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Etude du rôle de la phospholipase A2 sécrétée de type IIA dans la mucoviscidose : modulation de son
expression par Pseudomonas aeruginosa
Erwan Pernet
To cite this version:
Erwan Pernet. Etude du rôle de la phospholipase A2 sécrétée de type IIA dans la mucoviscidose : modulation de son expression par Pseudomonas aeruginosa. Physiologie [q-bio.TO]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2014. Français. �NNT : 2014PA066249�. �tel-01202341�
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Université Pierre et Marie Curie
Ecole doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique Unité de Défense Innée et Inflammation, Inserm U874, Institut Pasteur
Etude du rôle de la phospholipase A2 sécrétée de type IIA dans la mucoviscidose : modulation de son expression par
Pseudomonas aeruginosa
Par Erwan Pernet
Thèse de doctorat de Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique
Dirigée par le Dr. Lhousseine Touqui
Présentée et soutenue publiquement le 18 Septembre 2014 Devant un jury composé de :
Pr. Jean-François Bernaudin Président
Pr. Mario Ollero Rapporteur
Pr. Marc Chanson Rapporteur
Dr. Loic Guillot Examinateur
Dr. Mustapha Si-Tahar Examinateur
2
Remerciements
Je tiens avant tout à remercier le Docteur Michel Chignard pour m’avoir accueilli dans son unité Défense Innée et Inflammation au sein de l’Institut Pasteur. Merci Michel pour la qualité de l’environnement de travail, de l’ambiance fabuleuse.
Je tiens à montrer toute ma reconnaissance au Professeur Jean-François Bernaudin, pour avoir accepter de présider cette thèse.
Je tiens également à exprimer ma gratitude au Professeur Mario Ollero et au Professeur Marc Chanson, qui ont accepté d’être rapporteurs de ma thèse.
Je tiens de la même façon à exprimer ma gratitude au Docteur Loic Guillot et au Docteur Mustapha Si-Tahar pour avoir accepté d’être membres de mon jury en qualité d’examinateurs.
Je tiens plus particulièrement à remercier le Dr. Loic Guillot, pour son implication en tant que tuteur pendant ma thèse et pour m’avoir fait part de son expérience et m’avoir conseillé sur mon choix futur de laboratoire.
Je remercie ensuite mon directeur de thèse, le Docteur Lhousseine Touqui. Un immense merci à toi Lhousseine, pour m’avoir choisi comme étudiant. Merci de m’avoir confié ce fantastique projet et pour la confiance que tu m’as accordé, de ta présence permanente et de tous les échanges que nous avons pu avoir. Tu as toujours réussi à me motiver pour que je me dépasse.
Je remercie également mon co-encadrant non officiel, le Docteur Yongzheng Wu. Tu as toujours été là pour parler Science, répondre à mes questions et m’orienter dans les bonnes directions. Tes connaissances techniques, que tu as su me transmettre, ont été une aide inestimable. Un grand merci !
Ô Laurent, Grand sage solitaire des moumous au sommet de la montagne ! Je ne pense pas trouver de mots qui permettront de décrire tout ce que tu as pu m’apporter, tant sur le plan scientifique que sur le plan humain. Tu as également été un soutien indéfectible dans les moments et manips compliqués. Je te souhaite le meilleur pour la suite ainsi qu’à Nat. Et on espère vous voir chez les caribous !
A Clément, le petit timide que nous avons dévergondé. Je ne compte plus le nombre de délires et de discussions sans fin que nous avons pu avoir. Une bouffée d’oxygène dans notre labeur quotidien. Les pauses café sur le toit du BIME et les étés à Pasteur me manquent déjà (j’imagine que toi aussi !). Bon vent à toi et à Catherine ! On vous attend à Montreal avec impatience ! On regardera Sharknado 3 ou Jurassic Shark vs Giant Octopus 2 en version québecoise !
MAM (Mathieu), première personne à m’avoir accueilli au laboratoire, tu as su faire du labo un endroit exceptionnel. Tu m’as tout montré, notamment une autre vision de la vie. Je te souhaite de t’épanouir tant sur le plan professionnel que sur le plan personnel et de continuer à profiter de la vie. Des bécots l’ami !
Mon cher Fab, merci pour ta joie de vivre communicatrice. Merci pour tous les bons moments que nous avons partagé au labo et en dehors. Jamais je n’oublierais Ingrid :D ! J’ai pu suivre ton évolution ces deux dernières années et te voir t’affirmer. Et j’espère que tu trouveras bientôt le bonheur que tu mérites d’avoir. Bon courage pour la suite dans le Nord (de Paris
^^).
Je n’oublie pas Vinciane. Merci pour toutes nos conversations scientifiques ou pas, d’avoir partagé ton expérience. Une vraiment belle rencontre. Je te souhaite tout plein de bonheur, une belle carrière scientifique et tout plein de bonnes choses !
Jeremy, mon premier stagiaire, qui a su me supporter ! Je te souhaite bonne continuation pour la suite !
Enfin, merci à tous ceux qui ont contribué à rendre ces 3 années exceptionnelles : Aurélie (courage Déesse des moumous!), Dom (bon voyage ;) !), Thomas (futur Grand !), Viviane, Fatima, Paolo, Jean-Michel, Brigitte S, sans oublier Florence et Brigitte B, les 3 Guillaume, Julie ! Merci à tous pour ces trois superbes années ! Je vous garde tous dans mon cœur ! Une petite pensée pour Carlos Blanco, un professeur exceptionnel qui a fait naître en moi cette passion pour la Recherche !
Je finis par le meilleur, enfin la meilleure. Merci à toi Roxane, pour tout depuis la première année de Fac. Sans toi et ton soutien je ne serais pas en train d’écrire ces quelques lignes. Je t’aime.
4 Communications et publications scientifiques.
Publications :
Erwan PERNET, Laurent GUILLEMOT, Pierre-Regis BURGEL, Clemence MARTIN, Dominique LEDUC, Isabelle SERMET-GAUDELUS, Dorota SANDS, Gerard LAMBEAU, Philippe MORAND, Michel CHIGNARD, Yongzheng WU et Lhousseine TOUQUI.
Pseudomonas aeruginosa manipulates host innate immunity to eradicate Staphylococcus aureus.
Nature Communications. Accepté.
Erwan PERNET, Jérémy BRUNET, Laurent GUILLEMOT, Michel CHIGNARD, Lhousseine TOUQUI et Yongzheng WU.
S. aureus adenosine inhibits sPLA2-IIA mediated killing in the airways.
Soumis à Journal of Infectious Diseases.
Communications orales:
P. aeruginosa manipulates host innate immunity to kill another pathogen : role of sPLA2-IIA.
E. Pernet, L. Guillemot, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Oral presentation. Research Day of Infection and Epidemiology Department. 1-2 Oct. 2013. Paris, France.
P. aeruginosa manipulates host innate immunity to kill another pathogen : role of sPLA2-IIA.
E. Pernet, L. Guillemot, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Oral presentation. Pseudomonas 2013. 7-11 Sept. 2013. Lausanne, Switzerland.
Mechanisms of P. aeruginosa-induced expression of secretory type IIA phospholipase A2 in cystic fibrosis lung epithelial cells.
E. Pernet, L. Guillemot, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Oral presentation. GREMI 2013, « The underestimated role of epithelium in inflammation». 12th, April 2013. Paris, France.
Mechanisms of P. aeruginosa-induced expression of secretory type IIA phospholipase A2 in cystic fibrosis lung epithelial cells.
E. Pernet, D. LeDuc, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Oral presentation. 4th European workshop on lipid mediators. 27-28 September 2012. Paris, France.
