UNIVERSITE MENTOURI-CONSTANTINE FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE CHIMIE N° d'ordre:…………..
Série: ……….
THESE
PRESENTEE A L'UNIVERSITE MENTOURI- CONSTANTINE POUR L'OBTENTION DU TITRE DE
DOCTORAT en SCIENCES
SPECIALITE: CHIMIE ORGANIQUEOPTION: PHYTOCHIMIE Présenté par Brahim Harkati
THEME
Soutenue le 17 janvier 2011 Devant la commission d'examen:
K. Medjroubi Prof. Université Mentouri, Constantine Président S. Akkal Prof. Université Mentouri, Constantine Rapporteur M-G. Dijoux-Franca Prof. Université de Lyon, France Co-encadreur N. Ghuerraf MC Université larbi ben M'hidi, Oum El- Bouaghi Examinateur D. Harzallah Prof Université Ferhat Abbas, Sétif Examinateur
VALORISATION ET IDENTIFICATION STRUCTURALE DES
PRINCIPES ACTIFS DE LA PLANTE DE LA FAMILLE
Dédicace
Cette thèse est dédiée à :
A la mémoire de ma mère
A mon père
Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de thèse, Monsieur le Professeur AKKAL Salah pour m’avoir accueilli au sein de son groupe de recherche et permis de faire mon travail de thèse dans l’environnement stimulant d’un groupe de recherche très
dynamique. Je le remercie également de m’avoir donné la possibilité de présenter mes résultats dans une publication scientifique.
J’ai eu la chance et aussi le plaisir d’effectuer ce travail de recherche dans le laboratoire de Botanique et Pharmacognosie, faculté de médecine et pharmacie de Lyon France dirigé par le professeur M-Geneviève Dijoux-Franca. Je tiens à lui exprimer mes sincères
remerciements pour m’avoir accueilli au sein du laboratoire de pharmacognosie, pour m’avoir fait confiance et m’avoir permis de réaliser ce travail dans de meilleures conditions tout en me laissant une grande liberté, pour son soutien et sa grande générosité. Je le remercie également d’avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse.
Mes vifs remerciements vont également à Monsieur le professeur Kamel Medjroubi de l’Université Mentouri de Constantine pour le grand honneur qu’il nous a fait en acceptant de présider le jury de ma soutenance de thèse de doctorat.
J’aimerais également remercier Monsieur le Professeur D. Harzallah de l’Université de Sétif pour avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse.
J’adresse également mes remerciements à Monsieur Nour-eddinne Gherraf Maître de conférences à l’Université de Oum El Bouaghi pour avoir accepté de juger ce travail.
Je remercie sincèrement Monsieur le Professeur Hocine Laouar de l’Université de Sétif pour l’identification du matériel végétal.
Je remercie sincèrement madame Christine bayat ingénieur du laboratoire de Botanique et Pharmacognosie de la faculté de médecine et pharmacie de Lyon, qui m’a guidé tout au long de ce travail travail au laboratoire de pharmacognosie Lyon. Recevez ici l’expression de ma profonde gratitude.
. Je remercie également tous les membres du laboratoire de Lyon pour leur soutien et les facilités accordées pour la réalisation de ce travail : Monsieur le Maître de conférences Joël, Monsieur le Dr Serge et Madame Monique et Darbour
J’exprime également mes remerciements à mes collègues de laboratoire qui participent au bon fonctionnement du laboratoire, avec lesquels il est possible d’échanger conseils et informations, et qui assurent une atmosphère agréable de travail : Noufou, Zabat, Safa, stéphane et Michelle.
Introduction générale ……….. 1
Référence ……….. 3
Chapitre I I Etude botanique ……… 4
I.1 Caractère généraux des Astéracées ……… 4
I.1.2 Appareil reproductif ………... 4
• L’inflorescence ………...….. 4
• La fleur ……….. 5
• Fruits ……….. 5
• Graine ……….... 5
I.1.3 Classification des Astéracées ………. 5
I. 2 Travaux antérieurs et principaux métabolites secondaires isolés du genre Scorsonera 6 I. 2.1 Triterpènes ………... 6 I. 2.2 Les flavonoïdes ………. 08 I. 2.3 Les coumarines ……….. 10 I. 2.4 Les sesquiterpènes ………... 11 I. 2.5 Divers ………... 12
I. 2.6 Les huiles essentielles ……… 13
I. 3 Les terpènes ………... 14 I. 3.1 Généralités ………... 14 I. 3.2 Classification ………. 14 I. 3.2.1 Hémiterpènes ………... 14 I. 3.2.2 Monoterpènes ………... 14 I. 3.2.3 Sesquiterpènes ………... 14 I. 3.2.4 Diterpènes ……….. 15 I. 3.2.5 Triterpènes ………... 16 I. 3.2.5.1 Introduction ………... 16
I. 3.2.5.2 Biosynthèse des triterpènes ………... 18
I. 3.2.5.3 Intérêts des triterpènes ………... 22
I. 3.2.6 Tetraterpènes………... 22
I. 3.2.7 Polyterpènes……… 22
I.4 Les flavonoïdes ……….………... 22
I.4.1 Variation de la structure de l’élément centrale en C3 des flavonoïdes 23 I.4.2 Intérêt des flavonoïdes ……….….. 25
I.4.3 Analyse structurale des flavonoïdes ……….. 26
I. 4.3.1 Spectroscopie UV-Visible ………..…... 26
I.4.3.2 Résonance Magnétique Nucléaire (R. M. N) ………...…... 28
I.4.3.2. a R. M. N. du proton ………...….. 28
I.4.3.2. b Analyse des signaux provenant des protons de la partie osidique 29 I.5 Coumarine ………. 29
I.5.1 Classification ………. 29
I.5.1.1 Coumarines simples ……….….. 30
I.5.1.2 Furanocoumarines ……….. 30
I.5.2 Biosynthèse des coumarines ……….. 33
I.5.3 Intérêt des coumarines ……….….. 36
I.6 Les huiles essentielles ……….…... 37
I.6.1 Procède classique d’extraction des huiles essentielles……….….. 37
I.6.2 Production des huiles essentielle : l’hydrodistillation……….…... 38
I.6.4 Principales structures chimiques des huiles essentielles………….…... 39
I.6.5 Analyse chromatographique et identification des constituants dans un mélange 42 I.6.6 Les huiles essentielles et leur activité anti-microbienne…………... 43
I.7 Activité antiradicalaire sur DPPH……….. 44
Référence ……….. 45
Chapitre II II Etude phytochimique de Scorzonera Undulata…………... 52
II.1 Introduction ……… 52
II.1.2 Position systématique ………... 52
II.1.3 Synonymie du Scorsonera Undulata ………. 53
II.1.4 Description de la plante Scorsonera Undulata ………. 53
II.1.5 Air géographique ……….. 53
II.1.6 Utilisation traditionnelle de Scorzonera Undulata ……… 55
II.2 Travaux personnels ……… 55
II.2.1 Récolte de la plantes Scorsonera Undulata ……….. 55
II.2.2 Extraction des racines de Scorsonera Undulata ………... 55
II.2.3 Fractionnement et Séparation Grossière de L’extrait DCM ………….. 55
II.2.4 Étude de la fraction su14b ………. 57
II.2.4 .1 Colonne ouverte pour la faction SU14b………. 57
II.2.5 Etude de la fraction SU15e ………. 60
II.2.6 Etude de la fraction SU14d ………. 61
II.2.6 Etude de la fraction SU14g……….. 61
II.2.7 Etude l'extrait méthanolique ……….. 62
II.2.7.1 Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)………. 63
II.2.7.1 Purification de l’extrait MeOH ……….. 64
II.2.7.1.a. Purification par colonne ………. 64
II.2.7.2 Etude la fraction SU49a ………. 65
II.2.7.3 Etude de la fraction SU50 n ………... 66
II.2.7.4 Etude de la fraction SU49e ……… 67
II.2.8 Détermination des huiles essentielles dans Scorsonera Undulata 67 II.2.8.1 Mode opératoire ………... 68
II.2.8.2 Analyse par spectrométrie de masse.……….. 69
II.2.9 Activité antioxydant ……….. 71
II.2.9.1 Technique ……….. 72
II.2.9.2 Résultats ………... 73
II.2.10 Activité microbienne ………. 76
II.2.10.1 Préparation des dilutions des huiles essentielles………... 76
II.2.10.2 Ensemencement de la souche bactérienne……….. 76
II.2.10.2 Ensemencement de la souche bactérienne……….. 76
Chapitre III
III Détermination structurale des composés isolés ……… 80
Appareillage……… 80
III.1 le composé SU 23a ……… 81
