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Avian Pathology

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Comparaison de trois techniques de numeration des spores d'aspergillus fumiga tus en eclosoir, dans le cadre de la surveillance epidemiologique au couvoir des risques d'aspergillose

F.X. Le Gros , Marguerite Le Menec , M. Mollard , G. Portejoie , F. Salingardes

& G. Bennejean

To cite this article: F.X. Le Gros , Marguerite Le Menec , M. Mollard , G. Portejoie , F. Salingardes

& G. Bennejean (1985) Comparaison de trois techniques de numeration des spores d'aspergillus fumiga�tus en eclosoir, dans le cadre de la surveillance epidemiologique au couvoir des risques d'aspergillose, Avian Pathology, 14:3, 329-340, DOI: 10.1080/03079458508436235

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Published online: 02 Jan 2008.

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Avian Pathology, 14: 329-340, 1985

COMPARAISON DE TROIS TECHNIQUES DE NUMERATION DES SPORES D'ASPERGILLUS FUMIGA TUS EN ECLOSOIR, DANS

LE CADRE DE LA SURVEILLANCE EPIDEMIOLOGIQUE AU COUVOIR DES RISQUES D'ASPERGILLOSE

F.X. LE GROS¹, Marguerite LE MENEC², M. MOLLARD³, G. PORTEJOIE4, F. SALINGARDES5, G. BENNEJEAN1 1 Laboratoire National de Pathologie Aviaire, 22440 Ploufragan, France

2Laboratoire Départemental d'Analyse des Côtes-durNord (Directeur M. Lagadic) 22021 Saint-Brieuc, France

3Direction Départementale des Services Vétérinaires des Côtes-du-Nord, 22021 Saint-Brieuc, France

4Direction Départementale des Services Vétérinaires du Finistère, 29107 Quimper, France

5Laboratoire Départemental des Services Vétérinaires du Finistère, 29107 Quimper, France

RESUME

Des numérations de spores d' Aspergillus fumigatus sur duvet de pous- sins, écouvillons de paroi d'éclosoir et poumons de poussins sont comparées dans leurs conditions pratiques de mise en oeuvre dans le cadre d'un controle officiel des établissements d'accouvaison. Leurs corrélations et les conespondances entre les résultats qu'elles donnent sont étudiées. Leur manque de précission est souligné, particulière- ment pour la technique sur écouvillon. Ceci oblige à évaluer le risque aspergillaire par la moyenne des numérations obtenues simultanément dans une dizaine d'éclosoirs.

INTRODUCTION

Comme le montrent les analyses de contrôles systématiques effectuées en laboratoire de diagnostic, ainsi que les résultats d'une enquête épidémiologique récente (Le Turdu et coll., 1984), il existe en Bretagne un portage â'Aspergillus fumigatus par environ 60% des poussins nouvellement éclos commercialisés, ceci pouvant s'expliquer par le caractère ubiquitaire de ce champignon, contaminant habituel de l'air et des locaux d'élevage (Pinello et coll., 1977).

Received 13 August 1984 Accepted 22 February 1985

(3)

330 FJC. Le Gros et al

Pour autant les cas d'aspergillose au démarrage des poussins restent rares (Le Turdu et coll., 1984). On est donc conduit à définir un seuil théorique en deçà duquel le portage d'A. fumigatus est sans conséquence et au delà duquel le risque existe, largement modulé par la technicité des éleveurs, de voir éclore une aspergillose clinique dans les premiers jours de vie des poussins (O'Meara et Chute, 1959) étant donné la dissémination hématogène très rapide des spores (Richard et Thurston, 1983).

Les techniques traditionnellement mises en oeuvre pour évaluer ce risque en laboratoire de diagnostic des maladies aviaires, ne semblent pas donner entière satisfaction (numération de spores sur duvet, évaluation du portage sur poumon): on reproche à la technique sur duvet de manquer de précision, du fait d'une variation impor- tante des quantités de duvet prélevées pour un même poids, en fonction de son degré d'humidification. D'autre part, le caractère non mouillable des spores d' A. fumigatus entraine lors des étapes de dilution une dispersion hétérogène de celles-ci, paliée en partie par la présence de tween dans les diluants (Pinello et coll., 1977). D en résulte parfois des résultats difficilement interprétables du type 15 thalles à la dilution au lOOème, 4 au lOOOème et 1 au lOOOOème.