Prix du meilleur jeune chercheur.
Communications par poster:
P. aeruginosa manipulates innate immunity to eliminate S. aureus: Role of an host bactericidal protein.
E. Pernet, L. Guillemot, D. Leduc, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Poster. European Cystic Fibrosis Society, Basic Science. 26-31 March. 2014. St Julians, Malta.
Prix du meilleur poster.
Mechanisms of P. aeruginosa-induced expression of secretory type IIA phospholipase A2 in cystic fibrosis lung epithelial cells.
E. Pernet, L. Guillemot, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Poster. ATS 2013. 17-22 May 2013. Philadelphia, USA.
Mechanisms of P. aeruginosa-induced expression of secretory type IIA phospholipase A2 in cystic fibrosis lung epithelial cells.
E. Pernet, D. LeDuc, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Poster. Journées de la Recherche Respiratoire. 19-20 October 2013. Lille, France.
Mechanisms of P. aeruginosa-induced expression of secretory type IIA phospholipase A2 in cystic fibrosis lung epithelial cells.
E. Pernet, D. LeDuc, M. Chignard, Y-Z. Wu and L. Touqui.
Poster. 13rd Colloque des Jeunes Chercheurs, Vaincre la Mucoviscidose. 24 April 2012. Paris, France.
6 Abréviations
ADN : Acide Desoxyribonucleique ADP : Adenosine diphosphophate ADPRT : ADP Ribosyltransferase AMP : Adenosine monophosphate
AMPc : Adenosine monophosphate cyclique AP-1 : Activating Protein 1
ARN : Acide Ribonucleique ATP : Adenosine triphosphate
CARD : Caspase-Recruitment Domain CD14 : Cluster Differenciation 14
CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator CLR : C-type Lectine Receptor
ERK : Extracellular Regulated Kinase ExoS/T/Y/U/A : Exotoxine S/T/Y/U/A GAP : GTPase Activating Protein GTP : Guanosine Triphosphate HSL : N-acyl-homosérines lactones IKK : IκB Kinases
IL8 : Interleukine 8
IRAK : IL-1 Receptor Associated Kinase LBA : Lavage Broncho-Alvéolaire LBP : LPS-Binding Protein
LPS : Lipopolysaccharide
LRR : Leucin Rich Repeat domain MA : Macrophages Alvéolaires
MALP-2 :Macrophage-Activating Lipopeptide-2 MAPK : Mitogen Associated Protein Kinase MDP : Muramyl dipeptide
MDPc : Muramyl dipeptide contrôle
MyD88 : Myeloid Differenciation primary response gene 88 NF-κB : Nuclear Factor-κB
NLR : NOD-Like Receptor
NOD : Nucleotide-binding oligomerization domain Pam3CSK4 : Pam3CysSerLys4, lipoproteine bactérienne PAMP : Pathogen Associated Molecular Patterns
PRR : Pathogen Recognition Receptors RIG : Retinoic acid-Inducible Gene 1 RIP2 : Receptor Interacting Protein 2 RLR : RIG-Like Receptor
RPMI : Roswell Park Memorial Institute medium SST2/3 : Système de Sécrétion de Type 2/3 TLR : Toll-Like Receptor
TRAF : Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor TRAM : TRIF-Related Adaptor Molecule
TRIF : TIR-containing adaptor induing interferon-Beta
8 SOMMAIRE
INTRODUCTION ... 10
I. PSEUDOMONAS AERUGINOSA ... 10
A. GENERALITES ... 10
B. FACTEURS DE VIRULENCE ... 11
1. Facteurs de virulence membranaires. ... 11
2. Facteurs de virulence sécrétés ... 15
C. SYSTEME DE SECRETION DE TYPE III ... 19
1. L'injectisome ... 19
2. Appareil de translocation ... 20
3. Régulation de l'expression du T3SS ... 21
4. Effecteurs ... 21
D. INFECTIONS A PSEUDOMONAS AERUGINOSA. ... 25
E. BIOFILM ... 26
1. Mécanismes de communication bactérienne, le Quorum sensing. ... 26
2. Formation du biofilm ... 28
II. SYSTEME DE DEFENSE INNEE ... 31
A. GENERALITES ... 31
1. Premier rempart ... 31
2. La deuxième ligne de défense: la réponse immunitaire ... 31
B. IMMUNITE INNEE PULMONAIRE ... 32
1. Anatomie du poumon ... 32
2. Cellules de l’immunité innée ... 32
3. Reconnaissance des pathogènes ... 35
4. Récepteurs et Pseudomonas aeruginosa ... 39
C. MUCOVISCIDOSE ... 41
1. Généralités ... 41
2. Mucoviscidose et immunité ... 42
3. Pathogènes bactériens dans les poumons de patients MV ... 43
III. PHOSPHOLIPASE A2 ... 46
A. DEFINITION ... 46
B. ROLE PHYSIOLOGIQUE DES PLA2 ... 46
1. Voie des cyclooxygénases, COX1 et COX2 ... 47
2. Voie des lipoxygénases, LOX ... 48
3. Récepteurs des médiateurs lipidiques ... 48
4. Médiateurs lipidiques dans l’inflammation pulmonaire ... 49
C. PHOSPHOLIPASES A2 SECRETEES ... 49
D. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DE LA SPLA2-‐IIA ... 52
E. REGULATION DE L'EXPRESSION DE LA SPLA2-‐IIA ... 53
IV. BUT DU TRAVAIL ... 55
RESULTATS ... 56
ARTICLE 1: PSEUDOMONAS AERUGINOSA MANIPULATES HOST INNATE IMMUNITY TO ERADICATE STAPHYLOCOCCUS AUREUS. ... 57
ARTICLE 2: S. AUREUS ADENOSINE INHIBITS SPLA2-‐IIA-‐MEDIATED HOST KILLING IN THE AIRWAYS. ... 119
DISCUSSION GENERALE. ... 160
CONCLUSIONS ... 169
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 170
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Principaux facteurs de virulence de P. aeruginosa. ... 11
Figure 2: Différence de structure de la membrane entre les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif. ... 12
Figure 3: Structure du lipopolysaccharide. ... 13
Figure 4: Flagelle et pilus de P. aeruginosa. ... 15
Figure 5: Systèmes de sécrétion de P. aeruginosa. ... 16
Figure 7: Facteurs de virulence contrôlés par le Quorum sensing. ... 27
Figure 8 : Fonctionnement du Quorum sensing. ... 28
Figure 9: Etapes de formation du biofilm. ... 29
Figure 10: Voies de signalisation des récepteurs de type Toll. ... 37
Figure 11: Prévalence des infections bactériennes dans la mucoviscidose. ... 44
Figure 12 : Mode d’action des phospholipases A2. ... 46
Figure 13 : Synthèse des médiateurs lipidiques. ... 47
LISTE DES TABLEAUX Tableau 1: Prévalence des toxines du système de sécrétion de type 3 dans différents isolats de P. aeruginosa ... 22
Tableau 2 : Informations sur les effecteurs du T3SS de P. aeruginosa. ... 24
Tableau 3 : Prévalence des bactéries dans différentes pathologies infectieuses humaines. ... 25
Tableau 4 : Les principaux peptides antimicrobiens, leur source et mode d’action. ... 34
Tableau 5 : Les récepteurs de type Toll et leurs ligands issus de micro-‐organismes. ... 36
Tableau 6: Les principaux médiateurs lipidiques produits dans les poumons et leur source. ... 49
Tableau 7 : Caractéristiques des phospholipases A2 sécrétées. ... 51
10
Introduction
I. Pseudomonas aeruginosa
A. Généralités
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie ubiquiste à Gram négatif, motile grâce à un flagelle monotriche polaire, retrouvée dans les environnements humides. Son génome de 6,3 millions de paires de bases (souche de référence PAO1) est plus grand que celui d'autres bactéries, comme Escherichia coli (4,6 Mpb) ou encore Staphylococcus aureus (2,6 Mpb). Le génome de la souche PAO1 a été entièrement séquencé en 2000, indiquant qu'en plus d'un génome conservé (core), il possède de nombreuses zones variables [1]. En effet, des études génomiques sur des souches cliniques, environnementales ou de laboratoire comparées à la souche de référence PAO1, ont permis de montrer une très grande variabilité génétique au sein de P. aeruginosa. Au moins 10% du génome des souches cliniques/environnementales ou de laboratoire est unique par rapport à celui de la souche PAO1, dû en parti à l'acquisition de nombreux gènes par transfert horizontal [2, 3]. De cette façon, le génome de P. aeruginosa est en constante évolution, lui permettant de s'adapter à chaque environnement, notamment en présence de l'hôte ou en présence d'agents antimicrobiens.
