5~10%二氧化碳或在厌氧条件下孵育被接种的平板(平板或 选择血琼脂)在某种程度上可增加A群链球菌的分离率，厌氧孵育可扶持链球菌的生长，并对葡萄球 菌、摩拉克氏菌属(布兰汉菌属)、嗜血杆菌属、棒状杆菌属有一些抑制作用。它使得氧不稳定性链球 菌溶血素O表达，增加溶血带的形成。然而，需氧和厌氧孵育之间的差别对于含有大量A群链球菌 的标本是没有意义的，孵育温度不应超过37℃，因为，太高的温度可以抑制一些A群链球菌菌株的 生长。
在最初的过夜孵育之后，对于没有β-溶血性链球菌生长的所有平板延长孵育24甚至48小时是 好的习惯。
3.4 通过培养物来认识溶血性链球菌
通过培养物来决定A群链球菌的存在主要取决于对血琼脂平板表面溶血性菌落的识别，不同菌 株的溶血性链球菌菌落和其它溶血性细菌一样，其大小，形态，颜色和溶血的特征方面是不同的。
典型的A群链球菌菌落通常为圆形，边缘整齐，菌落直径为0.5~2mm或更大。A群链球菌菌落 有三种主要形状即粘液型、无光泽型、光泽型。粘液型菌落通常较大并有水滴样外观而发光[图4(a)]，
当用接种环接触菌落时，菌落具有粘性，并且往往形成融合性生长，粘液型菌落是由于A群链球菌 菌株产生大量的透明质酸荚膜而形成；无光泽型菌落也被称之为粘液后菌落，菌落扁平，有一不平 整粗糙表面，无光泽型菌落通常是粘液菌落干燥萎陷的结果[图4(c)]；光泽型菌落比其它菌落更小，
呈半球形有一发光的表面，是A群链球菌在生长的过程中不产生荚膜的菌株而形成[图4(d)]，除了 这些被命名的形状外，几种中间型可以被区分[图4(b)]。一般来说，生长形成光泽型菌落的菌株被认 为产生较少的型特异性M蛋白，因此被认为毒力比粘液性菌落或粘液后菌落较小，然而，也有许多 例外的情况，菌株粘液性物质现在被认为是由于透明质酸荚膜的存在，并且与更重要的毒性因子—
—M蛋白的存在没有直接联系。
图4 A群链球菌的菌落形态
(a)粘液型；(b)中间型；(c)无光泽型；(d)光泽型(28)
环绕A群链球菌表面菌落的溶血带的大小通常是菌落直径的2~4倍，在一些菌株，溶血带更宽，
而另一些菌株仅仅存在一狭窄的溶血环，生长在绵羊血琼脂平板上的β-溶血性链球菌和α-溶血性链
球菌的溶血结果比较如图5。
较大的β溶血性链球菌菌落的周围有完全透明的溶血带，而较小的α-溶血性链球菌菌落的周围血 液变色但没完全溶血，大部分A群链球菌菌株产生红细胞完全溶解，然而，在一些菌株在菌落周围 可见类似于α-溶血的绿色的变色，只要在延长培养之后就发展成完全溶血。据报告这种现象是由于 一些链球菌产生混浊因子抑制溶血的结果[29]已有叙述[30、31]，在需氧条件下培养，有一些不产生溶血 的菌株。
在估定链球菌菌株的形态学或溶血性特征时，必须始终记住，这两种特性由于琼脂培养基成份，
琼脂厚度，血液的浓度，被用作血源的动物种类和培养的气体而受到强烈的影响。最好选择绵羊血 而不选用马血或兔血，因为绵羊血不支持溶血性嗜血杆菌的生长，溶血性嗜血杆菌可与血琼脂培养 的A群链球菌相混淆。用人血来制备血平板来进行链球菌的鉴定，一般来说效果是不满意的，因为 从血库获取的血液可能含有一些既能抑制链球菌的生长又能抑制溶血性能的物质(抗生素，枸橼酸盐 等)，人血中抗体的存在(抗-链球菌溶血素O，抗-M蛋白等)也是不受欢迎的，因为使用不同的血琼 脂，A群链球菌重要的形态学特征可发生变化，所以菌落表现的不同形态应该通过接种每一批相同 平板的划区部分，充分地分散以很好地获得单个菌落。