Ce défaut est supprimé avec la technique sur poumon puisqu'un fragment de celui-ci est déposé directement sur les milieux de culture sans étape préalable de dilution. Le défaut majeur est ici la faiblesse de l'échantillon prélevé puisque 10 poussins représentent un maximum pratique. Notons que cette source d'erreur est minimisée sur les duvets qui brassés en permanence par la ventilation de 1' éclosoir connaissent vraisemblablement un portage homogène en Aspergillus.

A partir de ces constatations, une technique d'écouvillonnage de paroi ayant déjà fait ses preuves en recherche de salmonelles (Lahellec et Colin, 1977) a été transposée dans le but de diminuer les incertitudes liées à l'humidification des duvets; la technique sur poumon a été modifiée en multipliant le nombre de fragments de poumon testés par poussin (Hamet, 1983) afin d'augmenter la pression de sondage.

Le but de ce travail est de confronter ces deux techniques dans leurs conditions pratiques de mise en oeuvre, à la numération classique sur duvet, afin d'établir des points de comparaison entre les résultats qu'elles donnent et de discuter de leur efficience dans le cadre d'un plan de surveillance épidémiologique officiel.

MATERIEL ET METHODE

Les prélèvements (poussins, duvets, écouvillons) sont réalisés dans le cadre d'un contrôle officiel des cheptels reproducteurs et établissements d'accouvaison conduit par les Services Vétérinaires du Ministère de l'Agriculture (Anonyme, 1982).

Couvoirs

12 couvoirs de structure économique variée répartis presque essentiellement sur le département des Côtes-du-Nord ont été pris en compte. Parmi ceux-ci, on en compte 3 spécialisés dans l'accouvage dinde, 1 en pintade et 8 en poule. La but de cette étude n'étant pas de comparer les niveaux de contamination de ces différents types de couvoir (l'échantillonnage serait insuffisant) mais les techniques de numéra- tion, les comptages sont par la suite traités sans distinction d'espèce.

Prélèvements

Pour un éclosoir, au moment de son ouverture, on prélève, un échantillon de duvet

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Numeration des spores A'Aspergillus fumigatus 331 aussi sec que possible (0,5 g), 10 poussins, et on écouvillonne une des parois sur une surface approximative de 1 m . Les 3 prélèvements ont été effectués simul- tanément le plus souvent possible (54 cas). A défaut 2 seulement ont été conduits (45 cas). Enfin, et pour chaque méthode, une quinzaine de prélèvements ont été réalisés en double afin d'effectuer des calculs d'erreur.

Numération sur duvet,-

Le duvet prélevé est dilué au lOOème dans du tryptone sel tweené à 10'⁴ g/1.

Deux dilutions supplémentaires de raison 10 sont conduites. 1 ml de chaque dilution est coulé en boîte de pétri avec une gélose au malt en surfusion additionnée de chloramphénicol à 0,5%o. Après 72 heures d'incubation, la boîte retenue pour rendre le résultat est celle correspondant au nombre maximum lisible de thalles.

Numération sur ècouvïllon

Les écouvillonnages sont réalisés en utilisant des carrés de cellulose non tissée, conditionnés et stérilisés en bocaux contenant 100 ml d'eau peptonée tweenée à 10*4 g/1. Le linge prélevé à l'aide de gants stériles est réintroduit dans le flacon après écouvillonnage de la surface à examiner (Lahellec, 1977) 1 ml du diluant est traité ensuite somme la solution au lOOème dans la numération sur duvet.

Numération sur poumon de poussin (Hamet, 1983)

Une gélose Sabouraud additionnée de chloramphénicol (0,5%o) est divisée radiale- ment en 10 secteurs. Sur chacun de ces secteurs 4 fragments de poumons prélevés dans les lobes costaux puis diaphragmatiques droit et gauche de chacun des poussins d'un lot de 10, sont déposés. Après 48 heures d'incubation à 37°C le résultat est exprimé en nombre de poussin ayant respectivement 0, 1, 2, 3 ou 4 fragments de poumon porteurs de spores.

