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Analyse du ganglion sentinelle : vers de nouvelles techniques ?
F. Penault-Llorca
To cite this version:
F. Penault-Llorca. Analyse du ganglion sentinelle : vers de nouvelles techniques ?. 34° Journées de la Société Française de Sénologie et de Pathologie Mammaire (SFSPM), Paris, 2012. Acquis et limites en Sénologie, Nov 2012, Paris, France. pp.79. �hal-03575873�
Sentinel lymph node biopsy analysis:
towards new approaches?
F. Penault-Llorca1
Mots clés : cancer du sein, ganglion sentinelle, apposition, coupes à congélation, immu- nohistochimie, OSNA®
Keywords: breast cancer sentinel lymph node, cytology, frozen sections, immunohisto- chemistry, OSNA®
Contexte
Environ 20 000 patientes par an sont susceptibles de bénéfi cier d’une biopsie du ganglion sentinelle (GS) en France (note de cadrage de la Haute Autorité de Santé de septembre 2011). Si l’immunohistochimie (IHC) est le gold standard de l’ana- lyse histopathologique conventionnelle du ganglion sentinelle, il n’existe à ce jour pas de consensus sur la méthode d’évaluation du GS en peropératoire. On constate une grande disparité des pratiques entre les diff érents centres, le panel de technique comprend : l’analyse cytologique, la coupe congelée, l’analyse macroscopique, et plus récemment l’analyse en biologie moléculaire (OSNA®). À l’extrême, certains centres ont fait le choix de ne pas pratiquer d’analyse peropératoire au profi t de l’analyse défi nitive plus fi able.
Quand le diagnostic d’envahissement ganglionnaire est connu en extemporané, macro- ou micrométastase, le curage axillaire complémentaire peut être réalisé dans le même temps opératoire (la patiente peut être réopérée mais uniquement
Centre Jean Perrin, 63011 Clermont-Ferrand, France
80 Acquis et limites en sénologie
pour la question des marges d’exérèse). Lorsque l’envahissement axillaire est diag- nostiqué sur l’analyse défi nitive, le curage axillaire complémentaire sera réalisé au cours d’une deuxième intervention, éventuellement complétée d’une reprise des marges d’exérèse.
Le taux moyen de réinterventions chirurgicales est de 10 à 17 % et pour- rait donc concerner de 2 500 à 3 000 patientes par an. C’est pour cela qu’une réfl exion est menée sur les avantages et les inconvénients des diff érentes méthodes de détection peropératoire afi n de tenter de réduire notablement le nombre de réinterventions chirurgicales.
Que recherche-t-on lors de l’examen peropératoire du GS ?
D’éventuelles métastases qui vont être classées selon leur taille [1].
• Une micrométastase ganglionnaire est défi nie par la présence d’un foyer tumoral mesurant entre 0,2 et de 2 mm dans sa plus grande dimension et classée en pN1 (mi).
• Les foyers de plus petite taille (< 0,2 mm) ou cellules tumorales isolées (CTI) sont classés en pN0 (i+) s’ils sont vus grâce à l’IHC, ou (mol+) si la détection se fait par technique de PCR.
• Une macrométastase est défi nie par la présence d’un foyer tumoral mesurant plus de 2 mm dans sa plus grande dimension pN1 ou pN2.
Cette nouvelle classifi cation TNM présente ainsi l’intérêt de classer la maladie métastatique minimale que l’on met en évidence depuis l’avènement du ganglion sentinelle. Cependant, la valeur pronostique de microfoyers métastatiques détectés uniquement par l’immunohistochimie (IHC) reste sujette à controverses.
Techniques « classiques » d’examen peropératoire du GS
Les méthodes « classiques » d’examen extemporané sont l’examen cytologique, par empreinte ou par grattage et l’examen histologique sur coupe en congélation, avec ou sans examen immunohistochimique (IHC).
L’examen cytologique est une technique rapide – 5 à 10 minutes –, peu coûteuse qui préserve le tissu lymphoïde.
L’examen histologique sur coupe en congélation est plus consommateur en temps (15 à 40 minutes si IHC). Il nécessite la congélation du ganglion, une
coupe au cryostat et une coloration rapide. La pratique des IHC en peropératoire est très peu courante en France.
Alors apposition ou coupes à congélation ?
La sensibilité des coupes à congélation est meilleure que celle des appositions (88,2 % contre 47,1 %) pour la détection des métastases vues en état histolo- gique standard ou HES (et non en IHC) [2]. La méta-analyse de 2005 portant sur 31 études évaluant l’examen extemporané pour le GS, retrouve une sensi- bilité globale de 63 % pour la technique par empreinte dans la détection des macrométastases [3]. Le taux de faux négatifs de ces examens nécessitant une réintervention chirurgicale dans un deuxième temps varie de 9 à plus de 20 % (13 % dans le STIC GAS, 17 % dans l’expérience des grosses équipes françaises) selon les indications du GS et de la technique utilisée lors de l’examen extempo- rané (apposition ou coupes à congélation) et ensuite lors de l’examen défi nitif : coloration HES simple ou niveaux de coupes avec immunodétections (IHC) [4].