A群链球菌的菌落常常不能和其它的β-溶血性链球菌的菌落区别开，特别是C群和G群，因此 需要采用血清学方法进行最后的鉴定。在同一血琼脂平板上培养，存在不同形态或溶血特征的菌落，
这足以说明，这一混合培养物中有两种或更多的无关联的溶血性链球菌菌株，它们属于不同的血清 群和/或不同的A群血清型。同时存在一种以上的β-溶血性链球菌菌株，尽管在急性感染中很少检出，
但还是能发生的，尤其是在A群链球菌的高流行社区。因此，仔细检查菌落的形态学和溶血特征，
对于链球菌感染的正确的实验诊断和选择供研究链球菌的菌株是必要的。重要的是被收集的供研究 的菌株应该是纯的而无混杂的培养物。假若难于将链球菌与其它的溶血性细菌如嗜血杆菌属，棒状 杆菌属，葡萄球菌或摩拉克氏菌属(布兰汉氏菌属)相区别，可疑菌落涂片革兰氏染色显微镜检查可能 是有帮助的，过氧化氢酶试验也常常有助于区别链球菌，链球菌的过氧化氢酶总是阴性，这可将过 氧化氢酶产生菌予以区别。
图5 β-溶血性链球菌和α-溶血性链球菌溶血特性的比较
3.5 非典型形态学形态
偶尔，生长在血琼脂平板上的原代培养物，溶血性链球菌菌落与上述所描述的不相符合。在A 群链球菌的诊断中能引起混淆的三种形态学和培养变异值得特别提及。
(1)在生长时和血清学分群时可遇见微小的β-溶血性链球菌的菌落，已发现可与A群抗血清起反
应，对于这种形态学特征的一些链球菌，但不是所有的，需要增加二氧化碳的浓度以供生长。虽然，
这些细菌携带的细胞壁碳水化合物抗原与Lancefield A群菌株典型的大菌落形态的细胞壁碳水化合 物抗原十分相同，但多数分类学家认为它们是单独的种，这些微小的链球菌携带有A群抗原。在历 史上,已被英国分类学家分类为麦勒氏链球菌,被美国细菌分类学家作为 A 群咽峡炎链球菌[32~36]。在 欧州和美国链球菌的专门名词通用体系将“麦勒氏链球菌”分成三个种[37]其中的两个种为 constellatus 链球菌和咽峡炎链球菌，可携带Lancefield A群抗原、(A.Efstratiou和R.George的个人通信)。然而，
很重要的是链球菌表现为这种形态学特征但可与A群抗血清起反应，而不被认为是化脓性链球菌并 认为与A群链球菌所致的严重感染(或后遗症)无关。
(2)据报告A群链球菌存在营养差异，并在需氧培养的标准血琼脂平板表面很少生长或完全不生
长[38~41]。在一些情况下，孵育在含有增加了的二氧化碳气体中将出现典型的菌落形态。在其它的例
子中，可能需要特别地补充培养基。偶尔，这些变异菌落生长在血琼脂上仅仅作为卫星菌落围绕在 其它正常菌群细菌的菌落周围。已经显示一些非典型形态的细菌不仅携带有A群碳水化合物抗原，
而且也被证明带有T－蛋白和M－蛋白抗原，并且被认为是真正的A群链球菌[39]。
(3)已被分离出生长在血琼脂平板上的A群菌株缺乏溶血能力，特别有趣的是来自美国Lowry空军基 地的报告，那儿有一种非溶血性粘液型A群链球菌菌株，属于M18型，与一次风湿热的爆发有联系[30]。 因为A群链球菌的鉴定，常常是以认识溶血特征为基础，所以有存在“风湿热基因型”或“肾炎基因型”
的可能。非溶血菌株的变异对临床微生物学工作者来说需要特别的注意，以保证准确的诊断。
3.6 培养结果的报告
原代平皿接种的结果可作为β-溶血性链球菌生长量的半量来评价，常用的有几个系统。一个系 统使用三个类目并限定如下：
