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ARTICLE ORIGINAL ORIGINAL PAPER
Étude de l’écosystème microbien présent à la surface des barriques utilisées lors de la vinification
V. Renouf, O. Claisse, C. Miot-Sertier, M.-C. Perello, G. de Revel, A. Lonvaud-Funel
*SUMMARY
Study of the microbial ecosystem present on the barrels surface used dur- ing the winemaking.
After the fermentations, wine microbial stabilization is strongly recommended in order to avoid some possible microbial alterations such as volatile phenols and acetic acid production. Therefore, all possible sources of contamination must be investigated. Barrelling is commonly used, thus, we investigated the microbial community localized on the wood barrel surface. These analyses were realised on new barrels just before their first use and first contact with the wine. That has given a view of the real wood microbial community. We also studied this com- munity some months after wine contact, during successive racking at different steps of the wine elaboration. We enumerated five different microbial popula- tions: total yeast, non-Saccharomyces yeast, lactic acid bacteria, acetic acid bacteria and anaerobic and anaerobic tolerant Gram negative bacteria using five different selective nutritive media. Among each population, species and strains were identified by molecular tools such as the PCR-DGGE, PCR-RFLP and PFGE methods. At the laboratory scale, risks of contamination were evaluated by wine inoculation trials and their impact on the wine microbial population and the chemical properties: concentrations of volatiles phenols and acetic acid.
Before the first use and wine contact, the microbial community of the barrel wood was mainly composed by basidiomycetous yeasts such as Cryptococcus, Bulleromyces and Rhodotorula genera and enterobacteria species: Serratia sp.
and Shigella sp. After wine contact these micro-organisms became less and less detectable. That should be explaining by their low ethanol resistance. Neverthe- less, some species could resist and remained detectable some weeks after the first barrelling. The ability of these species to degrade some wood components could affect the wine microbial consortium. In addition, since the first racking, the majority of microbial species found on the wood barrel surface was com- posed by the major wine yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Oeno- coccus oeni) species, but, also by the spoilage agents such as Brettanomyces bruxellensis, Pediococcus parvulus and Gluconobacter oxydans. Nevertheless, laboratory trials of contamination have suggested that these residual populations are unable to lead to wine alteration. In fact, the micro-organisms present on the
UMR Œnologie Ampélologie INRA – Université Victor Ségalen Bordeaux 2 – 351, cours de la Libération – 33405 Talence Cedex – France.
* Correspondance : aline.lonvaud@oenologie.u-bordeaux2.fr
wood surface could not modify the microbial steady state of a wine which con- tained some populations regulated by oenological practices (sulphating, rack- ing…) and also by microbial interactions between each species. When the microbial population was low as it is the case after filtration or a heat treatment, the contamination was more possible. In any cases, washing of the barrels at each racking is strongly recommended in order to progressively eliminate the micro-organism which has adhered to the wood and to obtain an efficient micro- bial stabilization of the wine.
Keywords
barrel, wood, washing, micro-organism, contamination, Brettanomyces bruxel- lensis.
RÉSUMÉ
Après les fermentations, il est important de stabiliser microbiologiquement le vin afin d’éviter les altérations microbiennes possibles. Pour cela, toutes les sources de contamination doivent être envisagées et étudiées. Pour un grand nombre de vins, la fin des fermentations coïncide généralement avec l’entonnage. Nous avons étudié la flore microbienne présente à la surface du bois des barriques, en analysant les eaux de rinçage de barriques neuves avant leur première exposi- tion au vin et lors des soutirages à différentes étapes de l’élaboration du vin.
Cinq populations microbiennes différentes : levures totales, levures non-Saccha- romyces, bactéries lactiques, bactéries acétiques et bactéries à Gram négatif anaérobiques et anaérobiques facultatives, présentes dans les eaux de rinçage des barriques, les vins et les lies correspondantes ont été dénombrées sur des milieux nutritifs sélectifs. Les espèces et les souches ont été identifiées par des méthodes de biologie moléculaire comme la PCR-DGGE, la PCR-RFLP et l’élec- trophorèse en champ pulsé. Puis des essais réalisés au laboratoire ont permis de simuler et d’évaluer les risques de contamination.