Les cas de faux négatifs sont essentiellement liés aux cas des micrométastases.
L’examen extemporané histologique sur coupes en congélation permettrait de détecter des métastases de plus petite taille que l’examen cytologique mais est de réalisation plus longue (et donc plus coûteux).
La sensibilité de l’examen peropératoire augmenterait avec la taille de la tumeur, ceci pouvant être expliqué par le fait que les tumeurs les plus grandes sont associées à des métastases de taille plus importantes. Ainsi, le taux de curage axillaire immédiat est signifi cativement plus bas pour les tumeurs de moins de 10 mm par rapport aux tumeurs supérieures à 10 mm (5 % versus 18 %), avec une diff érence qui était statistiquement signifi cative [5]. Les recommandations de l’American Society of Clinical Oncology en 2005, concluent qu’entre des mains entraînées, la méthode d’extemporané par coupe en congélation était préférable avec une meilleure sensibilité que la cytologie [6].
Mais tout cela n’était pas complètement satisfaisant…
Au moins pour les chirurgiens…, mais aussi pour les pathologistes, la technique extemporanée est fi nalement d’une fi abilité limitée, elle est relativement longue (15 à 30 minutes), elle n’examine pas de façon exhaustive le GS, elle implique la présence du pathologiste lors de l’intervention chirurgicale alors qu’il ne réalise
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(quasiment) plus d’extemporané sur la glande mammaire. Les progrès technolo- giques des dix dernières années ont permis de développer des techniques molé- culaires adaptées à la détection rapide, peropératoire de métastases dans le GS. La technique Veridex® par RT-PCR, n’étant plus commercialisée, nous ne parlerons que de la méthode OSNA®.
Méthode OSNA
®(Sysmex)
(One Step Nucleic Acid Amplifi cation)
Principe
Dispositif médical d’amplifi cation en une étape d’acides nucléiques, cette tech- nique consiste à amplifi er directement l’ARNm à partir des lysats tissulaires selon une méthode isothermique portant le nom de RT-LAMP (Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplifi cation). Elle a été mise au point pour automatiser le processus et indiquer quantitativement l’expression de l’ARNm spécifi que de la cytokératine 19 (CK 19) en 30 minutes. Il ne s’agit pas d’une technique de RT-PCR, la réaction est automatisée directement à partir d’un lysat tissulaire. Pour développer cette technique, le taux d’expression de 50 ARNm marqueurs poten- tiels, normalement non exprimés dans les ganglions lymphatiques, a été évalué par QRT-PCR sur des ganglions histopathologiquement positifs ou négatifs.
L’ARNm de la cytokératine 19 a été identifi é comme le meilleur marqueur car il est fortement exprimé dans les ganglions lymphatiques métastatiques et faiblement exprimés dans les ganglions sains [7]. Si la CK19 n’est pas exprimée au niveau mammaire, elle ne peut être détectée dans les ganglions métastatiques.
Plus de 98 % des tumeurs du sein expriment la cytokératine 19 [8]. Le nombre de copies d’ARNm de la CK19 varie selon le type d’atteinte ganglionnaire.
Des seuils ont ainsi été établis [7] permettant une évaluation semi-quantitative du taux d’envahissement du ou des GS (tableau I) :
• négatif : pas de métastase ou cellules tumorales isolées ;
• positif + : correspondant aux micrométastases de 0, 2 à 2 mm ;
• positif ++ : correspondant aux macrométastases (plus de 2 mm) ;
• positif inhibition : issue de l’analyse de l’échantillon dilué. Ce résultat est à considérer comme positif mais ne peut discriminer une micrométastase d’une macrométastase.
Tableau I. Formulation des résultats d’OSNA®.
Résultat OSNA Nb de copie par microL Correspondance
Négatif De 0 à 250 Négatif ou CTI
+ 250-5 000 Micrométastase
++ > 5 000 Macrométastase
I+ Non quantifi able Micro- ou macrométastases
Méthode
Les ganglions sont manipulés avec des gants et des instruments propres afi n de limiter le risque de contamination avec des cellules cutanées, (porteuses de CK19 marqueur de cellule épithéliale) qui pourraient fausser le résultat.
Chaque ganglion est dégraissé, pesé puis coupé en lamelle de 2 mm d’épaisseur.