1+ <20菌落形成单位(CFU) 2+ >20CFU，但链球菌不占优势 3+ 链球菌占优势或纯培养
另一被通常使用的系统使用如下四个类目
1+ <10CFU 2+ >10但<50CFU
3+ >50CFU但链球菌不占优势 4+ 链球菌占优势或纯培养
在与滤纸条技术对照中，来自于运送培养基(如Stuart运送培养基)运送的拭子培养结果或来自于 生长在选择性或营养丰富的培养基的结果仅仅能被用于解释β-溶血性链球菌的存在或缺乏。
真正的咽部链球菌感染(有临床表现和无症状)如果使用适当的技术常常会出现大量的β-溶血性 链球菌菌落，来自健康携带者的咽喉拭子可出现少量的菌落，但研究发现两者完全不一致。然而，
对于慢性携带者的真正链球菌感染，培养物阳性程度不是一可靠的区别方式[43]。由β-溶血性链球菌 所致的严重的咽部感染，β-溶血性链球菌可以持续存在几周。一新发现的链球菌培养阳性的咽炎病 例，其实可能出现在链球菌“携带者”中非链球菌咽炎的病例中。另一方面，如果不采用适当的技术收 集标本，不合理地解释培养结果，那么，来自正真链球菌感染的标本可能报告出阴性的培养结果。
3.7 链球菌的保存
血琼脂平板上β-溶血性链球菌的贮藏是保存菌株供次代培养的一种可能方式。当密封的Petri平 板避免干燥，保存在冰箱时，许多链球菌的链仍生存在菌落中几周。这种贮藏应该理想地被限制在 2周以内，研究者应该知道用这种方法贮藏菌株，从老菌落所获得次代培养可能增加基因变化的危 险性。
为了维持链球菌菌株基因遗传的完整性，应该避免不必要的实验内容或在允许继续新陈代谢的 条件下延长贮藏时间，为了进行次代培养，最好是用液体培养基(例如血清肉汤)，通常血琼脂培养应 该只被用于检测菌株的纯度，或提供菌落进行肉汤培养。
当一特殊的链球菌菌株需要在实验室存放几天以上时，应深冻血清肉汤培养物。最好贮藏在≤-70℃，
保存被冷冻在滤纸条上的菌株也是可能，在-20℃菌株活力可维持几个月，在-70℃可更长，为了使 菌株长期保存，如果适当进行冷冻干燥的话通常可产生最好的结果，遵守这些所推荐的建议通常有 益于菌株特性的维持，并可避免依靠象采用老鼠传代接种或用人血清传代接种这样一类的技术来人
工增强细菌特性。
3.7.1 冷冻对数生长期分装的血清肉汤培养物
设备和用品
——装有5ml血清肉汤的(含20%正常小牛或马血清的Todd-Hewitt肉汤)的培养管
——新鲜生长在血琼脂平板上的被储藏的链球菌菌株培养物
——无菌的白金丝接种环
——适合供低温冷冻的玻璃小瓶
——培养箱
——冷却器， -20℃或-70℃
方法
1、大量地接种新鲜生长的并充分分散的链球菌菌落于装有5ml血清肉汤的培养管中。
2、37℃孵育4~6小时(对数生长期)。 3、分装培养物，每管0.2~0.5ml。
4、快速冷冻分装的培养物，并贮藏于-70℃下。
5、使用时，每一支装的培养物在30~37℃水浴箱中快速解冻，并用于接种。
评述
·培养基中血清的存在，在冷冻和溶解期间可保护细菌细胞。
·数百株链球菌(0.5ml样本)过夜血清肉汤培养物在-70℃下能连续保存10多年而不被损害，对数 生长期培养物细菌生存率还要好，在-20℃保存虽然效率低，但一般来说，将维护细菌的生命力在几 个月至几年之间。
3.7.2 在滤纸条上干燥
设备和用品
——滤纸条包(见2.2.2节)
——新鲜的生长在血琼脂平板上的被保存的链球菌培养物
——无菌的白金丝接种环
方法