P. aeruginosa possède de nombreux gènes impliqués dans le catabolisme et les systèmes d'efflux des antibiotiques, lui permettant de résister à de nombreux antibiotiques utilisés en clinique [4, 5]. La résistance aux antibiotiques est plus élevée pour les isolats provenant de patients souffrant de mucoviscidose [5]. Les différents mécanismes mis en place sont ceux retrouvés pour d'autres bactéries: les systèmes d'efflux ou le manque de perméabilité, l'inactivation et la modification des antibiotiques et la modification des cibles de ces derniers [5]. La formation de biofilm lui confère également une résistance aux antibiotiques et le rend ainsi plus difficile à traiter, notamment dans la mucoviscidose [6].
P. aeruginosa est un pathogène pour de nombreux organismes eucaryotes, comme les plantes, les insectes ou les vertébrés. Pour l'Homme, P. aeruginosa est considéré comme opportuniste, c’est à dire qu’il n’est pas pathogène pour l’organisme en temps normal, mais qui le devient lorsque les défenses de l’hôte sont affaiblies. Il est responsable d’infections nosocomiales et d'infections communautaires. Le bacille est acquis soit par auto- contamination (contamination endogène provenant de la sphère oro-pharyngée), soit par
transmission (équipements contaminés, manutention). P. aeruginosa est responsable d'infections respiratoires chroniques chez des individus immunodéprimés (VIH, chimiothérapie) et représente la première cause de mortalité chez les individus atteints de la mucoviscidose [7]. Il possède une large gamme de facteurs de virulence, lui permettant de coloniser et de persister dans ses différents hôtes.
B. Facteurs de virulence
P. aeruginosa possède tout un arsenal de facteurs de virulence impliqués dans sa pathogénicité. Ces derniers peuvent être classés en facteurs membranaires ou sécrétés (Figure 1) [8].
Figure 1 : Principaux facteurs de virulence de P. aeruginosa.
En rouge les facteurs de virulence membranaires. En bleu les facteurs de virulence sécrétés. Adapté de [8].
Les facteurs de virulence regroupent aussi bien les toxines, dont le but est d’endommager l’hôte, que les molécules reconnues par le système immunitaire, aussi connus sous le nom de PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns).
1. Facteurs de virulence membranaires.
a. Lipopolysaccharides
12 Les lipopolysaccharides (LPS) sont retrouvés chez toutes les bactéries à Gram négatif, qui, contrairement aux bactéries à Gram positif (Figure 2a), possèdent une membrane externe, sur laquelle se trouve les LPS (Figure 2b).
Figure 2: Différence de structure de la membrane entre les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif.
(a) Les bactéries à Gram positif ont une membrane cytoplasmique, un périplasme restreint et une épaisse paroi de peptidoglycane. Les acides lipoteichoiques sont ancrés dans la membrane cytoplasmique et sont reliés au peptidoglycane. (b). Les bactéries à Gram négatif possède une membrane cytoplasmique, une périplasme plus important avec une fine couche de peptidoglycane, et une membrane externe sur laquelle sont greffés les lipopolysaccharides et où se trouvent des porines facilitant le passage de molécules. Des lipoprotéines relient le peptidoglycane à la membrane externe.
Adapté de [9].
Le LPS est composé de 3 domaines différents: le lipide A, le noyau (core) et enfin la partie polysaccharidiques [10] (Figure 3). Le lipide A, région hydrophobe du LPS, permet l'ancrage à la membrane externe. Le noyau est une partie oligosaccharidique sur laquelle est rattachée la chaîne polysaccharidiques O spécifique, ou antigène O, dépassant de la membrane externe.
Cette chaîne O, qui peut être absente, varie avec les espèces de bactéries en composition saccharidiques ou en nombre de répétitions du motif polysaccharidique. Lorsque la chaîne O est absente il est alors question de phénotype rugueux et quand elle est présente, il est question de phénotype lisse. Les isolats cliniques de patients chroniquement infectés par P.
aeruginosa présentent généralement un phénotype rugueux [11].
Le lipide A est composé de deux glucosamines biphosphorylés, N- et O-acylatés et reliés par une liaison bêta 1-6. Les acides gras, dont la structure varie selon les souches, sont fixés sur les glucosamines en position 2' et 3'. La plupart des souches utilisées en laboratoire possèdent cinq groupements acyl sur le lipide A (penta acylation) [10]. Dans les isolats provenant de patients chroniquement infectés par P. aeruginosa, la forme hexa acylatée est plus
fréquemment retrouvée, constituant une des modifications du LPS des souches chroniques [11].
Figure 3: Structure du lipopolysaccharide.
Le LPS est composé de 3 domaines différents: le lipide A, le noyau (core) et enfin la partie polysaccharidique. Le lipide A, région hydrophobe du LPS, permet l'ancrage à la membrane externe.
Le noyau est une partie oligosaccharidique sur lequel est rattaché la chaîne polysaccharidique O spécifique, ou antigène O, dépassant de la membrane externe. Adapté de [12].
Le lipide A est la partie la plus importante du LPS, car il ne peut pas être délété [10]. C’est également le ligand du TLR4, un récepteur membranaire de l’hôte impliqué dans la reconnaissance des pathogènes (voir Chapitre II). Le noyau est greffé sur le lipide A et est relativement conservé [10]. Il est constitué d'un domaine interne et d'un domaine externe. La partie interne du noyau contient deux résidus d'acide D-manno-oct-2-ulosonique, KdoI et KdoII, et de deux résidus heptoses, HepI et HepII [10]. Le noyau externe, possédant deux isoformes (ou glycoformes) au sein d'une même souche, est constitué d'un galactosamine N- alanylaté, de trois résidus D-glucose et d'un résidu L-rhamnose [10]. C'est la position du résidu rhamnose qui différencie la glycoforme 1 de la glycoforme 2. C'est sur la glycoforme 2 qu'est greffée la chaine O polysaccharidique [10]. La chaîne O polysaccharidique permet de définir le sérogroupe de P. aeruginosa auquel appartient la souche [11]. La chaine O est constituée de motifs polysaccharidiques répétés, dont le nombre et la structure varient en fonction du sérogroupe [13].
