A : rappels sur le génome Les acides nucléiques
Le DNA circulaire La chromatine B: Les outils de la biologie moléculaire
Enzymes qui coupent les acides nucléiques Enzymes qui changent les contraintes des AN Enzymes qui travaillent sur les phosphates Enzymes qui recopient les acides nucléiques
C: Les techniques de la biologie moléculaire Purification des acides nucléiques
Electrophorèse sur gel
Méthode de transfert d’après Southern Technique de l’amplification génique Le séquençage de l’ADN
Plan du cours : première partie
L’ADN Circulaire
l’ADN circulaire
Une forme particulière de l’ADN
Définition
Sens des super enroulements Notion de topoisomères
Importance des ADN circulaires
Mol Mol é é cule d cule d ’ ’ ADN circulaire ADN circulaire
5’
5’ 3’
3’
La chaine d’ADN peut ce circulariser et chaque brin se refermer sur lui même par des liaisons phosphodiester
LE SUPERENROULEMENT POSITIF
LE SUPERENROULEMENT POSITIF
LE SUPERENROULEMENT N
LE SUPERENROULEMENT N É É GATIF GATIF
LE SUPERENROULEMENT LE SUPERENROULEMENT
POSITIF
POSITIF
LE SUPERENROULEMENT
LE SUPERENROULEMENT
N N É É GATIF GATIF
ADN circulaire :
ADN circulaire : topoisom topoisom è è res res
Relaxée Torsadée Super torsadée
Topoisom
Topoisom è è res res de l de l ’ ’ ADN circulaire ADN circulaire
A : rappels sur le génome Les acides nucléiques
Le DNA circulaire La chromatine B: Les outils de la biologie moléculaire
Enzymes qui coupent les acides nucléiques Enzymes qui changent les contraintes des AN Enzymes qui travaillent sur les phosphates Enzymes qui recopient les acides nucléiques
C: Les techniques de la biologie moléculaire Purification des acides nucléiques
Electrophorèse sur gel
Méthode de transfert d’après Southern Technique de l’amplification génique Le séquençage de l’ADN
Plan du cours : première partie
La Chromatine
La structure de l’ADN dans la cellule
la chromatine
Pourquoi compacter l’ADN dans la cellule ? La machinerie de compaction
Les histones Le nucléosome
Les superstructures de l’ADN
Compaction de l
Compaction de l ’ ’ ADN ADN
Mod Mod è è le de compaction de l le de compaction de l ’ ’ ADN ADN
Double hélice d ’ADN
Double hélice d’ADN + histones
Fibre de chromatine
Chromatide Chromosome
Compactions de l
Compactions de l ’ ’ ADN ADN
-
Comprend de l'ADN (environ 200 pb) -Des protéines :
-des histones sous forme d'octamères:
2 x H
2A, 2 x H
2B, 2 x H
3et 2 x H
4et des protéines non histones.
- La protéine histone H1 est extérieure à la partie principale du nucléosome. Elle est sous forme d'une protéine unique.
LE NUCL
LE NUCL É É OSOME OSOME
Le nucl
Le nucl é é osome osome
200 200 pb pb d'ADN d'ADN
Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4 Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4
LE NUCL
LE NUCL É É OSOME OSOME
Histone
2 X H2A H1
2 X H2A 2 X H2B 2 X H2B
2 X H3
2 X H3
2 X H4
2 X H4
Empaquetage de l
Empaquetage de l ’ ’ ADN ADN
Chromosomes humains
Chromosomes humains
A : rappels sur le génome Les acides nucléiques
Le DNA circulaire La chromatine B: Les outils de la biologie moléculaire
Enzymes qui coupent les acides nucléiques Enzymes qui changent les contraintes des AN Enzymes qui travaillent sur les phosphates Enzymes qui recopient les acides nucléiques
C: Les techniques de la biologie moléculaire Purification des acides nucléiques
Electrophorèse sur gel
Méthode de transfert d’après Southern Technique de l’amplification génique Le séquençage de l’ADN
Plan du cours : première partie
Les outils de la biologie moléculaire
• Enzymes qui coupent les acides nucléiques
• Enzymes qui changent les contraintes des AN
• Enzymes qui travaillent sur les phosphates
• Enzymes qui recopient les acides
nucléiques
C A G
3’
P
P P P
3’ 3’
5’ 5’ 5’
Polarit
Polarit é é de la cha de la cha î î ne d ne d ’ ’ ADN ADN
Les nucléases
Les enzymes de restriction La DNase I
La nucléase S1
Les enzymes de restriction
Définition
Le palindrome
Symétrie de la coupure Coupure à bouts collants Coupure à bouts francs
Restriction et méthylation de l’ADN
Les enzymes de restriction sont des outils utilisés pour couper l’ADN.
La coupure de l’ADN se fait en un site particulier reconnu par l’enzyme.
Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique.
Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases
c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique
Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN
à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
Les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction
Enzymes de restriction
Enzymes de restriction
Les séquences de nucléotides Reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement
des séquences dites palindromiques.
Les séquences palindromiques sont des séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’Æ3’
(gauche - droite) pour le premier brin est identique à la séquence
lue dans le sens droite - gauche pour le second brin (sens 5’Æ3’).
Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4
ou 6 paires de bases.