1、用白金丝接种环，从新鲜的生长在血琼脂平板上的培养物转移10~15个链球菌菌落到滤纸条 的一半面积上面，用轻度压力彻底分散菌落。
2、重复上述过程，分散另外的菌落至滤纸条剩下的一半面积上。
3、在将外层铝箔包纸折叠起来之前，应让接种有细菌的滤纸干燥，至少5~10分钟(见2.2.2节)。
4、贮藏在干燥的地方。
评述
·在室温下如果接种有细菌的滤纸条保存在一干燥的环境之中，被干燥在滤纸条上的链球菌能保 留活力至少一个月(适合实验室之间的邮寄)，如果接种有细菌的滤纸条被冷冻在-20℃，生命力可维 持至少几个月，如果被保存在-70℃，生命力可维持更长的时间(可能数年)。
3.7.3 冷冻——干燥(低压冻干法)
用对数生长期(大约 109CFU/ml)的血清肉汤培养物冷冻~干燥已经获得最令人满意的结果。将
0.15ml 容量的培养物冷冻——干燥并在真空下密封。在贮藏期间为了使被冻干的标本长期存活，保
持安瓿中真空状态是必要的。虽然，较低的温度将进一步延长细菌活力，冷冻干燥的菌株能在室温 下贮藏。
为了复醒冷冻干燥的培养物，所密封的安瓿可以按如下方法方便开封，放一滴冷水在安瓿的尖 端加热(在本生氏灯)至高热。使得安瓿上产生微小的裂缝，这可以去掉安瓿内的真空，只要在安瓿的 裂缝部分轻轻一敲便能开封安瓿。用大量的血清肉汤(0.5ml)立即溶解冷冻干燥的内容物并接种到一 血琼脂平板上和/或接种入较大量的营养丰富的肉汤中。
(张连生 译 ／ 唐由凯 游红波 校)
4 、 Lancefield 血清群的鉴定
4.1 概述
临床微生物学报告显示仅仅β-溶血性链球菌的存在对于链球菌的感染的诊断是很不充分的，准 确的临床诊断取决于在感染中所涉及到的链球菌特异性血清学分群知识。R.C.Lancefield博士首先发 展了把链球菌分成若干群的方法，虽然目前已认识了A群至V群(除I和J)，加上假定的W群至Z 群[44]。A群链球菌在大多数重要的人类链球菌感染中起主要作用。一些不属于A群的溶血性链球菌 也能引起呼吸道或皮肤的原发感染，有时甚至引起严重的化脓性或全身感染，但它们与风湿热或(非 常罕见的例外)急性肾小球肾炎的危险性无关联，因此，A群和非A群链球菌感染的治疗和预防的含 意是明显地不同。
大多数链球菌的群特异性抗原是位于细胞壁中的多糖(D群 N群和Q群的群抗原是磷壁酸)并且 能用许多方法提取，因此，群特异性抗原的存在能用群特异性抗血清来证明，如沉淀反应，凝集反 应，免疫荧光法[45]或酶联免疫吸附试验(ELISA)[46]。
现已经描述了许多不同的供群特异性多糖提取的方法，包括用盐酸、甲酰胺或亚硝酸提取或者 采取高压灭菌用生理盐水制备的A群链球菌悬液提取群特异性多糖(见4.3节)，也已经描述了用酶提 取多糖，包括白色链霉菌酶[47]、酶原[48]或用相关噬菌体裂解[49]方法来提取多糖。虽然大多数提取的 群特异性抗原方法需要不同量的过夜肉汤培养物，但亚硝酸和酶法用更少量的细菌就能进行，并且 已经成功的使用从血琼脂平板上所收获的一铂环量的菌落来提取多糖。
沉淀反应被用于提取多糖可用环状试验，毛细玻管试验，双向扩散试验或在琼脂凝胶中或醋酸 纤维薄膜上作对流免疫电泳。凝集反应可用协同凝集试验即用群特异性抗体与含A蛋白的葡萄球菌 结合，或采用乳胶凝集反应。
供链球菌假定菌群鉴定的筛选试验也已经发展，供A群链球菌的有效试验包括杆菌肽敏感试验 和PYR试验(见4.2节)，应该认识到这些试验不是全部可靠，所以应该进行确定性试验。