III.2 le composé SU 37a ………... 91
III.3 le compose SU50i ………. 95
III.4 le composé SU56C ……… 101
III.5 le compose SU 70a ………... 110
III.6 le compose SU 28C ………... 120
III.7 Interprétation des huiles ………. 123
III.7.1 Etude comparative ………. 124
III.7.2 Test antibactérien sur Escherichia coli………... 124
III.8 Interprétation de l’activité biologique……… 125
Référence……… 126
1, 2, … Symboles utilisés pour les composés mentionnés dans la littérature
SU 23, 37 Symboles utilisés pour les composés identifiés dans cette étude
MeOH Méthanol
DMSO Diméthylsulfoxyde
CDCl3 Chloroforme deutérié
TFA acide trifluoroacétique
GC-MS chromatographie gazeuse coupleé à la
spectrométrie de masse
SM Spectroscopie de masse
EI impact électronique
uma Unité de masse atomique
UV Ultraviolet
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
RMN 1H Spectre Résonance Magnétique Nucléaire du
proton
RMN 13C Spectre Résonance Magnétique Nucléaire de
carbone 13
DEPT 135 Spectre de carbone 13 réalisé en Distortionaless
Enhancement by Polarisation transfer
HMQC Heteronuclear multiple Quantum Corrélation
HMBC Heteronuclear multiple Bond Connectivity
COSY Spectroscopie de corrélation
Et al. Et autre auteurs
CCM Chromatographie sur couche mince
ppm Partie par million
δ Déplacement chimique nm Nanomètre Hz Hertz J Constante de couplage s Singulet d Doublet
dd Doublet des doublets
HPLC chromatographie liquide haute performance
MPLC chromatographie moyen pression
VLC chromatographie liquide sous vide
RP18 Silice greffée
CI50 Concentration inhibitrice 50 %
DPPH 1-1 Diphényl 2- Picril Hydrazine
Rf Rapport frontal
I indice de Kovats
HE huile essentiel
NADPH nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
IPP isopentényl diphosphate
1
Introduction
Dans le règne végétal, les métabolites secondaires jouent des rôles écologiques importants, notamment en contribuant aux phénomènes de communication et de défense.
Depuis l’antiquité, quelques caractéristiques des principes actifs étaient connues pour l’homme et certaines épices ont été utilisées pour leurs particularités de parfum, leur saveur et leur effet de conservateur Bauer et al [1]. L’exploitation de ces composés s’effectuait sous forme d’huiles extraites de plantes (huiles essentielles) par le moyen de la distillation, cette technique étant employée en Inde et Perse il y a plus de 2000 ans [2].
La majorité des populations ont recours à des plantes médicinales pour se soigner, par manque d’accès aux médicaments prescrits par la médecine moderne mais aussi parce que ces plantes ont souvent une réelle efficacité. Aujourd’hui, le savoir des tradipraticiens est de moins en moins transmis et tend à disparaître. C’est pour cela que l’ethnobotanique et l’ethnopharmacologie s’emploient à recenser, partout dans le monde, des plantes réputées actives et dont il appartient à la recherche moderne de préciser les propriétés et valider les usages Pelt [3]. La recherche de nouvelles molécules doit être entreprise au sein de la biodiversité végétale en se servant de données ethnopharmacologiques. Cette approche permet de sélectionner des plantes potentiellement actives et d’augmenter significativement le nombre de découvertes de nouveaux actifs [4].
L’Algérie, pays connu par ces ressources naturelles, dispose d’une flore singulièrement riche et variée. On compte environ 3000 espèces de plantes dont 15% endémique et appartenant à plusieurs familles botaniques [5].
L’objectif de mon travail de thèse consiste à la valorisation de la flore de la région aride de l’Est Algérien, par la recherche des composés qui peuvent trouver une utilisation thérapeutique. Pour cela, une plante, de la famille Asteraceae, a fait l’objet d’une étude phytochimique : scorzonera undulata
Ce travail sera présenté comme suit :
L’état des connaissances bibliographiques botaniques et phytochimiques sur le genre Scorzonera et leur famille Asteraceae sera présenté dans un premier chapitre
2
Dans un deuxième chapitre, nous aborderons un aperçu général sur les composés terpéniques, notamment, les triterpènes et les flavonoïdes
Le troisième chapitre sera consacré au travail personnel consistant en la séparation et la purification des composés obtenus. Nous présenterons également dans ce chapitre une activité antioxydante d’extrait apolaire et polaire et une activité antimicrobienne des huiles essentielles.
L’interprétation des résultats et la détermination structurale des composés isolés seront détaillées dans le quatrième chapitre.
Enfin, une conclusion générale qui portera sur une lecture attentive des différents résultats obtenus.
3
Références
1. Bauer, K., D. Garbe, and H. Surburg. 2001. Common Fragrance and Flavour Materials: Preparation, Properties and Uses Wiley-VCH,, Weinheim
2. Guichard, E. 2002. Interactions between flavor compounds and food ingredients and their influence on flavor perception. Food Reviews International 18: 49-70.
3. Amélie, L (2007). Contribution a l’étude phytochimique de quatre plantes malgaches 4. Pelt J.M. (2001) Les nouveaux actifs naturels. Marabout. Paris
5. Gaussen H., and Leroy H. F., (1982). Précis de botanique, végétaux supérieurs, 2eme Ed., 426.
4
I ETUDE BOTANIQUE
I.1 Caractère généraux des Asteraceae
Le mot « Aster » du grec signifie étoile, en relation avec la forme de la fleur. Les Asteraceae (anciennement appelées Composées) sont une famille appartenant aux Dicotylédones comprenant plus de 1500 genres et plus de 25000 espèces décrites dont 750 endémiques, C'est une des familles la plus importante des Angiospermes. Ce sont presque toujours des plantes herbacées avec souvent des racines charnues : rhizomateuses, tubéreuses ou pivotantes [1].
Cette famille présente des caractères morphologiques divers : herbes annuelles ou vivaces, plus rarement des arbustes, arbres ou plantes grimpantes et quelques fois, plantes charnues [2]. Bien que généralement ce soit des plantes herbacées à feuilles isolées [1]. L'aspect de l’appareil végétatif est trop variable pour caractériser les Asteraceae sur ce seul critère. En revanche, cette famille est très homogène au niveau de ses inflorescences très caractéristiques : le capitule.
Le fruit est un akène généralement surmonté d’un pappus provenant du calice.
I.1.2 Appareil reproductif • L’inflorescence
L’inflorescence des Asteraceae est le capitule.
Un capitule comprend un réceptacle plan ou plus moins bombé sur lequel sont insérés de l'extérieur vers l'intérieur, en ordre spirale :
- D’abord des bractées stériles vertes (parfois écailleuses, à crochets ou épineuses) formant un involucre.
- Ensuite des petites bractées fertiles non vertes ou paillettes, axillant chacune une fleur.L’ensemble forme une inflorescence composée, d’où l’ancien nom de la famille. Les capitules sont parfois isolées (pâquerette), mais, plus généralement ils sont à leur tour diversement regroupés :
- en grappe, en épi, en cyme, ou encore en corymbe chez le groupe des Radiées, voire en
5
Figure [I.1] : Inflorescence en capitule. • La fleur
Les fleurs sont donc regroupées en capitules qui peuvent compter plusieurs centaines de fleurs. Les capitules sont parfois réduits à quelques fleurs (genre Achillea) voire, exceptionnellement à une seule fleur (genre Echinops) [2].