RESULTATS Comparaison des trois méthodes

Toutes les mesures effectuées sont corrélées significativement (a<0,01) et de manière positive. La table 3 donne une correspondance entre les trois techniques pour quelques valeurs importantes.

Duvet (D) ècouvillon (Ej. Sur les 54 couples de mesure correspondant, la droite de régression calculée est log E = 0,59 log D + 0,7. Le coefficient de corrélation r est de 0,66. La répartition des mesures est présentée en figure de texte 1. On constate que par rapport à la technique sur duvet, celle sur ècouvillon écrase la distribution des résultats et perd ainsi en sensibilité.

Duvet, poumons. Sur les 49 couples de mesure correspondant 4 droites de régres- sion ont été calculées suivant que le résultat dû comptage est exprimé en nombre de poussin ayant au moins 1, 2, 3 fragments porteurs (PI, P2, P3) ou en nombre moyen de fragments porteurs par poussin (Pm). Leurs équations sont données en table 1. Les trois premières droites sont regroupées sur la figure de texte 2 de manière à ce qu'une verticale donne une estimation de la «grille» théorique de portage à un niveau donné de contamination des duvets. Les points reportés sont ceux correspondant à la corrélation D-Pl.

Il existe déjà un portage pour les bas niveaux de contamination, ce qui est en accord avec les constations de l'enquête citée précédemment (Le Turdu et coll., 1984). Celui-ci augmente ensuite tant en nombre de poussins porteurs qu'en nombre de fragments porteurs par poussins, avec la quantité de spores à'Aspergillus retrouvée

(5)

332 FJC. Le Gros et al.

sur les duvets. On se reportera à la table 3 pour quelques exemples chiffrés.

SE SOO O M

5 200 .

° 100 J,

te''

500 1000 2000 S000 10 000 100 000

CONTAMINATION DES DUVETS ( s p o r M / g . )

Figure de texte 1: Evolution de la contamination des ecouvillons en fonction de celle des duvets •

Table 1. Corrélation et régression de la technique sur poumon en fonction de celle sur duvet

Indicateur

PI P2 P3 Pm

(1ère partie)

pm (2ème

partie)

Corrélation avec D

r = 0,65 0,76 0,80 0,52 0,80

Résultat basé sur n couples de mesures

n = 49 49 49 60

49

Equation de la droite de

Log PI = Log P2 = Log P3 = LogPm

LogPm

regression 2,37 log D - 2,93 log D - 2,87 log D -

= 0,25 log D -

= 1,05 logD - 3,46 7,38 8,15

•0,39 2,59

(6)

Numeration des spores d'Aspeigillus fumiga tus 333

£ 3

300 1Ó00 2Ó00 5000 10' 000 100 000 CONTAMINATION DES DUVETS ( s p o r e s / 9 . )

Figure de texte 2: Evolution du portage au niveau des poumons en fonction de la contamination des duvets

Remarquons également que PI et Pm peuvent résumer la grille de distribution du portage: Pm qui est fortement corrélé à P2 et P3 (r = 0,96) est en fait une synthèse de l'information contenue dans ces deux derniers chiffres.

La figure de texte 3 représente le nombre moyen de fragments porteurs par poussin en fonction de la contamination des duvets. Il s'agit d'une courbe bimodale dont la pente s'infléchit lors de l'apparition des positivités sur au moins 2 et 3 fragments, compte tenu du poids grand de ces comptages dans le calcul de la moyenne.

2000 5000 10 COO 100 000 CONTAMINATION DES KOVETS ( s p o r e s / 9 . )

Figure de texte 3: Evolution du nombre moyen de fragments de poumon porteurs par poussins en fonction de la contamination des duvets

(7)

334 FX. Le Gros et al.

Ecouvillon poumon. Des résultats similaires sont obtenus et présentés de même que précédemment en table 2 et figures de texte 4 et 5.

Table 2. Corrélation et regression de la technique sur poumon en fonction de celle sur ecouvillon

Indicateur

PI P2 P3

Pm (1ère

partie)

pm (2ème

partie)

Corrélation avec E

r = 0,85 0,90 0,86 0.70 0,91

Résultat basé sur n couples de mesures

n = 32 32 32 51

32

Equation de la droite de

Log PI LogP2 LogP3

L°gpm LogPm

régression

= 3,71 log E -

= 4,27 log E -

= 3,89 log E -

= 0,39 log E -

= 1,43 log E - 5,76 9,72 9,29 0,60 3,08

W D

52

10- 9 . S- 7- 6"

5.