b. Flagelline
P. aeruginosa produit un flagelle monotriche polaire, assurant la chimiotaxie et la mobilité à la bactérie et contribuant à sa virulence [14]. La structure du flagelle de P. aeruginosa est très proche de celle des entérobactéries comme Salmonella et E. coli. La structure globale du flagelle comporte trois parties principales: le corps basal, le filament et le crochet de torsion
14 Il est composé d'un complexe protéique cytoplasmique (C-ring), d'un anneau ancré dans la membrane interne (MS-ring), d'un canal traversant l'espace périplasmique, d'un anneau ancré dans le peptidoglycane (P-ring) et un anneau dans la membrane externe (L-ring) [15]. Le corps basal fonctionne avec le complexe MotAB qui permet de fournir de l'énergie au système afin d'obtenir la rotation du flagelle dans le sens contraire des aiguilles d'une montre [16]. Le crochet est une structure cylindrique assurant le rôle de connecteur entre le corps basal et le filament. Le filament est composé des sous-unités de flagelline, FliC, et d'une protéine Cap, FliD, favorisant la polymerisation [15]. Le flagelle est indispensable à P.
aeruginosa pour établir une infection et persister chez l'hôte [17], mais aussi pour établir un biofilm [14]. L'expression du flagelle de P. aeruginosa est perdue lors du passage du mode de vie planctonique au mode de vie biofilm (mode de vie des souches chroniques dans la mucoviscidose) [18].
c. Pili
P. aeruginosa produit des pili polaires, les pili de type IV [19, 20]. La structure des pili de P. aeruginosa varie selon les souches [21, 22]. Ce sont des structures d'environ 6nm de diamètre, qui peuvent s'étendre sur plusieurs mm de long. Ils sont constitués d'un assemblage de la piline PilA, ancrée dans la membrane interne et externe par les protéines PilC et PilQ respectivement (Figure 4b) [20]. Le complexe PilC/B/T fournit l’energie au système, permettant la contraction et l’étirement du pilus [19, 20].
Les pilis sont impliqués dans l'attachement aux surfaces et permettent également à la bactérie de se mouvoir sur une surface par un mécanisme appelé twitching, en se rétractant et s'étirant [19]. Les pilis de type IV permettent également l'adhérence aux cellules épithéliales de l'hôte en se fixant sur le récepteur asialo-GM1, ce qui conduit également à l'activation de la réponse immunitaire [23-25]. Une étude récente a montré que le pili de P. aeruginosa était également capable d’activer l'inflammasome [26].
Figure 4: Flagelle et pilus de P. aeruginosa.
(a) Le flagelle de P. aeruginosa est composé du corps basal, du crochet et du filament. Le corps basal est un complexe protéique organisé en quatre sous unités, les anneaux C, MS, P et L. Le crochet permet de relier le corps basal au filament. Ce dernier est composé de la flagelline FliC et se termine par la protéine FliD. L’énergie nécessaire au système est fournie par le complexe MotAB. (b) Le pilus de P. aeruginosa, pili de type IV, est composé de la sous unité PilA. Il permet à la bactérie de se déplacer sur une surface en s’étirant et en se rétractant. Adapté de [15, 20].
2. Facteurs de virulence sécrétés
P. aeruginosa possède 6 systèmes de sécrétion (Figure 5), mais seulement 2 semblent réellement impliqués dans sa pathogénie: le système de sécrétion de type 2 (T2SS) codé par les gènes xcp [27] et le système de sécrétion de type 3 (T3SS) codé par les gènes psc [28]. Le T2SS permet la sécrétion de multiples facteurs de virulence dans le milieu extracellulaire (élastases LasB, LasA, phospholipase, etc.), alors que le T3SS permet l'injection de toxines directement dans la cellule hôte.
16 Figure 5: Systèmes de sécrétion de P. aeruginosa.
P. aeruginosa possède 6 systèmes de sécrétion qui permettent de relarguer des protéines dans le milieu extracellulaire (T1SS, T2SS, T5aSS, T5bSS) ou directement dans une cellule cible (T3SS et T6SS).
Les T2SS et T3SS sont les systèmes de sécrétion les plus important dans la pathogénie de P.
aeruginosa. Adapté de [29].
a. Alginates
Les alginates sont des copolymères linéaires d’acides D-mannuronique et L-guluronique reliés par des ponts β-1,4. L’opéron alg est constitué de 12 gènes, dont le premier, algD, codant pour une GDP-Mannose 6 déshydrogénase, est surexprimé chez les souches mucoïdes, alors que son ARNm est non détectable chez les souches non mucoïdes [30]. L’opéron alg est transcrit essentiellement grâce au facteur sigma à fonction extracytoplasmique AlgU (ou AlgT), directement ou indirectement, dont l’activité est inhibée par la protéine membranaire MucA [31]. L’hypersécrétion d’alginates est responsable du phénotype mucoïde, retrouvé lors des infections chroniques des patients atteints de mucoviscidose [7, 32]. La surproduction d’alginates par les souches mucoïdes permet d’obtenir un phénotype plus avantageux dans la persistance au niveau de l’épithélium pulmonaire [6] et permet également de diminuer la phagocytose des bactéries et d’indirectement augmenter l'inflammation pulmonaire [33].
b. ADN
L’ADN extracellulaire (ADNe) est le composant majoritaire de la matrice des biofilms de P.
aeruginosa [34, 35]. La forte similarité entre l’ADN extracellulaire présent dans la matrice et l’ADN chromosomique de P. aeruginosa suggère que l’ADNe provient de la lyse d’une partie de la population bactérienne [35]. Une étude tend à montrer que ce phénomène serait induit par le PQS (Pseudomonas Quinolone Signal) une molécule du quorum sensing [35]. L’ADNe agit comme lien entre les bactéries au sein du biofilm et permet le maintien de son architecture [34]. Il a également été mis en évidence un lien entre l’ADNe et la résistance aux antibiotiques aminoglycosides et aux peptides antimicrobiens [36]. En plus de son rôle dans la strucutre des biofilms, l'ADN bactérien contribue à l'inflammation [37]. Notamment, l'ADN de P. aeruginosa est reconnu par le TLR9 [38].
c. Molécules du Quorum Sensing
P. aeruginosa produit deux types de molécules de signalisation : les N-acyl-homosérines lactones (HSL) et le PQS [39]. Les HSL sont les 3-oxodecanoyl-HSL (C12-HSL) et des N- butyryl-HSL (C4-HSL). Ces molécules sont surtout impliquées dans la formation de biofilm.
Les C12-HSL induisent cependant une réponse pro-inflammatoire sur les cellules épithéliales, mais le mécanisme reste encore inconnu [40].
d. Pyocyanine
La pyocyanine est un pigment sécrété, par le système de sécrétion de type 2 (T2SS), qui confère la coloration bleu-vert aux colonies bactériennes, qui a valu à P. aeruginosa le nom de bacille pyocyanique. Les mutants déficients en production de pyocyanine sont moins virulents in vivo [41]. La pyocyanine est grandement impliquée dans la pathogénie de P.
aeruginosa. Elle est pro-inflammatoire [42, 43], inhibe le battement ciliaire et la signalisation cellulaire [44] et enfin induit l'apoptose des cellules de l'hôte [41].
e. Elastase
P. aeruginosa sécrète, via le T2SS, l'élastase LasB. LasB est une métalloprotéinase (dépendante du zinc) de 33 kDa. C'est la protéase la plus sécrétée par P. aeruginosa [45].