Les fleurs sont sessiles, axillées par une bractée mère. Le calice est très réduit.
Ces fleurs, à pétales soudées, peuvent être tubuleuses (on parle de fleurons) ligulées (on parle de demi-fleurons) ou très rarement bilabiées.
Il y a 5 étamines dont les anthères sont soudées en tubes (androcée synanthérée). L'ovaire, formé de 2 carpelles est uniloculaire et ne possède qu'un ovule.
• Fruits
Ce sont des akènes (fruits secs indéhiscents uniséminés) possédant, le plus souvent, un pappus provenant du développement du calice après la fécondation.
• Graines
Elles sont exalbuminées.
I.1.3 Classification des Asteraceae On distingue quatre sous familles [2]: • Tubuliflores ou carduacées
• Liguliflores ou chicoracées • Labiactiflores
6
Tableau [I.1] : Classification des Asteraceae [3].
I. 2 Travaux antérieurs et principaux métabolites secondaires isolés du genre Scorsonera
Le genre Scorsonera fait partie de la famille Asteraceae dont les représentants, de part leur intérêt économique et thérapeutique, ont fait l’objet de nombreuses études phytochimiques. Néanmoins, vu le nombre d’espèces non encore étudiées, ce genre constitue encore une source importante des produits naturels tel que les terpènes, les coumarines, les flavonoïdes et d’autres métabolites secondaires tels que, les sesquiterpènes etc…. Voici quelques exemples de molécules des principales classes de métabolites secondaires dans le genre Scorsonera.
I. 2.1 Triterpènes
Les espèces du genre Scozonera renferment des triterpenoïdes en particulier à squelette tétracyclique telle que: β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, (3 β, 22E)-stigmasta-5,22-dien-3-yl, stigmasta-5,22-diene, stigmasterol 3-O-β-glucoside,…. Des triterpènes à squelette
SOUS-FAMILLE TUBULIFLORES LIGULIFLORES LABIATIFLORES RADIEES
Capitules homogames homogames homogames ou
hétérogames hétérogames Fleurs Tubuleuses +/- Fleurons Ligulées à 5 dents Demi-Fleurons Bilabiées en périphérie Tubuleuses au centre ou seulement Bilabiées Ligulées à 3 dents à la périphérie, tubuleuses au centre
Libre interne non non non non
Canaux sécréteur
Dans l’endoderme
dédoublé non non
Dans l’endoderme dédoublé
Lactifères non Articulés, en
réseau non non
Cellules sécrétrices isolée
Dans le liber de la
tige non non non
7
pentacyclique sont également présents dans le genre de scozonera tel que: lup-20(29)-en-3-ol, acide oléan-12-én-28-oïque.
Les composés terpéniques (tableau I.2) ont été également isolés des plantes : S. columnae,
tomentosa, hispanica …etc
Tableau [I.2] : Triterpènes tétracycliques et pentacycliques de quelques espèces du genre Scorzonera. Plante Structure Réf Scorzonera columnae pr-i HO Me H Me H Me Et H 1 Stigmast-5-en-3 β -ol Me O HO Me Me H Me H Me Me H 2 Lup-20(29)-en-3 β -ol 4 pr-i O Me H Me H Me Et H O HO OH HO HO 3 Stigmasta-5,22-diene, 3 β -( β -D-glucopyranosyloxy)- Me O AcO Me Me H Me H Me Me
4 Lup-20(29)-en-3 β -ol, acetate
Scorzonera tomentosa pr-i HO Me H Me H Me Et H 1 Stigmast-5-en-3 β -ol Me O HO Me Me H Me H Me Me H 2 Lup-20(29)-en-3 β -ol 5 Scorzonera hispanica Me Me Me Me HO Me Me H CO2H H H Me 5 Olean12en28oic acid, 3 β -hydroxy- pr-i O Me H Me H Me Et H O HO OH HO HO 6 β -D-Glucopyranoside, (3β)-stigmast-5-en-3-yl 6
8
I. 2.2 Les flavonoïdes
Les flavonoïdes sont des composés phénoliques moins répandus dans ce genre. Ils sont présents dans presque tous les organes de la plante (racines, fleurs, tiges et jouent un rôle
pr-i HO Me H Me H Me Et H 7 Stigmasta-5,22-dien-3-ol, (3β,22E)- pr-i HO Me H Me H Me Et H 1 Stigmast-5-en-3 β -ol Scorzonera mongolica CH2OH R R= O O 8 3β-tetradecanoyloxy-28-hydroxylolean-18-ene R= O O 9 3 β -dodecanoyl-28-hydroxylolean-18-ene 7
9
important dans le système de défense comme antioxydants. Chez le genre Scorsonera, les flavonoïdes sont surtout représentés comme flavones et flavonols.
Tableau [I.3] : Structures chimiques des flavonoïdes isolés de quelques espèces du genre Scorsonera. Plante Structure Réf OH O OH OH OH 10 Quercétine OH O OH OH OH HO 11 Luteoline Scorzonera columnae OH O OH HO OH 12 Apigenine O O O O HO HO OH O OH OH HO OH O OH OH S R R S R 13 Quercetine 3-(6-E-p-coumaroyl-β-D- glucopyranoside) 4 Scorzonera austriaca O OH HO O OH O O OH OAC HO CH2O C O C C OH H H 14 luteolin 3′-(6-E-p-coumaroyl-β-D-glucopyranoside) 8
10
I. 2.3 Les coumarines
Les coumarines sont très répandues dans le genre Scorzonera, on les trouve sous forme de coumarines simples et pyrano-coumarines ainsi que de dimères de coumarines avec liaisons C-C ou éther [9].
Tableau [I.4] : Les coumarines isolées de quelques espèces du genre Scorzonera. Plante Structure Réf Scorzonera tomentosa O O O O OH OH OH OH OMe 15 1H-2-Benzopyran-1-one, 3-[4-(β- D-glucopyranosyloxy)phenyl]-3,4- dihydro-8-methoxy-, (3S)- O O OH OMe 16 1H-2-Benzopyran-1-one, 3,4- dihydro-3-(4-hydroxyphenyl)-8-methoxy- 10 O O HO OCH3 OH 17 1H-2-Benzopyran-1-one, 3,4- dihydro-6,8-dihydroxy-3-(4-methoxyphenyl)- O O O O HO HO H HO OCH3 OH 18 1H-2-Benzopyran-1-one, 8- (β-D-glucopyranosyloxy)-3,4- dihydro-6-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-, Scorzonera cretica O O O O O O HO HO OH H HO OCH3 OH HO HO H3C 19 1H-2-Benzopyran-1-one, 8-[[6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl))- β -D-glucopyranosyl] oxy]-3,4-dihydro-6-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)- 11 Scorzonera austriaca O O 20 Daphnetin 8
11
I. 2.4 Les sesquiterpènes
Les sesquiterpènes constituent un groupe de substances naturelles très importantes dans le genre de Scorzonera ayant une large variété d’activités biologiques. Ils ont possèdent des propriétés ; neurotoxique [12], inflammatoire [13], anti-leucémique [14], antifungique [15], anti-tumoral [16].
Tableau [I.5] : Les sesquiterpènes isolées de quelques espèces du genre Scorzonera.
Plante Structure Réf Scorzonera austriaca Me Me HO O H 2C OH O H H H H R R S R R R S 21 Azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one, decahydro-3,8-dihydroxy-3,9-dimethyl-6- methylene- 17 Me H 2 C O CH 2 O O O HO CH 2 HO OH OH 22 Azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one, -(β-D-glucopyranosyloxy)decahydro-3- methyl-6,9-bis(methylene)-, 18 Scorzonera hispanica H 2C O CH 2 H2 C O O O HO HO OH OH H H H H H R S R S R R R R S S 23 Azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one, 5-(β-D- glucopyranosyloxy)decahydro-3,6,9-tris(methylene)-, 19
12
I. 2.5 Divers
Tableau [I.6] : Les diverses isolées de quelques espèces du genre Scorzonera.