4' 3 2.

/ / /

s*

iijiL.

L /y

200 500 1000 2000 5000 10 000

P1

/ P3

too coo CONTAMINATION DES ECOUVILLONS ( s p o r e s / m )

Figure de texte 4: Evolution du portage au niveau des poumons en fonction de la contamination des ecouvillons

(8)

Numeration des spores d'Aspergillus fumigatus 335

W O a eu

Pm

5000 10 000

CONTAMINATION DES EOOUVTLLONS ( s p o r e s / m )

1000 0 0 0

Figure de texte 5: Evolution du nombre moyen de fragments de poumon porteurs par poussins en fonction de la contamination des ècouvillons

Table 3. Correspondance entre les 3 méthodes pour quelques niveaux de contamination intéressants

Technique (unité) Duvet (spores/g) Ecouvillon (spores/m2) PI (poussins)

P2 (poussins) P3 (poussins)

Pm (fragment de poumon) Grille de portage

correspondante³

Correspondances entre résultats 100

<100 1 0 0 0,1 9,1000

200 100 2 0 0 0,2 8,2000

500 200 3 0 0 0,3 7,3000

1000 300 4 1 0 0,5 6,3100

2500 500 5 2 1 0,8 5,3110

5000 700 6 3 2 1,1 4,3120

a la partie entière du nombre représente l'effectif de poussins non porteurs. Chaque chiffre après la virgule donne respectivement l'effectif de la classe 1 fragment porteur, 2 fragments porteurs, etc..

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Calculs d'erreur

Rappelons qu'il s'agit d'erreurs calculées sur deux prélèvements originaires d'un même éclosoir et non de deux résultats donnés sur un même prélèvement. Ceci a l'intérêt d'inclure l'effet prise d'échantillon à l'erreur globale calculée.

Numération sur ècouvillons et duvets. L'effet dilution est pris en compte en calcu- lant la moyenne des différences du nombre de colonies relevées sur la boite retenue pour la lecture du résultat.

Pour la technique sur duvet elle est de ± 4 colonies (effectué sur 13 couples de mesure (n); écart type (s) -, 5,5). Pour les ècouvillons, de ± 2 colonies (n = 9, s = 2,5). La table 4 donne quelques exemples des incertitudes obtenues avec les deux méthodes compte tenu des correspondances entre-elles. On remarque que ramenée à une échelle comparable, la précision de la méthode sur écouvÛlon est en fait inférieure à celle sur duvet pourtant déjà médiocre (écart de presque 1 log).

Numération sur poumon. La différence moyenne entre moyenne de fragments atteint par poussin est de ± 0,39 (n = 13, s = 0,47). L'incertitude moyenne sur PI est ± 1 poussin ( l , 3 ; n = 13, s = 1,25), sur P2 de ± 2 poussins (1,6; n = 10, s =1,4).

Pour P3 elle est probablement similaire à P2 mais le nombre d'observations recueil- lies n'est que de 6 et n'en permet pas une estimation rationelle.

Ces fluctuations ramenées à «l'échelle duvet» (voir table 4) sont somme toutes comparables à celles observées sur écouvillon. Néanmoins, le fait de posséder deux indicateurs du résultat (PI ~t P^m) permet de réduire notablement cette imprécision en superposant les fenêtres d'incertitudes de chacun.

DISCUSSION

A partir de ces résultats, quels sont les avantages et inconvénients respectifs de ces trois méthodes ?

Duvet

En introduction nous avons déjà présenté les principales critiques soulevées à l'encontre de cette technique (irrégularité de la dilution des spores, variation de la quantité de duvet traité pour un même poids en fonction de son humidification).

Il s'y ajoute les risques de contamination du laboratoire d'analyse lors de la mani- pulation de ces matières éminemment dispersibles, une moins bonne aptitude relevée à l'isolement de salmonelles (Lahellec et Colin, 1977) par rapport aux poussins ou aux ècouvillons. Précisions en effet que dans le contrôle officiel précité ces prélèvements ont une double finalité: vis-à-vis des Aspergiiïus mais aussi des Salmonella. A l'encontre de ce résultat il faut noter que lors de nos observations chez un accouveur où une Salmonella senftenberg lactose plus est isolée régu- lièrement des duvets (9 cas) elle ne l'a jamais été simultanément des poussins.