LAVAL
Mot palindromique
Séquence palindromique
5’- GAATTC -3’
3’- CTTAAG -5’
Palindrome
Palindrome
Sites de restriction
Sites de restriction
Sym Sym é é trie des enzymes de restriction trie des enzymes de restriction
LES COUPURES
LES COUPURES À À BOUTS COLLANTS BOUTS COLLANTS
Enzyme Eco RI Enzyme Eco RI : :
5' 5' - - G G Ð Ð A A T T C - A A T T C - 3' 3' 3' 3' - - C C T T A A T T A A Ï Ï G G - - 5' 5'
5 5 ’ ’ – – G G – – 3 3 ’ ’ OH 5 OH 5 ’ ’ P P – – AATTC AATTC – – 3 3 ’ ’
3 3 ’ ’ – – CTAAG CTAAG – – 5 5 ’ ’ P 3’ P 3 ’ OH – OH – G G – – 5 5 ’ ’
LES COUPURES
LES COUPURES À À BOUTS FRANCS BOUTS FRANCS
Enzyme
Enzyme Hae Hae III III : :
5' 5' - - G G G G Ð Ð C C C C - - 3' 3' 3' 3' - - C C C C Ï Ï G G G G - - 5 5 ‘ ‘
5 5 ’ ’ – – GG GG – – 3 3 ’ ’ OH 5 OH 5 ’ ’ P P – – CC CC – – 3 3 ’ ’
3 3 ’ ’ – – CC CC – – 5 5 ’P 3 ’ P 3’ ’ OH – OH – GG – GG – 3 3 ’ ’
M M É É THYLATION DES CYTOSINES THYLATION DES CYTOSINES
Enzyme
Enzyme Msp Msp I I : : Coupure Coupure
5' 5' - - C C Ð Ð C* G G C* G G - - 3' 3' 3' 3' - - G G C* G G C* Ï Ï C C - - 5' 5' Enzyme
Enzyme Hpa Hpa II II : : Pas de coupure Pas de coupure
5' 5' - - C C* G G C C* G G - - 3' 3'
3' 3' - - G G C* C G G C* C - - 5' 5'
M M É É THYLATION DES SITES DE RESTRICTION THYLATION DES SITES DE RESTRICTION
Enzyme
Enzyme Hind Hind III III : coupure par l'enzyme : coupure par l'enzyme . .
5' 5' - - A A Ð Ð A G C T T A G C T T - - 3' 3' 3' 3' - - T T C G T T C G A A Ï Ï A A - - 5 5 ‘ ‘
Enzyme
Enzyme Hind Hind III (avec h III (avec h é é mi mi - - m m é é thylation thylation sur sur
l'ad l'ad é é nine en N6) nine en N6) : Absence de coupure par : Absence de coupure par Hind Hind III. III.
5' 5' - - A* A* A G C T T A G C T T - - 3' 3'
3' 3' - - T T C G A A T T C G A A - - 5' 5'
Les nucléases
La DNAse I
La nucléase S1
LA LA DNase DNase I I
5' 3'
3' 3' 5' 5'
C'est une
C'est une endonucl endonucl é é ase ase
Ses coupures se font au hasard Ses coupures se font au hasard
Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)
Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)
La DNase 1 est une endonucléase qui dégrade l’ADN double brin ou simple brin.
Les coupures (« nicks ») sont complètement aléatoires sans spécificité de site.
Les produits de la réaction sont des oligonucléotides qui possèdent un groupement phosphate en 5’.
L’activité dépend des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+)
La La DNase DNase
P P P P P
P P P P
P
3’
5’
OH
La Nucl
La Nucl é é ase S1 ase S1
La nucléase S1 dégrade l’ADN simple brin.
Nettoie les extrémités simples brins.
Coupe un misappariement
Sans activité sur le double brin « parfait » Sans activité sur les hybrides ADN/ARN
S1
5’
3’ 5’
3’
Enzymes des phosphates
Les phosphatases
Les kinases
Phosphatases et Kinases Phosphatases et Kinases
Les phosphatases sont des enzymes qui enlèvent les groupements phosphates situés en 5’ d’une chaîne d’ADN.
Phosphatase alcaline est active à pH basique.
Les kinases, à l’inverse des phosphatases, sont des enzymes qui ajoutent un groupement phosphate à l’extrèmité 5’ d’un ADN , en présence d’ATP.
C’est le phosphate en γ de l’ATP qui est transféré.
β α
γ A
Enzymes recopiant les acides nucl
Enzymes recopiant les acides nucl é é iques iques
Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN
DNA polymérase DNA dépendante DNA polymérase RNA dépendante RNA polymérase DNA dépendante RNA polymérase RNA dépendante
Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’
La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle.
L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates
(XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP)
Les DNA polymérases
Propriétés
DNA polymérase DNA dépendante
DNA polymérase I : Activités exonucléasiques
Fragment de Klenow
LES ADN POLYM
LES ADN POLYM É É RASES RASES
- - Un brin d'ADN matrice Un brin d'ADN matrice
- - Une amorce Une amorce oligonucl oligonucl é é otidique otidique
- - Une synth Une synth è è se du brin nouveau 5' se du brin nouveau 5' Î Î 3' 3'
3'(OH)
3'(OH) 5' 5'
5' 5' 3' 3'
DNA polym
DNA polym é é rase DNA d rase DNA d é é pendante pendante
Ces enzymes recopient l’ADN en ADN.
Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique.
La réaction catalysée est:
(dXMP)n + dXTP Æ (dNMP)n+1 + PPi Amorce avec une extrémité 3’-OH libre La nouvelle chaîne est synthétisée dans le sens 5’ Æ 3’
Règle de complémentarité et de polarité inverse
La DNA polym
La DNA polym é é rase 1 rase 1
Fragment de KLENOW Fragment de KLENOW
Le fragment de
Klenow
est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli.Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’Æ 3’ mais garde l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’ Æ 5’.
Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base qui vient d’être ajoutée obéit à la règle de complémentarité.
(fonction d’édition)