Scorzonera Tomentosa - MeO CO 2 H OH E
24 Benzoic acid, 2-[(1E)-2
-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]-6-methoxy O O OH OH OH H S R 25 1(3H)-Isobenzofuranone, 7- hydroxy-3-[(R)-hydroxy(4-hydroxyphenyl)methyl]- 10 Scorzonera hispanica Me Me Me CHO O 26 2-Heptenal, 2-methyl-6-(4-methyl-2-oxo-3-cyclohexen-1-yl)- 19 Scorzonera columnae OMe CH CH C O OH HO
27 2-Propenoic acid, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-, methyl ester
4 Scorzonera hispanica HO O OH OMe O O OH OH OH OH OMe 28 β-D-glucopyranoside, 4-[(2R,3S)-2,3-dihydro-3-(hydroxymethyl)-5-[(1E)-3-hydroxy-1-propen-1-yl]-7-methoxy-2-benzofuranyl]-2-methoxyphenyl 6
13
I. 2.6 Les huiles essentielles
Le genre Scorzonera est connu pour produire des huiles essentielles.
- Les travaux de Boussaada et al [20] sur la partie aérienne de Scorzonera undulata. Ont permis d’identifier une quarantaine de composés tels que le méthyle hexadecanoate (30.4%), le méthyle Linolenate (23.9 %), le Heneicosane (12.2 %), le Octadecane (4.4 %), méthyle Octadecanoate (2.2 %), acide Dodecane (1.7 %), β-Bisabolol (1.2 %), et le Benyle Salicylate (1,3 %)sont les plus abondants.On peut conclure que la composition chimique de cette huile essentielle est :
• Hydrocarbure (alcane, alcène, alcool, alddehydes) 23.3 % • Terpène 3.4 %
• Composés aromatiques 60.1 %
Cette huile essentielle s’est révélée active in vitro contre le champignon microscopique.
- Les composés majoritaires des huiles essentielles dans Scorzonera mongolica sont: Hentriacontane (34.75%), A'- neogammacer-22 (29)-en-3β-ol (21.47%) [21].
HO O OH OMe O O OH OH OH OH OMe OMe 29 β -D-glucopyranoside, 4-[(2R,3S)-2,3-dihydro-3-(hydroxymethyl)-5-[(1E)-3-hydroxy-1-propenyl]-7-methoxy-2-benzofuranyl]-2,6-dimethoxyphenyl Scorzonera austriaca HO O OH OCH 3 30 12-Hydroy-desmethoxyyangonin GLUO O OH OCH3 31 12-β-d-glucopyranoside- desmethoxyyangonin 8
14
I. 3 les terpènes I. 3.1 Généralités
Dans le règne végétal, les terpènes sont classés dans la catégorie des métabolites secondaires. Leur classification est basée sur le nombre de répétitions de l’unité de base isoprène (à 5 atomes de carbone) [22, 23, 24]. A ce jour, avec plus de 30 000 molécules identifiées, les terpènes constituent l’une des plus polymorphes et des plus grandes familles de composés naturels: hémiterpènes (C5), monoterpènes (C10), sesquiterpènes
(C15), diterpènes (C20), sesterpènes (C25), triterpènes (C30), tetraterpènes,(C40) et
polyterpènes.
I. 3.2 Classification I. 3.2.1 Hémiterpènes
Dans la nature, il existe peu de composés naturels ayant une formule de C5
ramifiée; parmi certains composés naturels trouvés chez les plantes qui peuvent être considérés comme hémyterpène, seul l’isoprène à toutes les caractéristiques biogénétiques des terpènes [25].
I. 3.2.2 Monoterpènes
Les monoterpènes contiennent plus de 900 composés connus se trouvent principalement dans 3 catégories structurelles: les monoterpènes linéaires (acyclique), les monoterpènes avec un cycle unique (monocycliques) et ceux avec deux cycles (bicycliques). Ils résultent d’une fusion typique tête-à-queue des unités d’isoprène [26].
I. 3.2.3 Sesquiterpene
Sesquiterpenoids sont des composés de 15 carbone formée de 3 unités isopérene et comme formule moléculaire C15H24. Ils se trouvent principalement dans les parties
ariennes des plantes. Comme les monoterpènes, une molécule de sesquiterpène peut être acyclique ou contenir 1 à 2 cycles (comme le polygodial), de très nombreuses combinaisons sont possibles. Les dérivés des sesquiterpènes obtenus par biochimie ou synthèse (oxydation ou réarrangement) sont appelés sesquiterpenoïdes. Les sesquiterpènes sont présent dans les essences végétales aromatiques ou huiles
15
essentielles, par exemple le farnésol dans l'huile essentielle de citronelle. Dans les plantes, ils ont le rôle d'agent de défense.
OH HO 32 Farnésol 33 Nerolidol 34 Acide Abscisique 35 Cadalene HO HO CHO OH OH CHO OH OH 36 Gossypol
Figure [I.2] : Structures des quelques sesquiterpènes.
I. 3.2.4 Diterpènes
Les diterpènes sont des substances avec 20 atomes de carbone (C20) présentant
une très grande variété structurale. Ces composés sont principalement présents dans les plantes supérieures dans les résines, ainsi que dans les champignons. Il existe environ 2700 diterpènes dans la nature dont la majorité est sous forme cycliques. Parmi les diterpènes cycliques, Le rétinol et le rétinal, deux formes de la vitamine A sont les plus connues dans cette famille.
CO2H
O
16
I. 3.2.5 Triterpènes I. 3.2.5.1 Introduction
Les triterpènes contiennent plus de 4000 composés construits sur plus de 40 squelettes hydrocarbonés différents. Ce sont des composés en C-30 issus de la cyclisation du 3S-2,3-époxysqualène, ou plus rarement du squalène lui-même [22, 23,24]. Ils sont presque toujours hydroxylés en position C-3 du fait de l’ouverture de l’époxyde. Les triterpènes présentent une très forte unité structurale, les différences majeures sont d’ordre stéréochimiques ayant trait à la conformation adoptée par l’époxysqualène avant la cyclisation initiale. Le cation formé lors de cette cyclisation peut ensuite subir une série de déplacement 1, 2 de protons et de méthyles conduisant aux différents squelettes tétra- et pentacycliques qui caractérisent ce groupe de substances naturelles [22, 23,24]. HO H H 37 Euferol 38 Cycloeucalénol H H HO2C H O H O H H OH
39 acide 3,4-seco-8βH-ferna-4(23) ,9(11)-dièn-3-oïque 40 antiquol
Figure [I.3] : Triterpène tétracycliques.
17 H H H AcO
41 D: C-friedomadeir-7 42 Isomadeiranyl acétate H H H OH
43 Taraxéryl acétate 44 Taraxérone
H H H OH 45 β-amyrine
Figure [I.4] : Triterpènes pentacycliques.
H H H O H H H O
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I. 3.2.5.2 Biosynthèse des triterpènes
Les organismes végétaux ont la possibilité de cycliser l’époxysqualène qui conduit spécifiquement aussi bien aux triterpènes tétracycliques libres des plantes de la famille des Euphorbiaceae et des Laticiferes qu’aux saponosides à génine triterpénique pentacyclique ou aux triterpènes modifiés des Rutales [22,23].
Le couplage queue-à-queue de deux unités en C-15, farnésylpyrophosphate (FPP) suivi d’une oxydation permet l’élaboration de l’époxysqualène (figure I.5), précurseur des triterpènes et des stéroïdes [22, 23,24].
OPP squalène Oxydation O 46 2,3-époxydosqualène
Figure [I.5] : Formation du squalène.