Avant leur première utilisation, le bois des barriques contient une charge micro- bienne intrinsèque composée de levures appartenant majoritairement à la famille des basidiomycètes (Cryptococcus sp., Bulleromyces sp., Rhodotorula sp) et des bactéries appartenant à la famille des entérobactéries (Serratia sp., Shigella sp.). La majorité de ces espèces ne tolèrent pas les caractéristiques physico-chi- miques du vin. Par ailleurs, le bois des barriques constitue un réel réservoir pour les micro-organismes du vin : Saccharomyces cerevisiae et Oenococcus oeni et des espèces d’altération, Brettanomyces bruxellensis, Pediococcus parvulus et Gluconobacter oxydans. Même si ces micro-organismes résiduels ne semblent pas capables de contaminer un vin récemment entonné dont la charge micro- bienne est équilibrée, les soutirages doivent être l’occasion de les éliminer. Des lavages successifs à eau chaude de préférence, sous pression et dirigés sur l’ensemble de la surface intérieure du bois des barriques sont un bon moyen.
L’intérêt de ce nettoyage est encore plus important si le vin entonné est dépourvu de micro-organismes, comme par exemple après une filtration ou un traitement thermique, car dans ce cas les micro-organismes du bois disposent d’un écosystème vacant pour se multiplier.
Mots clés
barrique, bois, entretien, micro-organisme, contamination, Brettanomyces bruxellensis.
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1 – INTRODUCTION
Lors de l’élaboration du vin, l’entonnage est un événement important. Pour les vins rouges, cette étape intervient soit après l’écoulage, c’est-à-dire entre la fermen- tation alcoolique (FA) et la fermentation malolactique (FML), soit après cette der- nière, lors du premier soutirage post-fermentaire. Dans les vins blancs, il est fréquent d’entonner le vin avant la fin de la fermentation alcoolique pour que le gaz carbonique qui s’échappe participe à extraire les tanins et les arômes du bois. Dans tous les cas, le contact prolongé du vin et du bois contribue fortement à l’accom- plissement aromatique du vin (BARBE et BERTRAND, 1996 ; ORTEGAS-HERAS et al., 2004) et les composés extraits du bois, complètent les caractéristiques aromatiques du vin nouveau (BOIDRON et al., 1988). Suivant la structure organoleptique du vin, l’apport de boisé est plus ou moins souhaité. Il ne doit pas écraser les tanins fruités et les arômes fermentaires, mais contribuer à l’épanouissement aromatique du vin.
Pour réguler l’apport de boisé, le vinificateur dispose d’un large éventail de barri- ques. Les origines botanique et géographique du bois ainsi que les procédés de tonnellerie utilisés : découpe, séchage, chauffe, refroidissement et conservation, sont des paramètres importants à considérer lors du choix des barriques (DELTEIL, 2005). D’autre part, il peut être approprié d’alterner l’usage de barriques neuves, qui apportent un maximum de boisé, et de barriques usagées, qui permettent une évo- lution plus douce des vins (CERDAN et al., 2002).
D’un point de vue microbiologique, le logement du vin en barrique est, comme toute manipulation du vin provoquant un déséquilibre transitoire du milieu, un évé- nement conséquent. Il est important d’opérer dans des conditions d’hygiène rigou- reuses. Pendant longtemps l’utilisation des barriques usagées a été perçue comme une source possible d’altérations microbiennes. Mais de récentes études (RENOUF et LONVAUD-FUNEL, 2005) montrent, que dans le cas d’une hygiène stricte des fûts, les barriques usagées ne provoquent pas nécessairement plus de contaminations microbiennes que les barriques neuves. Au contraire, le bois neuf, par sa perméabi- lité vis-à-vis de l’oxygène et sa disponibilité en substrats carbonés favorise, durant les premiers mois de son utilisation, le maintien d’importantes populations de bacté- ries acétiques et de levures. Parmi ces levures, l’espèce Brettanomyces bruxellensis (B. bruxellensis), principale espèce résiduelle dans le vin en début d’élevage (RENOUF et al., 2005a), est particulièrement redoutée par le vinificateur à cause de sa capacité à produire de l’acide acétique, de l’acide isovalérique et des tétrahydropy- ridines. Mais les métabolites de B. bruxellensis les plus marquants sont certaine- ment les phénols volatils : 4-éthylphénol et 4-éthylgaïacol, qui confèrent des odeurs animales au vin.