LasB est impliquée dans la dégradation de nombreuses molécules de l'hôte:
immunoglobulines, les cytokines et les protéines du surfactant [46]. LasB joue également un rôle dans la répression de la production des toxines du système de sécrétion de type 3,
18 une augmentation de la sécrétion de la toxine ExoS. Enfin, une étude récente a montré que LasB détruit les jonctions serrées entre les cellules endothéliales en clivant la V-cadhérine, permettant ainsi l'invasion des tissus par P. aeruginosa [48].
f. Staphylolysine LasA
LasA est une protéase de 20 kDa, pour laquelle il a été suggéré qu'elle jouerait un rôle important dans les infections oculaires [49], mais ces résultats restent controversés [50]. Sa fonction la plus connue est d'induire la lyse de S. aureus, à la fois in vitro et dans un modèle d'infection oculaire in vivo [51, 52]. LasA agit sur le peptidoglycane de S. aureus en clivant les ponts polyglycines [53, 54].
g. Exotoxine A
L'exotoxine A (ExoA) est une ADP-ribosyltransférase sécrétée dans la milieu extracellulaire [55]. Elle entre dans les cellules par endocytose en se fixant sur son récepteur. Une fois à l'intérieur des cellules, ExoA ADP-ribosyle le facteur d'élongation EF2, inhibant la synthèse protéique et induisant la mort cellulaire [56].
h. Autres facteurs
P. aeruginosa sécrète d'autres molécules qui affectent les cellules de l'hôte. La phospholipase C qui a pour cible la phosphatidylcholine présente dans les membranes eucaryotes [57], participant aux infections pulmonaires aigües, à l'inflammation et dégradant les protéines du surfactant [58, 59]. Les rhamnolipides sont des biosurfactants sécrétés qui induisent la dégradation de la barrière épithéliale permettant l'invasion bactérienne [60]. La leucocidine constitue également un facteur de virulence qui induit la lyse des granulocytes et lymphocytes [61]. Et enfin la protéine OprF a également été décrite comme importante dans l'infection à P.
aeruginosa [62].
g. T3SS
Le système de sécrétion de type III permet l'injection de toxines directement dans la cellule hôte.
C. Système de sécrétion de type III
C’est un système hautement spécialisé de sécrétion de protéines, essentiel pour la pathogénie des bactéries pathogènes à Gram négatif, comme E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, Pseudomonas [63]. Ce système permet l’injection de protéines dites effectrices (ou toxines) directement dans le cytoplasme de la cellule cible. La plupart des molécules injectées miment des facteurs eucaryotes et sont capables de détourner la «machinerie» de l’hôte en faveur du pathogène lors de l’infection. Elles peuvent notamment induire l’invagination de la membrane permettant l’invasion intracellulaire des cellules non phagocytaires ou la modulation de la réponse immunitaire [63].
Chez P. aeruginosa, quarante deux acteurs sont, au minimum, impliqués dans l'expression, la régulation et la sécrétion des toxines par le T3SS [64]. Les différents acteurs peuvent être subdivisés en 5 classes distinctes: i) les protéines constituant la seringue permettant le transport des effecteurs du cytoplasme bactérien au cytoplasme de la cellule hôte, ii) les protéines impliqués dans la translocation en formant un pore dans la membrane de la cellule hôte, iii) les protéines chaperonnes qui facilitent la sécrétion des effecteurs, iv) les régulateurs de l'expression du système et enfin v) les effecteurs eux-mêmes (Figure 6).
1. L'injectisome
L'injectisome permet le passage des effecteurs du cytoplasme bactérien au cytoplasme de l'hôte. Comme pour les modèles très étudiés (Salmonella, Shigella ou Yersinia), l'injectisome de P. aeruginosa est composé d'un corps basal et de la seringue (Figure 6).
Le corps basal du T3SS est très proche structurellement du corps basal du flagelle. La seringue est un assemblage de la sous-unité PscF, formant une structure cylindrique à travers laquelle passent les effecteurs. L'énergie nécessaire au transport des effecteurs est fournie en hydrolysant l'ATP via la protéine PscN, elle-même régulée par PscL [65-67]. Les protéines PscC et PscW sont impliquées dans la formation du canal à travers la membrane bactérienne [68, 69]. Les protéines PscP et PscJ semblent jouer le rôle de contrôleurs de la synthèse de la seringue [70, 71].
! 20 2. Appareil de translocation
P. aeruginosa exprime 3 protéines impliquées dans la translocation des effecteurs: PopB, PopD et PcrV [72] (Figure 6). Ces protéines sont sécrétées par le T3SS et forment un pore de 2,8 à 6nm dans la membrane de la cellule eucaryote. Indépendamment des toxines, la formation du pore à elle seule induit la mort cellulaire et permet l'activation de l'inflammasome [72]. Il a également été démontré que la flagelline pouvait passer à travers la seringue pour activer l'inflammasome via NLRC4 [73, 74].
Figure 6: Système de sécrétion de type III de P. aeruginosa.
Le système de sécrétion de type 3 permet d’injecter des effecteurs bactériens, ou toxines, directement dans le cytoplasme de la cellule cible. Chez P. aeruginosa, quatre effecteurs ont été identifiés, ExoS, ExoT, ExoY et ExoU. Ils sont injectés à travers la seringue composée de sous unités PscF et l’appareil de translocation PopBD/PcrV qui permet de créer le pore dans la membrane de la cellule cible. Adapté de [64].
Les protéines sécrétées sont guidées par les protéines chaperonnes du cytoplasme à l'appareil de sécrétion. Cependant toutes les protéines sécrétées n'ont pas de chaperonnes. Par exemple, SpcS est la chaperonne des exotoxines ExoS et ExoT [75, 76]. SpcU est la chaperonne d'ExoU [77]. Mais ExoY n’en possède pas.
3. Régulation de l'expression du T3SS
La régulation du T3SS de P. aeruginosa a lieu au niveau transcriptionnel et au niveau de la sécrétion. L'expression du T3SS est induite par contact avec la membrane de la cellule hôte, mais le récepteur bactérien de ce signal reste encore à définir.
Au niveau transcriptionnel, les protéines de la famille Exs exercent le rôle de régulateur.
ExsA est le principal régulateur transcriptionnel de l'expression des gènes du T3SS [78]. A l'état basal, ExsA est complexé à ExsD, inhibant son activité transcriptionnelle. ExsD peut être dégradé par liaison directe avec ExsC [79]. L'activité d'ExsC est elle-même sous contrôle de son inhibiteur ExsE [80]. Ce système finement régulé permet la production contrôlée du T3SS.
D'autres niveaux de régulation sont également impliqués dans l'expression du T3SS, notamment les systèmes à deux composants RetS/LadS et GacA/GacS, les niveaux d'AMP cyclique et les ARN non codants régulateurs RsmA et RsmY [81-83].
Bien qu’il soit bien connu que la sécrétion des effecteurs soit induite par un contact avec la cellule hôte, les mécanismes précis restent encore assez peu connus. Toutefois, le T3SS peut être induit in vitro dans un milieu carencé en calcium et enrichi en glutamate [84].
4. Effecteurs
Seulement quatre effecteurs ont été identifiés à ce jour chez P. aeruginosa, les exotoxines ExoS, ExoT, ExoU et ExoY. P. aeruginosa produit moins de toxines que les autres bactéries à Gram négatif (Yersinia 6 toxines, Shigella 25 toxines, Salmonella 23 toxines) [62].
L’expression des toxines ExoS et ExoU varie selon la souche et la pathologie (Tableau 1).
Ces toxines ne sont pas exprimées dans la même souche [85]. En revanche, les toxines ExoT est toujours exprimée et la toxine ExoY dans la plupart des isolats. ExoU est une phospholipase A2 bactérienne, ExoY une adénylate cyclase et ExoS et ExoT possèdent une domaine GAP (GTP-Activating Protein) et un domaine ADPRT (ADP RibosylTransferase) (Tableau 2) [84].