L’ouverture de l’époxyde amorce la cyclisation, l’enzyme responsable de cette cyclisation stabilise la conformation du polyisoprène de telle sorte que les impératifs stéréoélectroniques soient respectés. C’est de la conformation initiale de l’époxysqualène sur la surface de l’enzyme (figure I.6) que dépend l’orientation de la biosynthèse vers les triterpènes tétra- et pentacycliques et les stéroïdes [22, 23,24]. - Si l’époxysqualène est dans une conformation chaise-bateau-chaise-bateau, la cyclisation conduit à un cation protostanyle précurseur des cycloartanes, des lanostanes et des cucurbitanes.
OPP +
19
- Si l’époxysqualène adopte la conformation chaise-chaise-chaise-bateau, la cyclisation aboutit à un autre cation appelé dammaranyle. Ce dernier peut évoluer afin de donner naissance aux triterpènes tétracycliques à squelette euphane et tirucallane et le plus souvent il conduit aux triterpènes pentacycliques de type oléanane, ursane, lupane, multiflorane, taraxérane, taraxastane,….etc.
O O H HO H R + H HO H R +
cation protostanyle cation dammaranyle
1 2
O
20 1 2 HO H 47 Cucurbitanes 48 cycloartanes Stéroïdes cation dammaranyle HO H H H + HO H H H H 49 cations lupanyle
Figure [I.6] : Biosynthèse des triterpènes.
HO
H H
HO
H
21 cation lupanyle HO H H H H + HO H H H H 44 multiflorénol HO H H H HO H H H + HO H H H 45 β-amyrine 50 taraxastérol HO H H H 51 α- amyrine HO H H H
22
I. 3.2.5.3 Intérêts des triterpènes
L’utilisation industrielle et l’intérêt thérapeutique des triterpènes et stéroïdes représentent un enjeu capital dans le domaine de la recherche des substances naturelles. Les propriétés pharmacologiques diverses [22,24] attribuées à ces composés ont permis leur classement en tant qu’un groupe de métabolites secondaires de grande importance. Ces composés manifestent entre autres :
- des potentialités thérapeutiques dans les différents domaines : cytostatiques, anti-inflammatoires, analgésiques, insecticides, molluscicides, …..etc.
-un intérêt considérable dans le secteur de l’industrie pharmaceutique particulièrement la production de médicaments stéroïdiques ayant des propriétés : contraceptifs, anabolisants, antiinflammatoires,…etc.
- un intérêt thérapeutique concernant l’extraction des molécules bioactives, pour l’obtention des formes galéniques simples ou pour celle de préparation phytothérapique. - une importance économique du fait de leur utilisation dans les industries
agroalimentaires.
I. 3.2.6 Tetraterpènes
Les caroténoïdes sont des tetraterpènes, les plus typiques étant les apocaroténoïdes, les diapocaroténoïdes, les mégastigmanes.
I. 3.2.7 Polyterpènes
Les polyterpènes ou polyisoprènes se composent de plus de 8 unités d’isoprène. Ces terpènes se trouvent souvent sous deux formes isomèriques et trans. Le cis-polyisoprène se trouve dans le caoutchouc indien, alors que le cis-polyisoprène-trans est la partie principale de gutta-percha. En plus Chicle représente un mélange de 1:2 de deux isomères cis- et trans-. Les prenylchoinones sont des polyterpènes comptant jusqu'à 10 unités d’isoprène, parmi eux, on rencontre les vitamines K1 et K2 et la vitamine E.
I.4 Les flavonoïdes
Les flavonoïdes sont une classe de composés ubiquitaires dans les plantes vasculaires et représentent un des plus grands groupes de produits naturels phénoliques. Ils sont considérés comme les pigments universels des végétaux. La protection des plantes contre les radiations UV de type B et leur défense contre les herbivores et les
23
attaques microbiennes Harborne et al. [27]. Certains flavonoïdes ont parallèlement une activité antioxydante, anti-inflammatoire, vasculaire, oestrogénique et antitumorale. Pour ne citer que leurs principales propriétés pharmacologiques [27]. Ces composés se divisent en différents types : flavones, isoflavones, flavonols, flavanones, flavanes, chalcones, anthocyanidines, catechines, ptérocarpanes, aurones.
I.4.1 Variation de la structure de l’élément centrale en C3 des flavonoïdes
La figure (I.7) donne le schéma des réactions qui permettant d’interpréter la formation des principaux flavonoïdes à partir des chalcones [28]. La cyclisation de la chalcones s’effectue aisément, par isomérisation sous forme de flavonone qui est stabilisée par formation d’une liaison hydrogène entre CO et un groupement OH en position 5. Les flavonoïdes et plus particulièrement leur produit d’hydroxylation, les flavonoïdes (ou dihydrovonols), joueraient le rôle d’intermédiaire dans la formation des différents types de flavonoïdes [29].
24 C CH HC O HO OH OH C CH C O O HO OH OH Chalcone Flavone Isomérisation -2H C CH2 CH O O HO OH OH C C C O O HO OH OH OH Flavonone -2H Flavonal Hydroxylation C CH CH O O HO OH OH OH CH CH CH O OH HO OH OH OH
Dihydroflavonal (flavononol) Flavonediol-3,4 Enolisation CH O OH OH CH O OH OH C H C C O HO OH OH OH + + H2O
Figure [I.7] : Formation des différents types de flavonoïdes à partir des chalcones [28].
Les réactions de la figure (I.7) restant en grande partie hypothétiques ; cependant elles ont été, dans la majorité des cas, réalisées au laboratoire. Plusieurs faits sont en faveur de ce schéma :
25
a) Une enzyme susceptible d’isoméries les chalcones en flavonone a été isolée dans les germinations de soja par Wong et Moustapha [30]
b) L'hydroxylation des flavononols en flavonols, a été obtenue par Mahesh et Seeshadri [31]
c) La réduction des flavononols en flavonols ne présente pas de difficulté ; en effet, les carbones 2 et 3 possèdent une configuration trans et par conséquent la déshydrogénation. d) Pachéco et Grouiller [32] ont réalise la synthèse chimique de différent hétérosides des flavonols à partir des chalcones correspondants ; d’autre part, Wong et al [33]. Ont montré que des germinations de pois chiches transforment un flavononol en flavonol. e) Pachéco [34] a synthétisé des anthocyanidines à partir des flavononols ; pour interpréter
la réaction, cet auteur envisage le passage par les flavanediols-3,4.
I.4.2 Intérêt des flavonoïdes
Les flavonoïdes sont l'un des plus grands groupes de métabolites secondaires qui jouent un rôle important dans les plantes. Ils interviennent comme des composés de défense ainsi que dans la signalisation de la reproduction, de la pathogenèse et de la symbiose [35, 36]. Les flavonoïdes végétaux sont impliqués dans le mécanisme d'intervention contre l'infection par des micro-organismes [37] ou l’attaque par les herbivores [38]. Les flavonoïdes sont également impliqués dans la production de nodosités des racines comme un système de fixation de l'azote après l'infection par la bactérie Rhizobium dans une variété de plantes légumineuses [39]. Ils sont des sources de pigments pour la coloration des composés de fleurs [40] et jouent un rôle important dans les interactions avec les insectes [41]. Vu l’intérêt pharmacologique des flavonoïdes, de nombreux travaux semblent indiquer qu’ils possèdent des propriétés anti-oxydantes [42, 43], anti-inflammatoires [44, 45], anti-VIH [46, 47], antitumorals spécialement lorsqu’ils sont utilisés conjointement avec d’autres agents chimiothérapeutiques [48, 49], antiviraux [50], antibactériens [51], antiallergiques [52].
26
I.4.3 Analyse structurale des flavonoïdes
Les méthodes d’analyse structurale comprennent des méthodes chimiques et physico-chimiques. Les techniques les plus couramment utilisées sont :
I.4.3.1 Spectroscopie UV-Visible
La spectrophotométrie UV-Visible est basée sur le principe suivant : en milieu alcoolique, chaque famille de flavonoïdes a un spectre d’absorption caractéristique, susceptible d’être modifié par l’addition des réactifs. D’après Jurd et al. [53] et Voirin et
al. [54], la nature du réactif et l’effet qu’il produit sur le spectre d’absorption apportent
des indications sur la structure des flavonoïdes. Les étapes d’enregistrement des spectres en présence de réactifs sont effectuées selon les étapes suivantes :
Première étape : On enregistre le spectre d’absorption dans le méthanol neutre puis immédiatement après l’ajout d’une goutte de NaOH (0,5 N), ensuite on enregistre après 5 minutes.