供血清学分群的抗血清许多生产厂家有商品供应。如果对自己生产抗血清有兴趣的话，可参考 14节所提供的方法。
4.2 初步鉴定
4.2.1 杆菌肽敏感试验
A群β-溶血性链球菌对杆菌肽高度敏感，被用于鉴别A群和非A群链球菌的筛选方法[51]，β-溶 血性链球菌菌株在特异的杆菌肽敏感园片(每片含杆菌肽0.04或0.05IU)周围出现抑菌带可初步鉴定 为A群链球菌。一些研究者也已经报告用含有0.1IU的杆菌肽可获得成功。然而，另一些研究报告 这种浓度可增加显示抑菌带的非A群菌株的数量 [52]。在实践中，杆菌肽的浓度对所有的A群链球 至少保持产生一些抑菌带，另一方面，试验结果对A群菌株不总是特异性的，因为有少数的C群和 G 群链球菌，对杆菌肽显示出相似的敏感性。这种浓度是临界的。不应该使用含更高浓度杆菌肽的
药片。
杆菌肽药片能在实验室制备，但可从几处生产厂家获得商品，随商品药片总是一起提供一份有 供使用和供结果解释的说明书，应该严格遵照执行。
杆菌肽试验应该只使用在链球菌的纯培养物上，而不用在非选择琼脂培养基原代培养物上，如 同任何抗生素敏感试验一样，许多因素能影响试验结果，尤其是使用太少的接种量或血琼脂平板倒 得太薄，可导致特大的抑菌带。
4.2.2 PYR试验
PYR试验是供初步鉴定化脓性链球菌的另一方法，这种试验依靠细菌水解L-吡咯烷酮β-萘胺或 L-焦谷氨酸β-萘胺(PYR)的能力来判断结果。大约98%的A群链球菌出现PYR-阳性，虽然许多其它 的革兰氏阳性过氧化氢酶阴性的细菌(例如肠球菌、需氧球菌)和Gemella链球菌和多种(乳酸乳球菌)
也是 PYR-阳性，因为它们的形态不同是不可能与 A 群链球菌发生混淆的，只有溶血性肠球菌菌株
能引起问题，特别是在马血琼脂上生长比在绵羊血琼脂上生长更容易出现溶血，也有报告显示猪链 球菌菌株和至少一种分离的类马链球菌(C群)为PYR-阳性[55]。其它的研究者已发现一些从人所分离 的C群和G群链球菌为PYR-阳性(A，Efstratiou和R·George个人通信)，因为大范围内的PYR-阳性 的非链球菌存在，所以，应该对链球菌的纯培养物进行这种试验。
有几种PYR试验的形式，包括含PYR的琼脂培养基[54]，由Todd-Hewitt肉汤与PYR组成的PYR 肉汤，和浸有PYR的纸片或滤纸条[55]，商业性试剂的特异性和敏感性与它们几乎相等。用上述任何 一种方法都可获得满意的结果。
4.3 群抗原提取方法
4.3.1 Fuller·s方法(甲酰胺提取法)[56]
设备和用品
——离心机
——油浴加热器，调至160℃
试剂
——A群链球菌Todd-Hewitt肉汤培养物以供抗原提取，37℃孵育17~24小时
——甲酰胺
——盐酸酒精(36%盐酸1ml，95%乙醇99ml)
——丙酮
——盐水，0.85%
——酚红PH指示剂溶液，在28ml氢氧化钠液中，溶解0.1g酚红，0.01mol/l，并用蒸馏水
调容量至250ml。
——氢氧化钠液，0.2mol/l。
方法
1、取5ml Todd-Hewitt肉汤培养物离心(大约1500转30分钟)然后丢掉上浮液。
2、再混悬离心后的沉淀物于0.1ml的甲酰胺中并充分混合。
3、在油浴中加热160℃10分钟，或者直到接近完全溶解。
4、冷却，加0.25ml盐酸酒精并摇动。
5、离心(至少650转 30分钟)收集上悬液却掉沉淀物。
6、加0.5~1.0ml的丙酮(其量取决于沉淀物的多少)以澄清上悬液。