L’objectif de ce travail est d’apporter une meilleure compréhension de l’écosys- tème microbien présent à la surface du bois des barriques. Nous avons dénombré les différentes populations microbiennes : levures totales (LT), levures non-Saccha- romyces (NS), bactéries lactiques (BL), bactéries acétiques (BA) et bactéries à Gram négatif anaérobies et anaérobies facultatives (BAGN) présentes dans les eaux de rinçage et de lavage de barriques neuves et usagées à différents stades de leur utili- sation. Puis les espèces microbiennes ont été identifiées en utilisant des méthodes de biologie moléculaire afin d’en réaliser un inventaire le plus exhaustif possible. Les souches de B. bruxellensis et d’Oenococcus oeni (O. oeni) présentes dans le vin logé en barrique et celles collectées dans les eaux de lavage et de rinçage des barri- ques ont été comparées par électrophorèse en champ pulsé.
Au laboratoire, le risque de contamination du vin par ces micro-organismes a été évalué en inoculant des vins avec les eaux de lavage. Les populations microbiennes des vins témoins et des vins inoculés ont été dénombrées et reliées aux teneurs en certains composés : acide acétique, phénols volatils. Nous avons étudié tout parti- culièrement le risque de contamination par B. bruxellensis.
Le choix du stade d’entonnage est important pour la contribution aromatique du bois au vin et la FML apparaît comme une étape particulièrement propice à l’échange aromatique entre le bois des barriques et le vin en fermentation (DE REVEL et al., 2005). Pour estimer l’incidence microbiologique d’un entonnage avant la FML, en terme d’apport de micro-organismes par le bois des barriques, nous avons éva- lué l’adaptation des micro-organismes des barriques dans des vins avant et après FML et étudié l’aptitude des bactéries lactiques présentes dans l’eau de lavage de barriques à déclencher la FML.
2 – MATÉRIELS ET MÉTHODES
2.1 Protocole d’expérimentation
Cette étude a été conduite sur trois domaines du vignoble bordelais. Au château I, nous avons étudié des barriques neuves de chêne français avant leur pre- mière utilisation et le contact avec le vin. Dans ce cas, l’étude de l’eau de rinçage permet d’accéder uniquement à la microflore du bois. Au contraire, l’eau de lavage des barriques usagées, révèle les micro-organismes du vin, déposés à la surface des barriques ou plus profondément à l’intérieur du bois, ainsi que les micro-orga- nismes du bois qui ont résisté à l’exposition prolongée avec le vin. Dans les châ- teaux II et III, l’écosystème microbien présent à la surface du bois des barriques a été évalué au cours de l’utilisation des barriques au moment des soutirages. Au châ- teau II, l’étude des eaux de lavage des barriques est réalisée lors des deux premiers soutirages de barriques à barriques. Au château III, l’analyse est effectuée unique- ment lors du premier soutirage de barriques à barriques mais deux techniques diffé- rentes de lavage ont été comparées (tableau 1).
Sur les trois châteaux, plusieurs techniques de lavage ont été étudiées et listées dans le tableau 1. Chaque lot d’étude est constitué d’au minimum trois barriques et les résultats obtenus sont reliés aux analyses des vins et des lies présents dans les barriques avant leur nettoyage. Pour chaque modalité de lavage nous avons utilisé le même volume d’eau de lavage afin de ne pas biaiser les dénombrements micro- biens par des phénomènes de dilution.
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Tableau 1
Modalités d’étude des eaux de lavage des barriques.
Table 1
Processes of barrels cleaning studied.