Au chapitre des avantages de cette technique, soulignons la facilité de prélèvement, son coût modéré compte tenu du peu de manipulations qu'elle exige (43 F par duvet) également le fait qu'elle soit en comparaison des autres la moins imprécise.

Ecouvillons

Les critiques liées aux techniques par dilution sont encore applicables ici. Par ailleurs, au vu des résultats, on constate une perte de sensibilité par rapport à la technique sur duvet ce qui au mieux annule les gains de précision apportés par l'affranchissement de la variation due à l'humidification des duvets, puisqu'au

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Numeration des spores d'Aspergillus fumigatus 337

I

8

.oc

• * - »

a

•5 a

o

•8

H ö

5

I

K

5

•a3

ft.

S

M- .Sí

Intervalle ramené à l'échelle spores/g

Intervalle de confiance en nombre de fragments

Valeur de Pm correspondante (fragment de poumon)

Intervalle de confiance en nombre de poussins

Valeur de PI correspondante (poussins)

Intervalle de confiance en spore/m2

Valeur correspondante en spore/m2

(écouvillon)

Intervalle de confiance (a = 0,05)

Résultat sur duvet (spores/g)

oo

• *

óo

V

S

o"

oo

0-17

o

2-4

m

700100-1

V o oo o V

o

100-90

oo o o ó o

<3\

9 o"

0,5

o o

0-35

om

có

500200-2

oo

00-5

O

o

600-14

o

100

(11)

338 FJC. Le Grosera/.

total la précision empire. De plus, la lourdeur pratique de mise en oeuvre de cette technique (volume et poids des bocaux, rupture de stérilisation par défaut des joints ou fêlure du verre dans le transport, temps de prélèvement allongé) constitue un frein évident à sa généralisation.

Deux points positifs sont à relever: cette méthode supprime les manipulations de duvet et de ce fait est peu contaminante et économe en temps; elle a fait ses preuves dans l'isolement de salmonelles. Elle est également d'un coût modéré (43 F par écouvillon).

Poumons

Malgré la multiplication du nombre de fragments de poumon prélevés par poussin, la précision ici, si elle est comparable, n'est pas supérieure à celle observée sur duvet. Ceci est lié à la faible pression de sondage exercée lors de l'échantillonnage.

En effet, les oeufs n'éclosant pas tous au même moment en fonction par exemple du parquet d'origine, les poussins sont soumis à des durées plus ou moins longues d'exposition à l'atmosphère éventuellement contaminée de l'éclosoir et ne pré- sentent donc pas un portage homogène en spores â'Aspergillus. De plus, si cette technique évite les manipulations de duvet, sa mise en oeuvre reste assez lourde:

il fait compter environ une demi heure de travail minutieux pour traiter un lot de dix poussins. Elle est donc plus onéreuse que les autres (73 F par lot de 10 poussins). Néanmoins, elle reste intéressante car l'analyse porte ici sur le produit fini et est donc commercialement plus parlante qu'une estimation indirecte de la qualité du poussin.

CONCLUSION

Des trois techniques mises en balance aucune ne se détache franchement en qualité, la plus médiocre étant celle sur écouvillon. L'imprécision appréciable des deux autres rend impossible leur interprétation au vu d'une seule analyse et oblige à raisonner en terme de moyenne sur plusieurs d'entre-elles. Ceci est justifié par le fait que la variance de la distribution des mesures, effectuées au sein d'un même couvoir, est significativement inférieure (a < 0,05) à sa variance globale. Autrement dit, malgré leur isolement théorique en ventilation, il existe une tendance simul- tanée et de niveau comparable à la contamination des différents éclosoirs d'un même couvoir.

La précision de la moyenne alors calculée dépend elle même du nombre de relevés qui lui correspondent, mais aussi de leur dispersion dans le couvoir considéré.