22 Tableau 1: Prévalence des toxines du système de sécrétion de type 3 dans différents isolats de P. aeruginosa
Source des isolats ExoS ExoU ExoT ExoY
Environnement 80% 20% 100% 95%
Infection urinaires 70% 35% 100% 70%
Plaies 60% 40% 100% 93%
Mucoviscidose (expectorations)
85% 10% 100% 90%
Les isolats étudiés ont des profils d’expression des effecteurs du T3SS différents en fonction de leur source d’identification. Les toxines ExoS et ExoU ne sont jamais retrouvées ensembles. La toxine ExoT est présente dans 100% des isolats. Adapté de [84].
a. ExoS
ExoS, tout comme ExoT, est une toxine bifonctionnelle, possédant une activité ADPRT à son extrémité C-terminale et une activité GAP à son domaine N-terminal. ExoS possède également un domaine MLD (Membrane Localization Domain) nécessaire pour sa translocation initiale et l'interaction de son domaine ADPRT avec la protéine membranaire de l'hôte Ras [86, 87]. Une fois à l'intérieur de la cellule, ExoS est localisée à la membrane, puis migre vers l'appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique [88-90]. Le domaine GAP d'ExoS cible les protéines GTPases Rho, Rac et CDC42 [91]. Ces protéines membranaires passent d'un état actif en étant lié au GTP, à un état inactif, lié au GDP [92]. Le domaine GAP d'ExoS induit le passage de la forme active à la forme inactive [91, 93, 94]. Des études portant sur la structure d'ExoS, complétées par des mutagénèses spécifiques des sites d'intérêt, ont montré que l'inactivation de Rac1 par le domaine GAP était dépendante de l'arginine 146 (R146), inhibant ainsi la signalisation Rac-dépendante [84, 93, 95, 96]. L'interaction de R146 avec Rho, Rac et CDC42, conduisant à la déstabilisation du réseau d'actine, est également impliquée dans l'inhibition de la phagocytose et de l'endocytose[97]. Le domaine ADPRT agit sur des cibles plus nombreuses, mais les deux cibles principales sont la protéine Ras et le complexe Ezrine-Radixine-Moesine (ERM) [98, 99]. L'activité ADPRT d'ExoS nécessite la présence d'un co-facteur eucaryote, les protéines 14-3-3 [98, 100, 101]. Le domaine ADPRT est dépendant de deux glutamines, situées en position 379 et 381 [84]. Ras est une petite protéine membranaire, appartenant à la famille des GTPases, impliquée dans de nombreux processus cellulaires, comme la prolifération des cellules, la survie et le réarrangement de l'actine [102]. L'ADP ribosylation de Ras au niveau de l'arginine 41 par ExoS inhibe la voie de signalisation sous jacente, induisant l'apoptose des cellules infectées [103-105]. Ras-ADP ne peut pas se fixer sur son effecteur Raf1 [106]. Ces résultats sont confortés par l’utilisation
de cellules où Ras et la protéine kinase B, Akt, resistent à l'apoptose induite par ExoS- ADPRT [107]. Les protéines du complexe ERM interagissent directement avec l'actine, modulant la phagocytose et l’adhérence des cellules et sont activées par phosphorylation [108]. C’est sur cette étape de phosphorylation qu’agit ExoS-ADPRT, conduisant à l’inhibition de la phagocytose [99, 109].
De nombreuses études suggèrent qu’ExoS est également capable de moduler le profil d’expression des gènes de la cellule hôte. En effet, ExoS induit la sécrétion de cytokines pro- inflammatoires dans les monocytes en étant reconnu par le TLR4 et le TLR2 [110, 111]. Des analyses transcriptomiques de cellules épithéliales alvéolaires A549, infectées avec une souche déficiente pour ExoS, montrent des différences dans l'induction de certains gènes, dont des facteurs de transcription [112], peut-être due à l’activation de la MAP kinase JNK et l’inhibition des MAPK p38 et ERK [113]. De la même manière, O'Grady et al. ont démontré que la toxine ExoS, mais pas la toxine ExoT pourtant très proche sur le plan structural d'ExoS, induit l'expression des facteurs de transcription Krüppel-like facteur 2 (KLF2) et KLF6 [114]. KLF2 est un facteur anti-inflammatoire [115, 116] qui agit en inhibant de l'activité de NF-κB [117, 118]. De cette manière, P. aeruginosa détourne la réponse immunitaire pour favoriser sa persistance [114]. L'induction de l'expression de KLF2 par les toxines de Yersinia et de Clostridium résulte de l'inhibition de RhoA [119], mais les voies de signalisation impliquées pour P. aeruginosa restent encore mal connues.
b. ExoT
ExoT est une toxine bifonctionnelle, possédant, comme ExoS, un domaine GAP en N- terminal et un domaine ADPRT en son extrémité C-terminale. ExoT possède 76%
d'homologie avec ExoS [120]. Comme pour ExoS, l’activité d’ExoT requiert la présence des protéines 14-3-3 [120].
L'activité du domaine GAP d'ExoT cible les protéines RhoA, Rac et CDC42 in vitro et in vivo entrainant ainsi une destruction du cytosquelette d'actine et l'inhibition de la phagocytose [121, 122]. Le domaine ADPRT d’ExoT est impliqué dans la mort cellulaire [1, 28, 125]. En effet, ExoT est responsable de l’apoptose des cellules épithéliales [123] et des neutrophiles [124]. L'importance d'ExoT dans la pathogénie pulmonaire de P. aeruginosa est limitée comparé à ExoS ou ExoU, car sa délétion n'influe pas sur la persistance des bactéries au niveau pulmonaire, bien qu’ExoT favorise la dissémination systémique des bactéries [125].
24 b. ExoY
ExoY est une adenylate cyclase bactérienne qui convertit l'ATP en AMP cyclique, pouvant augmenter jusqu'à 500 fois ses niveaux dans la cellule [126]. Son activité adenylate cyclase est similaire à d'autres adenylates cyclases bactériennes, comme l'edema factor (B. anthracis) ou CyaA (B. pertussis). Une étude a montré qu'ExoY induisait un changement dans l'expression des gènes de la cellule hôte [112], bien que le rôle majeur de la toxine ExoY soit la formation de pores, de par sa localisation proche de la membrane [127].
Tableau 2 : Informations sur les effecteurs du T3SS de P. aeruginosa.
Effecteurs Masse (kDa) Activité Principales cibles Co-facteur
ExoS 48 GAP
ADPRT
Rho, Rac, CDC42
Ras, Ezrine, Radixine, Moesine
14-3-3
ExoT 49 GAP
ADPRT
Rho, Rac, CDC42 CRKI, CRKII
14-3-3
ExoY 42 Adénylate cyclase ATP ND
ExoU 74 PLA2 Phospholipides
Lysophospholipides
Ubiquitin PI (4,5)P2 GAP : GTP-ase Activating Protein. ADPRT : ADP-RibosylTransferase. PI (4,5)P2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Adapté de [28].
ExoY participe à la destruction de l'épithelium et à la dissémination de P. aeruginosa [128, 129], même si son rôle dans la pathogénicité in vivo reste cependant négligeable [130, 131].
c. ExoU
ExoU est une phospholipase A2 (PLA2) bactérienne, induisant une mort cellulaire rapide chez l'hôte [132, 133]. Elle possède un domaine patatine-like semblable à celui retrouvé chez les PLA2 eucaryotes (iPLA2 et cPLA2, voir chapitre 3). ExoU hydrolyse les phospholipides membranaires des cellules de l’hôte en position sn-1/2, dont résulte le relargage d'acides gras libres et de lysophospholipides. ExoU requiert la présence de co-facteurs de l'hôte pour son activation, en induisant un changement conformationnel de la toxine ou en la liant à ses substrats. Différentes cibles ont pu ainsi être identifiées, comme l'ubiquitine ou le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [134, 135]. ExoU possède également un domaine MLD à son extrémité C-terminale qui adresse ExoU à la membrane des cellules eucaryotes.