Deuxième étape : On enregistre une première fois le spectre d’absorption dans le méthanol, puis à cette solution on additionne AlCl3 (1%) et on enregistre le spectre
d’absorption. Après cette opération on rajoute quelques gouttes d’acide chlorhydrique (6N) puis on enregistre le spectre de cette nouvelle solution.
Troisième étape : On enregistre dans la solution méthanolique puis on ajoute NaOAc (sec) et on enregistre le spectre, après cette opération on rajoute à cette solution quelques gouttes de solution saturée d’acide borique puis on enregistre le spectre d’absorption.
Types de bandes dans les flavonoïdes
On distingue deux types de bandes :
La bande I correspond à l'absorption du système cinnamoyle en faisant intervenir la conjugaison du groupement carbonyle C4 avec le noyau B [55].
La bande II correspond à l’absorption du système benzoyle en faisant intervenir la conjugaison du groupement carbonyle avec le noyau A [56-57].
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Le déplacement exact et l’intensité des deux bandes I et II du spectre effectué dans le méthanol illustrent la nature de la structure du flavonoïde ainsi que sa substitution, conformément au tableau I. 7.
Tableau [I.7] : Interprétation des déplacements des maximums des bandes I et II après addition des réactifs [58].
Réactifs Déplacement (nm) Bande I Bande II Interprétation MeOH 310-350 250-280 330-360 250-280 350-385 250-280 Flavone Flavonol (3-OR) Flavonol (3-OH) NaOH
+45 à +60 sans diminution d’intensité optique +45 à +60 avec diminution d’intensité optique Apparition d’une nouvelle bande entre 320-335 nm 4'-OH 3-OH, 4'-OR 7-OH NaOAc +5 à +20 de la bande II
Déplacement faible de la bande II
7-OH
7-OH avec substituant en C-6 ou C-8
NaOAc
+ H3BO3
+12 à +36 de la bande I
Faible déplacement bathochromique de la bande I
3', 4' –diOH
Orthodihydroxylé sur le noyau A
AlCl3
+30 à +36 de la bande I par rapport au spectre AlCl3+HCl
+20 à 40 de la bande I par rapport au spectre AlCl3+ HCl
Orthodihydroxylé sur le noyau B 6, 7 ou 7, 8 di - OH +
Orthodihydroxylé sur le noyau B
AlCl3 + HCl +35 à +55 de la bande I +17 à +20 de la bande I +50 à +60 de la bande I 5-OH
5-OH (avec 6-oxygénation) 3-OH ou 3-OH et 5-OH
28
I.4.3.2 Résonance Magnétique Nucléaire (R. M. N)
I.4.3.2.a R. M. N. du proton
Concernant l’analyse des flavonoïdes, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire de proton (RMN 1H) permet de visualiser les relations existant entre les protons des différents noyaux et déduire leur degré de substitution.
Elle permet également de repérer les groupements méthoxylés, de dénombrer les sucres et d’envisager leur mode de liaison à la génine.
a. Analyse des signaux provenant des protons de la génine.
Les positions relatives des protons sur les noyaux A et B sont facilement déductibles grâce aux valeurs des constantes de couplage.
Protons du noyau A
Lorsque le noyau A est disubstitué par des OH en 5 et 7, les protons H-6 et H-8 présentent deux doublet, respectivement, entre 6.16 et 6.25 ppm avec une constante de couplage J = 2,5 Hz et entre 6.39 et 6.56 ppm avec la même constante de couplage. La substitution des OH en positions 5 et/ou 7 conduit au déblindage des deux protons voisins [59].
Protons du noyau B
Le déplacement chimique des protons du noyau B se trouve entre 6,7-7,9 ppm. Ce déplacement chimique est basé sur les substituants dans le noyau B et le degré d’oxydation du noyau C.
Quand le noyau B est monosubstitué en 4', les quatre protons H-2', H-3', H-5' et H-6' présentent deux doublets dont les constantes de couplages sont identiques (8.5 Hz). Les protons H-2' et H-6' résonnent toujours à des champs inférieurs à ceux des protons H-3' et H-5'.
Protons du cycle C
Le proton H-3 d’une structure flavone résonne entre 6 et 7 ppm sous forme d’un singulet [59], pouvant être confondu avec les protons H-6 et H-8.
29
I.4.3.2.b. Analyse des signaux provenant des protons de la partie osidique. Proton anomérique
Le proton anomérique apparaît sur le spectre sous forme d’un doublet déblindé par rapport aux autres protons osidiques. La valeur de la constante de couplage permet de distinguer les anomères β (J = 7-8 Hz) des anomères α ((J = 3-4 Hz) [60].
Le proton anomèrique lié à un autre ose, devient relativement loin de l’influence du noyau flavonique, et résonne à champ plus fort que le proton anomérique lié à la génine. A titre d’exemple dans le cas de Kampférol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1 6)-β-D-glucopyranoside le proton H-1"' du rhamnose résonne à 4,54 ppm dans le méthanol deutérié [61] alors que dans le cas du Kampférol-3-O-rhamnoside le proton anomérique H-1" résonne à 5,43 ppm avec une constante de couplage J = 2.1 Hz [62].
I.5 Coumarine
Les coumarines sont des substances naturelles connues, Il s’agit de composés à neuf atomes de carbone possédant le noyau benzo (2 H)-1 pyrannone-2. Ce composé dériverait de la cyclisation de l’acide cis cinnamique oxygéné en C-2 [63]. Les coumarines tirent son nom de kumarú, nom vernaculaire de la fève tonka Coumarouna
odorata encore appelée Disteryx odorata Willd. Elles sont très largement distribuées
dans le règne végétal. La coumarine et ses dérivés dont plus de 300 structures sont connues, se répartissent dans 9 familles de Monocotylédones et plus 70 familles Dicotylédones. Ils participent dans les racines des plantes symbiotiques hébergeant Rhizobium, à la formation des nodules. Elles sont responsables de l’odeur caractéristique de l’aspérule odorante et du mélilot desséché.
I.5.1 Classification
Les coumarines sont substituées par un hydroxyle ou plus sur les six positions
disponibles. La majorité des coumarines sont substituées en C-7 par un hydroxyle.
Les auteurs [64 - 65] ont classé les coumarines selon la nature des substituants sur leurs
30
I.5.1.1 Coumarines simples
Les coumarines les plus répandues dans le règne végétal possèdent des substitutions (OH ou OCH3) en 6 et 7.
O O R1 R2 R3 2 3 4 1 5 6 7 8 8a 4a
Figure [I.8] : Squelette de coumarine.
Les génines :
Les hétérosides :
I.5.1.2 Furanocoumarines :
Les furocoumarines (appelées encore furanocoumarines) constituent une famille de composés synthétisés par certaines espèces de végétaux supérieurs Elles dérivent principalement de l’Ombelliférone par condensation isopronoides en C5, et souvent liposolubles [67]. Le cycle furane peut être fusionné au cycle
R1 R2 R3 Ombelliférone H OH H Esculétol OH OH H Scopolétol OCH3 OH H Herniarine H OCH3 H Fraxétol OCH3 OH OH R1 R2 R3
Esculoside (=Esculine) O-Glu OH H
Cichorioside(=Cichorine) OH O-Glu H
Scopoloside(=Scopoline) OCH3 O-Glu H
31
benzénique dans deux positions linéaire (dérivant de la molécule de psoralène), angulaire basées sur la structure de l’angélicine. De nombreux dérivés de ces structures de base existent avec des ajouts de résidus sur les carbones des positions 2, 5 et/ou 8 [68]. Ces résidus peuvent être assez simples, comme dans les cas des hydroxypsoralènes et desméthoxypsoralènes, ou bien plus complexes comme par exemple pour l’athamantine ou lacolumbianadine. La plupart des furocoumarines ont cependant des dénominations reprenant le nom des plantes dans lesquelles elles ont été décrites pour la première fois (le bergaptène présent dans Citrus bergamia, la rutarétine ou la rutarine dans Ruta graveolens), ou bien encore liées à leurs propriétés (la xanthotoxine pour sa couleur et son activité biologique). On désigne dans certains cas l’isomère linéaire ou angulaire d’une molécule par le préfixe iso- comme par exemple dans le cas de l’isopimpinelline.