2.2 Analyses microbiologiques
L’écosystème microbien du vin, des lies et des eaux de lavage est observé par épifluorescence (MILLET et LONVAUD-FUNEL, 2000). D’autre part, l’isolement sur boîte de Petri en utilisant des milieux nutritifs sélectifs (RENOUF et al., 2005b) ont permis de dénombrer cinq groupes de populations : les levures totales (LT), les levures non- Saccharomyces (NS), les bactéries lactiques (BL), les bactéries acétiques (BA) et les bactéries Gram négatives anaérobies et anaérobies facultatives (BAGNA). Un contrôle microbiologique des eaux utilisées pour le rinçage des barriques a par ailleurs été effectué afin de s’assurer que les espèces détectées ne provenaient pas de l’eau.
2.3 Identification des espèces
Afin de réaliser des inventaires exhaustifs des espèces sans être limité par les biais d’identification liés à l’étape de culture (MASCO et al., 2005), nous avons utilisé des méthodes moléculaires d’identification. L’ADN microbien est extrait directement des échantillons puis analysé par PCR-DGGE. Pour les bactéries, la région du chro- mosome bactérien ciblé est une partie de la séquence codant pour la sous unité Bêta de l’ARN polymérase (gène rpoB) (RENOUF et al., 2006b), tandis que pour les levures la région ciblée est une partie des séquences des domaines D1/D2 du gène
Château Stade de mise en barriques du vin
Stade de la vinification correspondant à l’étude des eaux de lavage
Nature
des barriques Eaux de lavage des barriques Château I 1 mois après la fin des
fermentations et du sulfitage post-fermentaire
Lors de l’entonnage Barriques neuves et barriques usagées
2 eaux :
1re eau : eau à température ambiante (1/4 de la barrique) 2nd eau : eau à 95 °C (1/4 de la barrique)
Château II Juste après le sulfitage
post-fermentaire 1er et 2nd soutirage de barriques à barriques
Barriques
usagées 1 eau à température ambiante (1/4 de la barrique) Château III Après la macération, lors de
l’écoulage. Dans ce cas la FML a lieu en barriques.
1er soutirage de barriques à barriques après la FML
Barriques
usagées 2 systèmes de nettoyage Système A :
Système de jet d’eau sous pression avec canne pivotante sur chariot mobile 3 eaux en continu 1re eau à température ambiante
2e eau à 95 °C 3e eau à température ambiante
Système B :
Système de jet à haut débit 1re eau à température ambiante
2e eau à 95 °C 3e eau à température ambiante
codant pour l’ARNr 26S (COCOLIN et al., 2000). Ces méthodes de PCR-DGGE sont très sensibles et permettent une bonne résolution des mélanges microbiens. De plus, sur le gel d’acrylamide, il est possible de récupérer les bandes d’ADN pour procéder à leur séquençage. L’identification des espèces inconnues est réalisée par alignement (CORPET, 1988) et comparaison phylogénétique (SAITOU et NEI, 1987) des séquences obtenues avec celles disponibles dans les banques de données (GEN- BANK). Les méthodes de PCR-DGGE permettent une bonne estimation de la diver- sité microbienne, mais elles ne livrent pas de données quantitatives. Donc pour les levures, nous avons également utilisé la méthode de PCR-RFLP des régions ITS développée par ESTEVE-ZARZOSO et al. (1999) sur les colonies isolées. Cela permet d’estimer la proportion et le nombre de chaque espèce de levures (RENOUF et al., 2006b) en réalisant les PCR sur un échantillon de colonies isolées sur les boîtes de milieux sélectifs. Cela est important notamment lorsque l’étude porte sur les NS car il faut distinguer les espèces d’altération comme B. bruxellensis et les autres levures non-Saccharomyces qui contribuent favorablement à la typicité et à la structure aro- matique du vin (PRETORIUS 1999 ; JOLLY et al., 2003).
2.4 Identification des souches
Les techniques précédemment évoquées permettent une identification fiable des micro-organismes au niveau de l’espèce. Mais certains comportements à caractères œnologiques (capacité de se multiplier dans le vin, production de métabolites secondaires), au sein d’une même espèce, dépendent de la souche. Il est donc important de différencier les souches d’une même espèce.
Nous avons choisi de cibler deux espèces microbiennes. Dans le premier cas, comme il s’agit d’évaluer l’effet de l’entonnage avant la fermentation malolactique, les souches d’O. oeni présentes à la surface des barriques sont comparées aux souches présentes du vin lors de la FML. De même les souches de B. bruxellensis présentes à la surface du bois sont comparées à celles présentes dans le vin. Le typage des souches est réalisé par électrophorèse en champ pulsé selon des proto- coles développés par GINDREAU et al. (1997) pour O. oeni et MIOT-SERTIER et LON- VAUD-FUNEL (2006) pour B. bruxellensis.