L'hydrolyse des phospholipides membranaires conduit à une rapide perte de l'intégrité membranaire, semblable à un phénomène nécrotique. L'activité de la toxine ExoU est
importante dans les modèles de pneumonie à P. aeruginosa chez la souris. En effet, il a récemment été démontré qu'un délai de 3 heures dans la sécrétion d'ExoU était suffisant pour augmenter la clairance bactérienne et ralentir la mort des souris [136]. ExoU est également capable de modifier l'expression des gènes au niveau des cellules épithéliales [137] et d'inhiber l’activation de l'inflammasome [74].
D. Infections à Pseudomonas aeruginosa.
P. aeruginosa est une bactérie de l'environnement, qui ne devient pathogène que si l'organisme qu'elle infecte présente une prédisposition, c'est donc un pathogène opportuniste.
La faiblesse de l'hôte peut être une diminution des défenses immunitaires (traitement aux corticoïdes, chimiothérapie, VIH) ou à une lésion de la peau et des muqueuses (brûlures, coupures). P. aeruginosa est le troisième micro-organisme responsable d'infections nosocomiales en France (8,4% des infections, rapport RAISIN 2012), juste derrière E. coli (26%) et S. aureus (15,9%). P. aeruginosa est majoritairement associés aux infections pulmonaires (18,1%) et aux infections des tissus mous et de la peau (44,1%) (Tableau 3).
Tableau 3 : Prévalence des bactéries dans différentes pathologies infectieuses humaines.
Bactérie Infections Urinaires
Infections Muqueuses/peau
Infections Respiratoires
Infections Nosocomiales
S. aureus 3,5% 11,8% 14,7% 29,2%
P. aeruginosa 6,9% 44,1% 18,1% 6,9%
E. coli 49,8% 7,5% 9% 13 ,5%
K. pneumoniae 6,6% 3,7% 6,1% 2,3%
E. faecalis 6,1% ND ND 5,7%
Autres espèces 27,1% 32,9% 52,1% 42,4%
Adapté du rapport RAISIN 2012 disponible sur www.invs.fr
Les infections à P. aeruginosa sont une cause majeure de bactériémie chez les grands brûlés, où l'intégrité de la barrière physique de la peau est compromise. L'infection peut se faire directement à l'hôpital, mais peut également être apportée par le patient lui-même [138].
P. aeruginosa est également responsables d'infections acquises hors de l'hôpital, comme les infections oculaires (kératite ulcéreuse et endophtalmite) et les otites. Les infections oculaires à P. aeruginosa représentent une cause majeure de la perte de la vue à travers le monde,
26 conséquences d'un traumatisme oculaire ou du port prolongé de lentilles de contact [124]. Les infections auriculaires à P. aeruginosa affectent le conduit externe de l'appareil auditif, il est question d'otites externes. C'est une infection très fréquemment observée chez les baigneurs réguliers en piscine, lui donnant le nom d'otite des piscines [139].
Mais ce sont bien les infections pulmonaires qui représentent la première cause d'infection à P. aeruginosa, qu'elles soient aigües en service de soin intensifs (pneumonies), ou chroniques dans la mucoviscidose et la bronchopathie pulmonaire chronique obstructive [140, 141]. Les infections chroniques observées dans la mucoviscidose sont associées à un changement de phénotype de P. aeruginosa, qui le rend plus adapté à son environnement, lui permettant de persister dans les poumons, généralement sous forme de biofilms.
E. Biofilm
1. Mécanismes de communication bactérienne, le Quorum sensing.
La formation du biofilm ainsi que l’expression de nombreux facteurs de virulence est sous le contrôle d'un système de communication bactérien appelé quorum sensing [142]. Les bactéries produisent des molécules auto-inductrices pendant leur croissance qui s’accumulent dans le milieu extérieur. Lorsque la densité cellulaire devient suffisamment élevée, les hautes concentrations d’auto-inducteurs vont permettre d’induire des changements d’expression des gènes dans la population bactérienne et notamment la production de facteurs de virulence [143] (Figure 7). P. aeruginosa produit deux types de molécules de signalisation : les HSL et le PQS [39].
Figure 7: Facteurs de virulence contrôlés par le Quorum sensing.
Cette figure présente les processus bactériens contrôlés par le Quorum sensing et leur implication dans la mucoviscidose. Adapté de [143].
Les C12-HSL et C4-HSL sont produites par les systèmes LasRI et RhlRI respectivement et sont auto-induites, d'où leur nom d'auto-inducteurs. LasI et RhlI sont les molécules sécrétées qui s’accumulent dans le milieu extracellulaire. Lorsque leur concentration est élevée, elles sont reconnues par les récepteurs cytoplasmiques LasR et RhlR. La formation du complexe LasR/I et RhlR/I induit leur fixation sur les promoteurs de certains gènes pour induire leur transcription (Figure 8). L’importance de ces systèmes dans la formation des biofilms varie selon les conditions expérimentales [144]. Il est cependant admis que le système LasRI est nécessaire pour la formation du biofilm de PAO1, mais l’implication de RhlRI est discutable [35, 145]. Les systèmes LasRI et PQS ont été montrés comme régulateurs de la formation de la matrice du biofilm, en induisant la lyse des cellules permettant le relargage d’ADN et en activant la synthèse de l’opéron pel impliqué dans la synthèse de polysaccharides qui contribuent à l’architecture du biofilm [35, 146, 147].
!
LasR/RhlR formé, celui-ci va pouvoir se fixer en amont de certains gènes pour induire leur transcription.
L’importance de ces systèmes dans la formation des biofilms varie selon les conditions expérmentales (de Kievit, 2009). Il est admis que le système LasRI est nécessaire pour la formation du biofilm de PAO1 (Allesen-Holm et al., 2006), mais l’implication de RhlRI est discutable (Allesen-Holm et al., 2006 ; Schaber et al., 2007). Les systèmes LasRI et PQS ont également été montré comme régulateurs de la formation de la matrice du biofilm, en induisant la lyse des cellules permettant le relargage d’ADN et en activant la synthèse de l’opéron pel (Allesen-Holm et al., 2006 ; Sakuragi et Kolter, 2007 ; Yang et al., 2007).
4. Matrice extracellulaire
La matrice est sécrétée par les bactéries elles-mêmes et joue un rôle important chez P.
aeruginosa car elle permet d’augmenter l’adhésion aux surfaces et entre les cellules mais également présente un rôle dans la virulence de la bactérie (Branda et al., 2005 ; Harmsen et al., 2010). Elle est constituée de plusieurs types de molécules : des exopolysaccharides, des protéines et des acides nucléiques, mais sa composition est souche et environnement dépendante (Branda et al., 2005 ; Harmsen et al., 2010).
including a number of potent secreted toxins, many of which are under the control of the QS regulatory system (Figs 1 and 2).