O O O 52 Psoralène 53 Angélicine O O O O O Me Me Me Me O O O O-isovaléryl Me Me O-isovaléryl 54 Columbianadine 55 Athamantine
Figure [I.9] : Structures de quelques furanocoumarines.
I.5.1.3 Pyranocoumarines : composés formés par la fusion d'un hétérocycle pyrane avec la coumarine
O O O
32
1- soit dans le prolongement (forme linéaire) : xanthylétine 2- soit latéralement (forme angulaire) : séseline, visnadine
O O
56 Xanthylétine 57 Séseline
I.5.1.4 Dicoumarines (coumarines dimériques)
Ce sont des composés formés par la liaison deux unités coumarininques simples O H HO H3CO O O O O O H HO HO O O O O 58 Daphnorétine 59 Edgeworthine
I.5.1.5 Tricoumarines (coumarines trimériques)
Ce sont des composés issus de l’union de trois entités coumariques.
O O O O HO OH 60 Triumbéllatine O O
33
I.5.2 Biosynthèse des coumarines
Les coumarines constituent avec les flavonoïdes, les chromones et les isocoumarines, un très vaste groupe de composés. L’élément structural qui les caractérisent la présence d’un noyau benzopyrane [69]. Les structures simples des coumarines dérivées de l’acide cinnamique via l’acide aminé phénylalanine, par exemple la coumarine et l’umbelliférone, sont trouvées dans plusieurs plantes [70]. L’hydroxylation en ortho de l’acide trans-cinnamique est la voie directe qui conduit aux coumarines simples. D’autres coumarines qui ont subi un changement dans leurs structures de base, se rencontrent dans peu de familles. En effet, la participation du précurseur est possible pour donner des dérivés mixtes de l’acide chikimique et
mévalonique que sont les furano et pyranocoumarines [71, 72].
La première réaction est la condensation du phosphoénol pyruvate (PEP) avec l’érythrose-4-phosphate pour former un composé de sept carbones : le désoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) [71]. La cyclisation du DAHP en 3-déhydroquinate met en jeu une condensation aldolique intramoléculaire intervenant après l’élimination du phosphate [73].
+ PO CH2 COO COO -OH OH PO O O COO -OH OH O HO
PEP Erythrose-4-phosphate DAHP
3-déhydroquinate COO -OH OH O hydroshikimate é d -3 61
Une réduction du carbonyle du 3-déhydroshikimate se déroule pour donner le shikimate. Cette réduction se fait par l’intermédiaire du NADPH et de la shikimate oxydoréductase. Le shikimate résultant est ensuite phosphorylé par l’ATP, lui cédant un groupe phosphate pour former le shikimate 3-phosphate. Ce dernier, en présence d’une
O
OH HO
34
enzyme condensante, fixe une nouvelle molécule de PEP pour donner un ester d’énol, le 5-enolpyruvyl-shikimate3-phosphate (EPSP). Ce dernier conduit au chorismate, via une
trans élimination. COO -OH OH O COO -OH OH HO COO -OH OH PO COO -O OH O COO COO -O OH PO CH2 COO Chorismate
Le réarrangement précyclique du chorismate donne le préphénate. Ce réarrangement est catalysé par une enzyme (chorismate mutase) capable de transférer la chaîne latérale dérivée du PEP pour qu’elle soit directement liée sur le cycle.
COO -O OH O COO OH -O -O C O COO OH O COO Chorismate Préphénate
La transamination de l’acide phénylpyruvique conduit à la formation de la phénylalanine OH CH2 CO COOH NH 3 OH CH 2 COOH
35
Par contre, la thyrosine se forme de l’acide préphénique
CH2-CO-COOH HO O OH NAD + NADPH, H+ O CH2-CO-COOH HO O OH COOH NH 2 OH CH 2-CO-COOH
Figure [I.10] : Biosynthèse des coumarines.
Une désamination de la phénylalanine et de la tyrosine conduit respectivement à
l’acide trans cinnamique et l’acide coumarique.
COOH
COOH
OH
62 Ac. cinnamique 63 ac. para-coumarique
La formation de la phénylalanine à partir de l’acide chorismique implique un réarrangement de Claisen catalysé par l’enzyme, cet acide aminé est transformé en intermédiaire phénylpropanoique (acide coumarinique) qui donne la coumarine après une isomérisation et lactonisation.
36 COOH COOH OH
Ac. Cinnamique ac. ortho-coumarique
O O O-Glucoside
COOH
COOH O-Glucoside
Coumarine ac-β-D-glucoside O-Coumarine
La structure de coumarine est dérivée de l'acide cinnamique par l'intermédiaire de l'ortho-hydroxylation (a), de l'isomérisation trans-cis de la chaîne latérale (b) et (c), et de la lactonisation (d). La forme trans est stable et ne pourrait pas cycliser, donc, il devrait y avoir d'isomérisation d'une certaine sorte et l'isomérase d'enzymes est impliquée.
I.5.3 Intérêt des coumarines
Les coumarines ont des propriétés antipyrétique, analgésique, sédative, anti-oedémateuses et anti convulsivante. Ils sont probablement responsables de l’effet anticonvulsivante [74]. Les coumarines ont indiquées dans les cas de lymphoedème du membre supérieur après traitement radiochirurgical du cancer du sein. Concernant les dérivés coumariniques, certains d’entre-eux possèdent des activités pharmacologiques, principalement anticoagulantes. Les plus connus sont le dicoumarol et l’esculoside, tout deux veinotoniques et vasculoprotecteurs (Hostettmann, 1997) [75].
hν ∆ d C b a
37
I.6 Les huiles essentielles
Les huiles essentielles sont des produits obtenus soit à partir des matières premières naturelles par distillation à l’eau, soit à partir des fruits de citrus par des procédés mécaniques et qui sont séparés de la phase aqueuse par des procédés
physiques[76]. Dans la plante, les huiles essentielles peuvent être stockées dans divers organes : fleurs
(origan), feuilles (citronnelle, eucalyptus), écorces (cannelier), bois (bois de rose, santal), racines (vétiver), rhizomes (acore), fruits (badiane) ou graines (carvi) [77]. La synthèse et l’accumulation des huiles essentielles, classées parmi les métabolites secondaires, se font généralement au niveau des structures histologiques spécialisées, souvent localisées sur la surface de la plante [78].
Parmi les composants majoritaires des huiles essentielles, nous trouvons les terpénoïdes qui possèdent un rôle écologique lors des interactions végétales, comme agents allélopathiques, c’est-à-dire inhibiteur de la germination, mais aussi lors des interactions végétal-animal, comme agent de protection contre les prédateurs tels que les insectes. Ils interviennent également, par leurs odeurs caractéristiques, dans l’attraction de pollinisateurs [79].
Une variété de produits à odeur plus ou moins formulée selon la concentration en composés et en composés volatils récoltés, est alors obtenue. Les huiles essentielles produites par hydrodistillation, entraînement à la vapeur ou expression de l’écorce des fruits, sont les produits les plus concentrés en composés olfactifs [80].