Pour des raisons pratiques, le nombre d'éclosoirs pouvant être traités simultanément sera rarement supérieur à 10, ce qui est déjà un-chiffre appréciable puisqu'il donne une précision de ± 200 spores par gramme pour un couvoir dont 95% des mesures habituelles sont comprises entre moins de 100 et 1100 spores par gramme. (Loi des distributions Gaussiennes). On notera que cette précision est suffisante puisqu'il importe de discriminer les couvoirs autour d'une zone seuil classiquement admise et comprise entre 500 et 1000 spores par gramme, du moins pour l'espèce Gallus gaïïus. Pour les bas effectifs, l'emploi de deux méthodes simultanément serait souhaitable afin de rétablir la précision nécessaire à un résultat interprétable.

Remerciements

Les auteurs remercient les accouveurs concernés par cette étude et leur personnel pour leur aimable concours.

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Numeration des spores d'Aspergillus fumigatus 339 BIBLIOGRAPHIE

Anonyme, (1982). Circulaire DQ/SVPSA n° 82/8164 relative au controle officiel hygiénique et sanitaire des établissements producteurs d'oeufs à couver et établissements d'accou- vaison. Ministère de l'Agriculture de la République Française.

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Lahellec, C. et Colin, P. (1977). Etude préliminaire de la contamination des couvoirs: recherche de l'infection salmonellique. Bulletin d'information de la station expérimentale d' aviculture de Ploufragan. 17: 79-83.

Le Turdu, Y., Drouin, P. et coll. (1984). Production du poulet de chair destiné à l'exportation:

bilan d'une étude écopathologique réalisée en 1982-1983 dans la région Bretagne sur 90 lots et 30 élevages. Bulletin d'information de la station expérimentale d'aviculture de Ploufragan. 24:1.

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Richard, J.L. et Thurston, J.R. (1983). Rapid hematogenous dissemination of Aspergillus fumigatus and A. flavus spores in turkey poults following aerosol exposure. Avian Diseases, 27: 1025-1033.

SUMMARY

Comparison of three techniques for the enumeration of Aspergillus fumigatus spores in the hatcher as part of an epidemiologic survey of Aspergillosis

risks in hatchery houses

Methods of enumerating Aspergillus fumigatus spores on the down of hatching chicks in swabs of hatcher walls and in lungs of hatching chicks were compared under field conditions as part of an official survey of hatchery houses. Correlations and agreements between the results were studied. Their lack of accuracy is stressed, especially with the swab technique. This impels the aspergillosis risk to be evaluated from the average of the enumerations obtained simultaneously in a set of 10 hatchers.

ZUSAMMENFASSUNG

Vergleiche von 3 Methoden für die Zählung von Aspergillus fumigatus- Sporen im Schlupfbrüter im Rahmen einer epidemiologischen

Überwachung des Aspergillusrisikos in Brütereien

Die Methoden Aspergillus fumigatus-Sporen auf den Daunen schlüpfender Küken, in Abstrichen von den Wänden des Schlupfbrüters und in den Lungen schlüpfender Küken im Rahmen einer amtlichen Brütereiüberwachung zu zählen, wurden unter Praxisbedingungen verglichen. Die Korrelationen und Übereinstimmungen der Ergebnisse wurden untersucht. Der Mangel an Genauigkeit wird besonders bei der Abstrichmethode hervorgehoben. Das spricht eindeutig dafür, daß das Asper- gillusrisiko nur auf Grund des Durchschnittes von gleichzeitig in 10 Schlupfbrütern durchgeführten Zählungen zu beurteilen ist.

RESUMEN

Comparacion de tres tecnicas para el conteo de esporas de Aspergillus fumigatus en incubadora como parte de una encuesta epizootiologica de riegos por

Aspergilosis en casas incubadoras

Se compararon varios métodos para contar esporas de Aspergillus fumigatus a part'ir

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del plumón de pollitos en proceso de incubación, de las paredes de las incubadoras y de los pulmones de los pollitos, bajo condiciones de campo, como parte de una encuesta oficial en casas incubadoras. Se estudiaron las correlaciones de los resultados. Se resalta la falta de precisión, especialmente en lo concerniente al muestreo con hisopos, esto conlleva a la necesidad de que para evaluar la presen- cia de aspergelosis, es necesario hacer los conteos simultáneamente en grupos de

10 incubadoras.