2.5 Évaluation des risques de contamination
Au laboratoire, les risques de contamination du vin par les micro-organismes présents à surface du bois des barriques sont évalués en inoculant des vins, préala- blement filtrés (0,2 µm) ou non, avec des eaux de lavage des barriques. L’inocula- tion est réalisée au 1/100e dans un volume final de vin de 100 mL. Cette estimation est basée sur le rapport entre le volume du bois et le volume intérieur des barriques.
En effet compte tenu de l’épaisseur du bois (entre 12 et 15 mm), de la circonférence en bout (environ 1,80 m) et de la circonférence en bouge (environ 2,1 m), le volume du bois (environ 0,03 m3) est estimé comme représentant environ 1/100e du volume intérieur de la barrique. Pour les vins témoins et des vins inoculés, les populations microbiennes sont analysées et les analyses chimiques des vins effectuées. Chaque essai est triplé et les vins sont conservés à 25 °C.
2.6 Dosages chimiques
L’acide malique et l’acide acétique des vins sont dosés par des méthodes enzy- matiques (Kit Boehringer). Les concentrations en phénols volatils (4-éthylphénol et
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4 éthylgaïacol) sont déterminées après extraction du vin au dichlorométhane, en chromatographie en phase gazeuse (CHATONNET et BOIDRON, 1988). Pour chaque échantillon, les mesures sont triplées.
3 – RÉSULTATS
3.1 Dénombrement des populations microbiennes
Au château I, les populations de levures des eaux froides et chaudes de rinçage des barriques neuves sont relativement élevées (8.102 UFC/mL). Ce sont exclusive- ment des non-Saccharomyces. Les populations de bactéries à Gram négatif anaéro- bies, sont aussi importantes, environ 1,5.103 UFC/mL. Les eaux froides, les premières utilisées sont plus chargées (2,4.104 cellules viables/mL en épifluores- cence) que les eaux chaudes. Pour les barriques usagées, les populations de bacté- ries lactiques et de bactéries acétiques sont supérieures à 103 UFC/mL et nettement supérieures à celles des barriques neuves, surtout pour les eaux froides. Mais l’épi- fluorescence, pour ces barriques usagées, ne montre pas de différence significative entre la microflore totale viable présente dans les eaux froides et les eaux chaudes (environ 104 cellules viables/mL dans les deux cas).
Au château II (figure 1), l’étude des eaux de lavage des barriques est réalisée lors des deux premiers soutirages de barriques à barriques. Les populations en bacté- ries lactiques et acétiques ne présentent pas de différences significatives pour les deux soutirages. Les eaux de lavage du second soutirage sont plus concentrées en levures (9.102 UFC/mL). Les non-Saccharomyces représentent lors du second souti- rage la totalité des levures alors qu’elles ne représentaient que 50 % de la popula- tion de levures totales lors du premier soutirage. Dans les lies, les levures sont mille fois moins concentrées lors du second soutirage que pour le premier soutirage.
Au troisième château, nous avons dénombré les populations microbiennes pré- sentes dans les trois eaux de lavage des deux systèmes de nettoyage mis en œuvre (tableau 1). Pour l’ensemble des populations microbiennes, hormis les bactéries Gram à négatif anaérobies, les dernières eaux de lavage sont les moins concen- trées. Pour les levures totales et les deux systèmes de lavage, chaque étape réduit d’un facteur 10 environ la population récupérée dans les eaux de lavage pour passer de 105 UFC/mL dans les premières eaux à 102 UFC/mL dans les dernières. Pour chaque population microbienne et chaque stade de nettoyage, les eaux issues du système A sont plus riches en micro-organismes. Les deux dernières eaux de rin- çage du système A présentent une concentration importante en bactéries à Gram négatif (respectivement 1,2.104 UFC/mL et 1,15.103 UFC/mL) alors que cette popu- lation est indétectable dans le vin et les lies, et très faible dans les autres eaux de lavage du système B.