Chacun de ces composés de part leur volatilité dégage une odeur propre. Ainsi certaines plantes peuvent avoir une odeur similaire due à une molécule commune présente en quantité notable dans l’huile essentielle. Dans ces conditions, une fois le ou les composés responsables d’une odeur identifié, si le caractère olfactif de ces composés s’avère intéressant, il serait alors rentable, selon le contexte économique, de produire
des espèces végétales susceptibles de fournir une huile essentielle à haute teneur
moléculaire en composés recherchés, et donc généralement de meilleure qualité [79].
I.6.1 Procède classique d’extraction des huiles essentielles
La distillation est un procédé de séparation basé sur la différence de composition entre un liquide et la vapeur engendrée. La technique implique la condensation de la vapeur et la récupération des fractions liquides résultantes. On parle de distillation
38
simple ou fractionnée lorsqu’il s’agit de liquides miscibles. On peut également procéder à la distillation de liquides non miscibles. C’est le cas de l’hydrodistillation des huiles essentielles [81].
I.6.2 Production des huiles essentielle : l’hydrodistillation
L’entraînement à la vapeur d’eau est l’une des méthodes officielles pour l’obtention des huiles essentielles. A la différence de l’hydrodistillation, cette technique ne met pas en contact direct l’eau et la matière végétale à traiter. De la vapeur d’eau fournie par une chaudière traverse la matière végétale située au dessus d’une grille. Durant le passage de la vapeur à travers le matériel, les cellules éclatent et libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous l’action de la chaleur pour former un mélange « eau + huile essentielle ».
Le mélange est ensuite véhiculé vers le condenseur et l’essencier avant d’être séparé en une phase aqueuse et une phase organique : l’huile essentielle. L’absence de contact direct entre l’eau et la matière végétale, puis entre l’eau et les molécules aromatiques évite certains phénomènes d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de l’huile. L’hydrodiffusion est une variante de l’entraînement à la vapeur (figure I.11).
Figure [I.11] : Appareillage utilisé pendant l’hydrodistillation d’huile essentielle [82].
Le montage de type Schilcher [82] (figure I.11) est composé de quatre parties
principales:
1. le réacteur, un ballon dans lequel on introduit la matière végétale et l’eau.
2. la colonne, un cylindre en verre placé au-dessus du réacteur qui recueille la phase vapeur.
39
3. le réfrigérant dans lequel se recondensent les vapeurs.
4. le vase florentin où vont se séparer la phase organique (huile essentielle) et la phase aqueuse (eau florale).
Ce système peut être équipé d’un recyclage ou cohobage : un principe de siphon renvoie l’eau florale du vase florentin vers le réacteur. Un simple robinet au bas du vase permet de recueillir l’huile essentielle à la fin de la réaction.
Le milieu réactionnel constitué par la matière végétale et l’eau est porté à ébullition
grâce à un chauffe-ballon.
La température est limitée par la température d’ébullition de l’eau 100°C. La composition chimique des huiles essentielles dépend largement de l’influence des
conditions d’hydrodistillation sur l’essence contenue dans la plante.
I.6.4 Principales structures chimiques des huiles essentielles [83]
Les huiles essentielles sont constituées principalement de deux groupes de composés odorants distincts selon la voie métabolique empruntée ou utilisée. Il s’agit des terpènes, prépondérants dans la plupart des essences, et des dérivés du phénylpropane, retrouvé en tant que composé majoritaire dans quelques unes, telles que les essences d’anis, de cannelle, de girofle, etc… Divers autres constituants minoritaires leurs sont associés. De nombreux dérivés porteurs de fonctions diverses sont également considérés comme des composés terpéniques.
Les composés terpéniquessont issus d’une voie métabolique secondaire de l’acide
mévalonique. Suivant le nombre entier d'unités pentacarbonés (C5) ramifiées, dérivées
du 2-méthylbutadiène (isoprène), nous pouvons réaliser la classification suivante :
C2H C2H
C3H
Figure [I.12] : L’isoprène.
Pour n = 2: les monoterpènes. Ces terpènes proprement dits sont des
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terpènes se rattachent un certain nombre de produits naturels à fonctions chimiques spéciales, surtout alcool et aldéhyde.
COOH CH 2OH
64 acide transgéranique 65 citronellol 66 β- phellandrène
Figure [I.13] : Exemple des composants monoterpéniques.
Pour n = 3: les sesquiterpènes. Ce sont des hydrocarbures de formule C15, soit
une fois et demie (sesqui-) la molécule des terpènes (en C10H16). Un groupe particulier
de sesquiterpènes est représenté par les azulènes, composés instables dont le nom vient de leur coloration bleue et qui sont importants en pharmacognosie en raison de leurs propriétés anti-inflammatoires. Ces composés, non saturés, sont constitués par deux cycles penta et hepta carbonés. Nous retrouvons dans ce groupe le chamazulène (des essences de camomille et de matricaire).
67 Cadinene 68 Eudesmol
Figure [I.14] : Exemple des composants sesquiterpéniques
Pour n = 4: les diterpènes qui sont des dérivés d’hydrocarbures en C20. Ces
composés, à point d'ébullition élevé, se rencontrent surtout dans les résines.
69 Acide abiétique
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Pour n = 5: les sesterpènes. Ce sont des dérivés d’hydrocarbures en C25.
Pour n = 6: les triterpènes. Ces composés en C30 sont très répandus, notamment
dans les résines, à l'état libre, estérifiés, ou sous forme hétérosidique.
70 Squaléne
Figure [I.16] : Exemple des composants triterpéniques.
Pour n = 8 et les polyterpènes le caoutchouc naturel est l’exemple plus nomme. Le caoutchouc naturel est un polymère de l'isoprène. Il est produit par la coagulation par la chaleur de la sève de l'hévéa.
71 Caoutchouc naturel.
Figure [I.17] : Exemple des composants polyterpènes.
Dans une huile essentielle, nous retrouvons presque exclusivement des mono- et sesquiterpènes.
Les dérivés du phénylpropane sont moins abondants que les terpénoïdes, ce sont
des arènes issues d’une voie métabolique secondaire dite de l’acide shikimique lui-même intermédiaire de la synthèse de la lignine à partir du phénylpropane.
Les composés sont néanmoins importants sur le plan qualitatif et quantitatif chez certaines espèces. Par exemple, le trans-anéthole qui est la molécule responsable en grande partie de l’arôme d’anis, constitue environ 80% de l’huile essentielle de fenouil (1-3% d’essence), et d’anis vrai (3% d’essence). Les dérivés phénylpropanoïques et les terpénoïdes sont associés en nombre et en proportions très variables de telle sorte que le
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produit est hétérogène et complexe sur le plan chimique. Ils sont biosynthétisés au sein des mêmes organes sécréteurs où ils forment l’essence naturelle [84].
I.6.5 Analyse chromatographique et identification des constituants dans un mélange
La séparation des composés s’effectue en général par CPG notamment pour les composes volatils (mono-et sesquiterpènes) et par HPLC pour les composés pas ou peu volatiles. Les colonnes utilisées sont souvent apolaires exemple HP-5 et DB-5 du fait des caractéristiques apolaires de la majorité des composés mono-et sesquiterpènes [85]. La méthode couramment utilisée pour l’identification des huiles essentielles est le couplage CPG/SM. Il permet de connaître, dans la grande majorité des cas, la masse moléculaire d’un composé et d’obtenir des informations structurales relatives à une
molécule à partir de sa fragmentation (86, 87). En parallèle, une expression
mathématique générale qui donne une meilleure approximation des indices de Kovts,
recommandée par la firme "Chromatographic Society" est la suivante (Evans et al, 1989)
[88].Les indices de Kovats sont les temps de rétention relatifs des substances analysées
par rapport à celles des alcanes. La formule ci-dessous décrit le calcul des indices de Kovats à partir des temps de rétentions des composés cibles et ceux des alcanes :
+ − − = + Z t t t t I Rz z R Rz Ri ) 1 ( 100
Où I : indice de Kovats d'une substance A
z = nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui sort avant le composé inconnu
t R = temps de rétention,
i = molécule inconnue, z = nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui sort avant le composé inconnu (z +1) = nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui a été élué après le composé