7、离心(至少650转30分钟，收集沉淀物(群特异性多糖)。
8、去掉上浮液，溶解沉淀物于0.3~0.4ml生理盐水中。
9、加1滴酚红液，并用0.2mol/l氢氧化钠调PH至7.2。
评述
·如果提取物太偏碱性，可以发生交叉反应。
4.3.2、Lancefield方法(盐酸提取法)[57]
设备和用品
——离心机
——水浴箱，100℃
试剂
——被用来提取群抗原的链球菌Todd-Hewitt肉汤培养物，35~37℃孵育过夜。
——盐酸，0.2mol/l(可用0.85%盐水制备，见以下评述)
——氢氧化钠，1.0mol/l
——酚红PH指示剂溶液(见4.3.1节)
方法
1、取30~40ml的 Todd-Hewitt肉汤培养物离心(650~1500转30分钟)然后去掉上悬液，如果没 有获得坚实的沉淀物，则需要更高的离心速度或更长的离心时间。
2、再悬浮沉淀物于0.35ml的盐酸中。
3、在沸腾的水浴中(100℃)加热此混悬液。
4、冷却此混悬液至室温，然后加一滴酚红溶液。
5、最初用氢氧化钠1mol/l调PH，当接近终点的时候，用氢氧化钠0.2mol/l进行最后的调节。
6、离心以上液体，然后收集悬浮液(Lancefield提取物)。
评述
·Lancefield热酸提取物不仅含有群特异性抗原而且也含有A群和(和B群)链球菌的型特异性蛋 白抗原，可能也存在其它非特异性蛋白质和非蛋白质抗原。
·二者选一，取10ml的 Todd-Hewitt肉汤培养物或从血琼脂平板培养物收获1/4菌落可为群的确 定提供足够的抗原。
·在一些例子中用大量的培养物(例如取80ml用0.5ml HCl进行提取证明是有用的)。
·Lancefield使用0.2mol/l的盐酸，用0.85%生理盐水制备供链球菌的酸提取物，许多实验室继续 使用这种方式。
4.3.3、El Kholy方法(亚硝酸提取法)[58]
设备和用品
——离心机
——量度为0.12ml和0.06ml的吸管(方法1)巴斯德吸管或微升吸管和尖头(方法2)
——带塞子的小培养试管(12×75mm)供提取物的制备和贮存
试剂
——被用来提取抗原的链球菌Todd-Hewitt肉汤培养物，在35~37℃孵育过夜
——亚硝酸钠，4mol/l
——冰醋酸
——酚红PH指示剂溶液(见4.3.1节)
——氢氧化钠，6mol/l
——生理盐水，0.85% (方法2)
方法1
1、取Todd-Hewitt肉汤培养物离心(1500转30分钟)然后去掉上浮液。
2、在沉淀物中加0.12ml亚硝酸钠和0.06ml的冰醋酸然后彻底混合。
3、在室温下孵育15分钟。
4、加1滴酚红，然后用氢氧化钠中和混悬液至PH7.0。
5、离心以上混悬液，然后收集上浮液(亚硝酸提取物)。
方法2
1、取5ml的 Todd-Hewitt肉汤培养物离心，然后去掉上浮液。
2、加入1滴(大约40μl)生理盐水，并彻底混合。
3、加入2滴(大约80μl)亚硝酸钠和1滴(大约15μl)冰醋酸，然后彻底混合。
4、在室温下(20~22℃)孵育 15~30 分钟，在这一阶段不要紧密封闭试管，因为这一阶段正在产
生能引起危险压力的气体。
5、加入小量的酚红(大约20μl)，然后用氢氧化钠中和混悬液至PH7.0。
6、离心(至少650转30分钟)，然后收集上浮悬液(亚硝酸提取物)。
评述