Levures totales
1E+00 1E+02 1E+04 1E+06
Eaux 1er soutirage
Eaux 2e soutirage
Vin 1er soutirage
Vin 2e soutirage
Lies 1er soutirage
Lies 2e soutirage
UFC/mLUFC/mLUFC/mL
Bactéries lactiques
1E+00 1E+02 1E+04 1E+06
Eaux 1er soutirage
Eaux 2e soutirage
Vin 1er soutirage
Vin 2e soutirage
Lies 1er soutirage
Lies 2e soutirage
Bactéries à Gram négatif anaérobies
1E+00 1E+02 1E+04
Eaux 1er soutirage
Eaux 2e soutirage
Vin 1er soutirage
Vin 2e soutirage
Lies 1er soutirage
Lies 2e soutirage Figure 1
Populations microbiennes dans les vins, les lies et les eaux de lavage des deux premiers soutirages de barriques à barriques au château II.
(Moyennes calculées sur un lot de cinq barriques).
Figure 1
Microbial populations in the wines, the lees, and the barrels washing water at the first and the second racking for the chateau II. (The average were calculated
on five barrels analyses).
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3.2 Identification des espèces
Au château II, lors du premier soutirage l’espèce de levure majoritaire dans le vin est Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), 55 %, (tableau 2) tandis que dans les lies et dans les eaux de lavage c’est B. bruxellensis qui domine : respectivement 70 % et 85 %. Lors du second soutirage, B. bruxellensis est dominante dans le vin (85 %) et c’est la seule espèce détectée dans les lies et dans les eaux de lavage.
Au château III, S. cerevisiae et B. bruxellensis sont détectées par analyse directe en PCR-DGGE dans les vins et les lies. Les espèces détectées et identifiées après l’analyse des séquences extraites du gel, dans les eaux de lavage varient au fur et à mesure du nettoyage (figure 2). La première et la dernière eau de lavage présentent le même profil que le vin et les lies. Dans la seconde eau de lavage, la diversité est plus importante : l’espèce Candida cantarelli (C. cantarelli) est détectée ainsi qu’une espèce appartenant au genre Cryptococcus et des moisissures du genre Aspergil- lus. Avec le système B seules les espèces S. cerevisiae (1re et 2e eaux) et B. bruxel- lensis (dans les trois eaux) sont détectées.
UFC/mLUFC/mLCellules viables/mL
Levures non-Saccharomyces
1E+00 1E+02 1E+04 1E+06
Eaux 1er soutirage
Eaux 2e soutirage
Vin 1er soutirage
Vin 2e soutirage
Lies 1er soutirage
Lies 2e soutirage Bactéries acétiques
1E+00 1E+02 1E+04 1E+06
Eaux 1er soutirage
Eaux 2e soutirage
Vin 1er soutirage
Vin 2e soutirage
Lies 1er soutirage
Lies 2e soutirage Épifluorescence
1E+00 1E+02 1E+04 1E+06 1E+08
Eaux 1er soutirage
Eaux 2e soutirage
Vin 1er soutirage
Vin 2e soutirage
Lies 1er soutirage
Lies 2e soutirage
Figure 1 (suite)
Tableau 2
Évolution du pourcentage des différentes espèces de levures identifiées par PCR-RFLP-ITS lors des deux premiers soutirages dans le vin, les lies et les eaux
de lavage correspondantes (château II).
Table 2
Distribution of yeast species (%) in the wine, the lees, and the barrels washing water during the first and the second racking (chateau II).