QS inP. aeruginosa
Since the first reports of cell density-dependent biolumines- cence in the fish symbiont Vibrio fischeri, bacterial QS regulatory systems have caught the imagination of micro- biologists. Communication occurs via the signalling mole- cules homoserine lactones (HSLs), which are secreted, accumulate in the external environment and, on reaching a critical concentration, are sensed by bacteria, triggering various responses. TheP. aeruginosaQS network is especially interesting because of its complexity, with two interdepen- dent LuxIR-type QS systems, LasIR and RhlIR, interacting with a quinolone signal and numerous regulators and sigma factors. The QS regulatory network ofP. aeruginosahas been reviewed recently (Girard & Bloemberg, 2008) and will not be discussed in detail here. Techniques such as microarray transcriptomics have been used to identify the extent of the QS regulon, which comprises 45% of the P. aeruginosa genome. QS mutants are attenuated for virulence in various infection models including the burned mouse model (Cao et al., 2001), mouse pneumonia model (Tanget al., 1996), rat model (Potvin et al., 2003), Arabidopsis thaliana (Rahme et al., 2000),Caenorhabditis elegans(Tan & Ausubel, 2000) andDictyostelium discoideum(Cossonet al., 2002).
QS and biofilm formation
Biofilm formation is an important feature of P. aeruginosa pathogenicity and contributes significantly to the resistance
ofP. aeruginosato aggressive antimicrobial therapy (Stewart
& Costerton, 2001). In the laboratoryP. aeruginosacan form two types of biofilms, termed ‘flat’ and ‘structured’, respec- tively. It has been shown that alginate-overproducing strains exhibit a highly structured architecture and are significantly more resistant to the antibiotic tobramycin (Hentzeret al., 2001), linking the CF signature mucoid phenotype directly with biofilm formation. The question of whether there is direct involvement of the QS system in biofilm formation has been a key issue for some time (reviewed by Kirisits &
Parsek, 2006). Studies usinglasorrhlmutants do suggest a role for QS in biofilm development, but interstrain varia- tions, subtle changes in gene expression due to environ- mental factors, and putative interactions at various stages in biofilm formation have all contributed to a lack of clarity.
However, in a mouse infection model, QS inhibitory drugs reduce biofilm formation (Christensenet al., 2007).
P. aeruginosa QS regulon
Pyocyanin
Biofilm architecture Rhamnolipid
Alkaline protease
Superoxide dismutase Elastase
HCN
LasA
Redox, physical and immunological effects
PMNs
Cytokines
Defences against ROS
Immune response evasion antibiotic tolerance DNA secretion Competitiveness
against Staphylococcus Impaired
lung function
Inflammatory factor, degrades surfactant proteins
Fig. 1. Pseudomonas aeruginosa QS-regulated virulence factors and their relevance to CF.
ROS, reactive oxygen species; PMN, polymorphonuclear leukocyte (neutrophil).
Redox effects
Cell respiration, Ca homeostasis, Prostaglandin, V-ATPases, α1-protease inhibitor,Nitric oxide
Physical effects
Ciliary function
Immunological effects IL-8, IL-2, RANTES, neutrophil apoptosis,
T cell response Pyocyanin
Competitiveness antibiotic activity
OH N N CH3
⊕
Fig. 2.Effects of pyocyanin.
FEMS Microbiol Lett290(2009) 1–9
!c2008 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved
2 C. Winstanley & J.L. Fothergill
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! 28 Figure 8 : Fonctionnement du Quorum sensing.
Le quorum sensing est un mécanisme de communication bactérienne qui implique des molécules auto- inductrices LasI et RhlI. Ces auto-inducteurs sont reconnus par leurs récepteurs LasR et RhlR respectivement ce qui induit leur propre transcription ainsi que celle d’autres gènes comme les facteurs de virulence LasA, LasB ou la pyocyanine. Issu de [39].
2. Formation du biofilm
Les biofilms sont définis comme une communauté de micro-organismes adhérant à une surface [148]. Le biofilm procure à la bactérie de nombreux avantages pour se protéger des agressions extérieurs ou trouver des nutriments. La formation des biofilms se déroule en 4 étapes, sans compter l’étape de dispersion (Figure 9). La première étape est celle d’adhérence qui est divisée en deux phases : l’adhérence réversible puis irréversible. Les bactéries utilisent les flagelles pour se déplacer vers la surface [149], mais également les flux environnementaux et les interactions ioniques faibles (Figure 9-I). Des molécules de surface de la bactérie interviennent ensuite dans la phase d’adhérence irréversible (Figure 9-II). Les premières bactéries adhérentes peuvent être appelées colonisateurs primaires. Dans la troisième étape, les colonisateurs primaires vont commencer à se diviser ce qui induit la formation de microcolonies (Figure 9-III), sur lesquelles vont se fixer de nouvelles bactéries planctoniques.
avoided during the initial growth phase. It remains possible, al- though not yet proven, that QteE and/or QslA also actively re- presses AHL-dependent gene expression during late stationary phase to conserve energy when AHL-related virulence is no longer needed.
Additional AHLs inP. aeruginosa
The AHL systems discussed here encompass only the two main AHLs ofP. aeruginosa (C4-HSL and 3-oxo-C12-HSL), although low concentrations of other distinct AHLs, namely, 3-oxo-C14- HSL and 3-oxo-C10-HSL, can be detected in the supernatants ofP.
aeruginosa cultures (28). The presence of smaller quantities of these AHLs may be due to a case of mistaken identity where the LasI synthase couples the wrong acyl carrier protein (ACP) to S-adenosylmethionine (SAM). However, these AHLs might also originate from the action of a different type of AHL synthase. In addition to the LuxI-type synthase, two other unrelated AHL syn- thase families have been reported: the LuxM synthase family, ex- clusive toVibriospp. (7, 77), and the more diverse HdtS synthase (113), originally identified inPseudomonas fluorescens, with puta- tive homologues in severalPseudomonasspp., includingP. aerugi- nosa.
DKPSAND LUXR ACTIVATION DKPs
A close examination of LuxI and LuxR homologues in all se- quenced genomes of Gram-negative bacteria clearly reveals an increased prevalence of LuxR- over LuxI-type proteins. Whether this ratio reflects a predominance of eavesdroppers over speakers or is an indication of the presence of unidentified alternative LuxR-binding molecules remains a matter of debate. The idea of a
novel set of molecules capable of binding and activating LuxR- type proteins was confirmed as a reality in 1999, when Holden and coworkers purified and elucidated several structures of a novel family of cyclic dipeptides, termed diketopiperazines (DKPs), from the supernatants of various bacteria, includingP. aeruginosa (Fig. 2) (92). DKPs have been proven to interfere with the quorum-sensing systems of various bacteria; this interference is most likely by binding to the LuxR family of receptors, either activating or antagonizing AHL signals. In the same work, the authors identified three different DKPs in the supernatants of var- ious bacteria: cyclo(!Ala-L-Val) and cyclo(L-Pro-L-Tyr) in P.
aeruginosa,Proteus mirabilis, andCitrobacter freundii; cyclo(!Ala-
L-Val) inEnterobacter agglomerans; and cyclo(L-Phe-L-Pro) inP.
fluorescensandPseudomonas alcaligenes.
FIG 1Virulence regulation of and interactions between the two AHL quorum-sensing systems inP. aeruginosa.After a threshold concentration of 3-oxo-C12- HSL is produced, the 3-oxo-C12-HSL–LasR complex binds the promoter regions of multiple genes, activating or repressing their transcription. Among the genes upregulated by this complex arelasI, which enhances the production of 3-oxo-C12-HSL (autoinduction effect), andrhlR, which increases the production of the rhlresponse regulator RhlR, activating the second AHL pathway at an earlier stage. Virulence factors regulated by each respective receptor-ligand complex are detailed on the left.
FIG 2Structures of the two DKPs produced byP. aeruginosa.
Nadal Jimenez et al.
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on April 3, 2014 by INSTITUT PASTEUR Bibliothèquehttp://mmbr.asm.org/Downloaded from