·用亚硝酸提取这种糖类的方法有二，包括从血琼脂平板上括去 1/2 或 1/4 过夜的培养物，用 0.12ml4mol/l亚硝酸钠和0.06mol/l的冰醋酸混合物(见方法1)或用1滴生理盐水(见方法2)再混悬链 球菌，然后按上述方法制备提取物。
4.3.4 Rantz和Randall方法(高压灭菌提取法)[59]
设备和用品
——离心机
——高压灭菌锅
——量度为0.5ml的吸管
——带塞子的小培养试管(12×75mm)供提取物的贮存
试剂
——Todd-Hewitt链球菌肉汤培养物用于提取抗原，37℃孵育过夜
——生理盐水
——麝香草酚蓝或酚红PH指示剂溶液(见4.3.1和7.1)
——氢氧化钠，1mol/l。
方法
1、离心(1500转，30分钟)40ml 的Todd-Hewitt肉汤培养物然后去掉上浮液。
2、用0.5ml生理盐水再混悬沉淀物。
3、高压灭菌混悬液121℃，20分钟。
4、离心经高压灭菌的以上混悬液，然后收集上浮悬液提取物。
5、用氢氧化钠中和澄清上浮悬液，用麝香草酚蓝或酚红液作为指示剂。
4.4 群抗原提取方法的比较
一般来说，Lancefield热酸提取法是很令人满意的方法，其优点在于一种单一的提取能用于群的 鉴定、M分型和混浊因子的测定。然而，由于用这种方法也提取了其它链球菌抗原，因此，可能与 非群特性异的抗原发生交叉反应。如果试验仔细和用抗血清作吸收试验就能避免这种交叉反应。甲 酰胺提取法，总的来说是不大可能引起交叉反应的，因为蛋白质抗原被消除，这种蛋白质抗原常引 起非特异性反应。加热提取法的缺点是可破坏某些低抵抗力的群特异性抗原(例如 O群)此外，如果
进行M分型的话，必须制备单独的Lancefield提取物。Rantz和Randall法是非常简单的，使用亚硝
酸的El Kholy技术也是如此。已经观察到用异种血清无交叉反应。亚硝酸和热盐酸提取过程有好的
一致性。另一些可能的方法包括用白色链霉菌酶和用酶原B提取，但这儿不讨论这些方法，因为这 些方法没有被广泛使用。酶原B已经被用于一些快速的抗原检测试验之中，但已发现仅用于A群菌 株可靠。
4.5 群抗原检测方法
4.5.1 在毛细玻管中的沉淀反应[60]。 设备和用品
——毛细管玻璃 ，内径0.5~1.2mm ，长5~8cm(见评述)
——非坚硬粘土模型支架
——供擦试毛细玻管的卫生纸或其它柔软的吸水材料
试剂
——群特异性抗血清
——含群抗原的链球菌提取物
——参考A群链球菌多糖抗原
方法
1、间隔1cm排列两支毛细玻管取一毛细玻管吸入群特异性抗血清。
2、擦拭毛细玻管末端，吸入链球菌提取物(吸入 1cm高度的提取物共高2cm)
3、将毛细玻管插入粘土模型支架之中，抗血清在链球菌提取物之上。
4、室温下5分钟后判读结果，在30分钟之后发生的反应不应记录。
评述
·作为常规，所有的提取物应该与A、C和G群抗血清进行试验。
·如果使用有效力的抗血清，用内径0.5~0.9mm毛细玻管甚至少量的抗血清(仅用0.5cm层或更少 的抗血清就能产生强的沉淀反应)将会产生令人满意的反应。效力较弱的抗血清可能需要更大的毛细 玻管(内径0.9~1.2mm)。
·当用手触摸毛细玻管时，必须保持高度清洁，毛细玻管表面上的手指痕迹或其它的污秽可以遮 住弱阳性反应。
·在毛细玻管中的沉淀试验也可被用作环状试验，这个过程与上面描述的一样，在毛细玻管被插 入支架之前，将毛细玻管倒过来，以便抗血清在提取物之下。
毛细玻管沉淀试验如图6所示，注意毛细玻管A中的沉淀反应与用B管中的异种提取物所获得