La figure 3 montre, sous la forme d’un arbre phylogénétique les différentes séquences nucléotidiques extraites des gels de DGGE pour les levures et les bacté- ries et leur comparaison avec les espèces de référence. Les principales espèces rencontrées dans le vin : S. cerevisiae, B. bruxellensis et C. cantarelli pour les levu- res, O. oeni, Pediococcus parvulus (P. parvulus) et Lactobacillus plantarum (L. plan- tarum) ne sont détectées que dans les eaux de lavage des barriques ayant au préalable un contact avec le vin. Parmi les levures détectées dans l’eau de lavage de barriques neuves avant le contact entre le bois le vin (château I), il est intéressant
Espèces de levures
1er soutirage 2e soutirage
Vin Lie Eaux de lavage Vin Lie Eaux de lavage
Saccharomyces cerevisiae 55 % 15 % – 10 % – –
Brettanomyces bruxellensis 35 % 70 % 95 % 85 % 100 % 100 %
Pichia fermentans 10 % – – – – –
Saccharomycodes ludwigii – 15 % 5 % – –
Candida cantarelli – – – 5 % – –
Vin Lies A1 A2 A3
Brettanomyces bruxellensis Saccharomyces cerevisiae Candida sp.
Aspergillus sp.
Cryptococcus sp.
Figure 2
Profil de DGGE levures dans le vin, les lies et les trois eaux de lavage du système A de nettoyage des barriques au château III.
Figure 2
DGGE profiles of yeast population in the wine, the lees and the three successive waters used in the cleaning process A for the chateau III.
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de noter la présence des levures Basidiomycètes : Cryptococcus cellulolyticus, Cryptococcus numerous et d’une espèce proche du genre Rhodotorula. Concernant les bactéries, les espèces rencontrées uniquement dans les barriques neuves avant l’exposition au vin sont essentiellement des bactéries à Gram négatif et anaérobies facultatives se rapprochant des bactéries du genre Shigella et Serratia.
Levures Neosartorya sp.
A
Aspergillus terreus B
C D
E
Candida cantarellii F
Saccharomyces cerevisiae M
Brettanomyces bruxellensis O
Exophiala dermatidis N Rhodotorula bacarum L
G H
Bulleromyces albus I
Cryptococcus laurentii P
J
Cryptococcus cellulolyticus K
Cryptococcus nemorosus 100 100
98
100 100 96
56 99
55 75 27
54
81
99
95
35 95
76 52
97
34 67 42 0,05
Lactobacillus plantarum I
II
Pediococcus parvulus III
Oenococcus oeni IV
V
Bacillus mycoides VI
Gluconobacter oxydans VII
VIII Serratia rubidaea Shigella flexneri
IX X XI 100 100
100
36 100 63 63
79
92 100
99 79
76 91 0,05
I
Bactéries
Figure 3
Arbres phylogénétiques construits selon la méthode des plus proches voisins et après répétitions de 1000 bootstrap des séquences extraites des gels de DGGE rpoB
pour les bactéries (à droite, en chiffres romains) et de DGGE D1/D2 pour les levures (à gauche, en lettres majuscules). Les séquences soulignées correspondent aux séquences détectées uniquement dans l’analyse des eaux de lavage des barriques
neuves n’ayant jamais été en contact avec le vin. Les séquences encadrées correspondent aux séquences détectées uniquement dans les eaux de lavage des barriques ayant eu un contact avec le vin. Les chiffres au-dessus des branches
représentent les valeurs de bootstrap obtenues après 1000 répétitions.
0,05 est l’échelle de distance phylogénétique des branches.
Figure 3
Phylogenetic tress built according to the neighbor-joining method and after 1000 repetitions of bootstrap of the sequences excised of rpoB DGGE gels for the bacteria (on the right, in roman numeral) and excised of D1/D2 DGGE gels for the yeast (on the left, in capital letters). The underlined sequences are the sequences only
detected during the new barrels analyses. The surrounded sequences are the sequences only detected on the surface of the barrels which are previously exposed to the wine.
The numbers given in the branches are the bootstrap values obtained after the 1000 repetitions and 0.05 represents the scale for the phylogenetic branch length.
3.3 Comparaison des souches
Au niveau des souches, la figure 4 montre le profil d’électrophorèse en champ pulsé de la biomasse totale collectée sur boîte de Petri de culture des bactéries lac- tiques des échantillons de vin et d’eau de lavage ayant contenu le vin durant sa fer- mentation malolactique. Les profils sont identiques (château III). Il en est de même pour le château II, ce qui suggère que les souches d’O. oeni présentes à la surface du bois sont celles du vin durant la fermentation malolactique. Ces souches restent donc à la surface du bois à la fin des fermentations, après le sulfitage du vin et la chute des populations dans le vin.