Les autres tranches de ganglion sont broyées et homogénéisées. 1 mL de lysat est conservé à – 80 comme matériel de sauvegarde. De façon optionnelle, la tranche centrale est conservée pour inclusion en bloc de paraffi ne et analyse histo- logique défi nitive, mais Sysmex recommande le conditionnement du ganglion en totalité pour éviter les biais d’allocation tissulaire (voir plus loin).
Deux échantillons sont préparés pour analyse (un échantillon pur et un échan- tillon dilué) puis placés dans l’automate qui procède à l’amplifi cation et à la détection.
À l’issue d’une analyse durant au maximum 16 minutes, l’automate propose une réponse semi-quantitative : soit négatif, positif +, positif ++ et positif inhibition.
Un résultat « positif inhibition » est à considérer comme positif mais ne peut discriminer une micrométastase d’une macrométastase. Cela est lié à la présence dans l’échantillon (non purifi é) étudié d’un inhibiteur de l’amplifi cation qui négative faussement la réaction dans l’échantillon pur. La dilution par un facteur 10 permet de contrer la présence de cet inhibiteur et d’obtenir une amplifi cation mais qui ne refl ète pas réellement la quantité d’ARNm CK19 présent. Un logiciel est actuellement à l’étude pour permettre la quantifi cation de ces échantillons.
Le temps moyen nécessaire à la procédure complète (préparation et analyse) est de 36 minutes en présence d’un GS : 36 minutes, 2 GS 44 minutes (départ du bloc opératoire, rendu du résultat), dont 20 à 25 minutes de temps machine.
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Limites de la méthode OSNA® Ce sont principalement :
• l’expression de la CK 19 limitée à 98 % des tumeurs mammaires ;
• la conservation tissulaire : doit-on ou non conserver une tranche de ganglion pour analyse histopathologique. Le débat reste entier ;
• les positifs par levée d’inhibition (5 % des cas).
Performances de la méthode OSNA®
Détaillées dans le tableau II, elles sont très satisfaisantes dans les études publiées, multicentriques pour la plupart, avec des taux de concordances après correction des biais d’allocation tissulaire de 91,8 à 98,5 % (moyenne de 96,1 %) avec la technique de référence. Les cas discordants restent rares. Dans toutes les études, les cas d’analyse discordante entre la biologie moléculaire et l’analyse conventionnelle sont le plus souvent expliqués par les biais d’allocation tissulaire et notamment pour les micrométastases. En eff et, chaque ganglion sentinelle étant coupé en quatre tranches, une micrométastase peut se situer dans une seule tranche et de ce fait être identifi ée seulement par une seule des deux techniques comparées ce qui explique que la concordance n’est pas de 100 %.
Au total
La connaissance du statut ganglionnaire en extemporanée permet la réalisation du curage axillaire complémentaire dans le même temps opératoire. Une récente revue de la littérature montre une meilleure sensibilité de la technique de biologie moléculaire par rapport aux diff érentes méthodes d’analyse extemporanée, notam- ment pour le diagnostic des micrométastases [16]. En outre, au regard du taux de concordance élevé avec l’IHC, certains auteurs proposent de supprimer l’ana- lyse défi nitive conventionnelle, ce qui permettrait en outre d’alléger la tâche des anatomopathologistes déjà très sollicités et en sous-nombre. Il nous reste à statuer sur la nécessité ou non de conserver du tissu ganglionnaire pour analyse histopathologique complète. Ceci pourrait être solutionné par la réalisation d’éta- lements sur lame des cellules contenues sur le bistouri qui a servi à préparer les ganglions avant broyage.
Tableau II. Performances de la méthode OSNA® avant exclusion des cas de biais d’allocation tissulaire (*après analyse des discordances).
Étude Type Nb cas
Taux concordance
(%)
Sensibilité (%)
Spécifi cité (%)
VPP (%)
VPN (%) Snook, 2011
[9]
Multicentrique 204 patients 412 ganglions
92
*95,9
84,6
*91,7
93,7
*96,9
_ _
Visser, 2008 [10]
346 ganglions 94,8
*96,8
95,3
*97,1
94,7
*95,3
_ _
Tsujimoto, 2007 [11]
Unicentrique 325 ganglions
101 patients *98,8 *99,3 *95,6
_ _
Schem, 2007 [12]
Multicentrique 93 patients 343 ganglions
91,8
*95,5
98,1
*100
90,8
*93,4
_ _
Tamaki, 2009 Trial 1 [13]
Multicentrique 149 ganglions 36 patients
- 95 97,1 _ _
Tamaki, Trial 2 [13]
Multicentrique 551 ganglions 185 patients
92,9 87,5 94,1 _ _
Le Frère-Belda, 2011 [14]
Multicentrique 503 ganglions 233 patientes
_
*96,5
80,9
*91,1
93,9
*97,2
65,4 97,2 Bernet, 2011
[15]
Multicentrique 174 ganglions
Np patientes *98,3 *97,1 *98,6
Références
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