Concernant les souches de B. bruxellensis, trois profils électrophorétiques diffé- rents sont obtenus sur les colonies isolées du vin (château III). Ils sont retrouvés dans les différentes eaux de lavage des barriques. Les souches du vin et celles qui adhèrent à la surface des barriques sont donc bien identiques.
I II III IV V VI
Figure 4
Gel d’électrophorèse en champ pulsé permettant de comparer les souches d’O. oeni présentes dans le vin à celles présentes à la surface des barriques et récupérées lors du nettoyage de ces dernières. Puits I : marqueur, Puits II O. oeni dans le vin lors de la FML en barrique au château III, Puits III O. oeni récupérée dans l’eau de lavage des barriques (eau B3) du château III, Puits IV O.oeni durant la FML du vin
du château II, Puits V O. oeni récupérée dans l’eau de lavage des barriques lors du premier soutirage des barriques au château II et Puits VI : marqueur.
Figure 4
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) allowing wine and wood O. oeni strains comparison. Lane I: ladder, Lane II: O. oeni of wine during MFL for the chateau III,
Lane III O. oeni found in the barrels washing water (water B3) for the chateau III, Lane IV O. oeni of during MLF for the chateau II, Lane V O. oeni found on the woods
at the first racking for the chateau II, Lane VI: ladder.
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3.4 Évaluation des risques lors d’une contamination
3.4.1 Déclenchement de la fermentation malolactique par inoculation d’eau de lavage de barriques
Les eaux de lavage sont récupérées de barriques ayant été utilisées pour la FML de vins. La population de bactéries lactiques dans les eaux de lavage est de : 5,1 ± 0,8.104 UFC/mL. L’étude par PCR-DGGE rpoB de la biomasse sur boîtes de milieu BL montre qu’il s’agit exclusivement d’O. oeni. Dans le vin avant FML, la population composée majoritairement de l’espèce O. oeni est d’environ 103 UFC/mL (vin non filtré). Dans le vin filtré et inoculé, la population de BL apportée par les eaux de lavage est au début du suivi d’environ 102 UFC/mL soit dix fois moins que dans les témoins avec la flore indigène. Après une phase de déclin les BL apportées par les eaux de lavage se développent et déclenchent une FML mais plus tardivement que les BL indigènes : dans les vins non-filtrés la chute de l’acide malique démarre à partir du 10e jour alors que dans le vin filtré elle devient significative qu’à partir du 50e jour. La FML par les BL des eaux de lavage est plus languissante : 50 jours sont nécessaires à la consommation de l’acide malique alors que dans les vins témoins 14 jours suffisent.
3.4.2 Croissance des micro-organismes issus des lavages des barriques dans des vins avant et après FML
Le même vin avant et après FML est filtré puis inoculé au 1/100 avec de l’eau de lavage contenant 6 ± 1.102 UFC/mL de LT (composée exclusivement de NS), 5,1 ± 0,8.104 UFC/mL de BL et 3,0 ± 0,4.102 UFC/mL de BA. Les populations micro- biennes sont dénombrées après 30 jours de culture. On remarque que les BL s’implantent plus facilement dans le vin avant FML. Malgré le sulfitage post-MLF, les levures se multiplient avant et plus encore après FML. De même, les bactéries acéti- ques se développent mieux dans les vins après FML (figure 5).
3.4.3 Implantation des espèces d’altération, B. bruxellensis et bactéries acétiques, détectées dans les eaux de lavage
Dans le vin avant inoculation avec l’eau de lavage des barriques, la population de NS représente 60 % du nombre de LT, après inoculation avec les eaux de lavage qui contiennent 80 % de B. bruxellensis, la population de B. bruxellensis évaluée à partir du dénombrement de LT et de la proportion de B. bruxellensis identifiée par PCR-RFLP-ITS est de 3,7.102 UFC/mL. Dans le vin témoin non-inoculé, la popula- tion de B. bruxellensis est de 3,5.102 UFC/mL (tableau 3). Durant le suivi, la popula- tion de LT dans les deux modalités (vin non-filtré + eau stérile, vin non-filtré + eau de lavage) n’est pas significativement différente (figure 6). À la fin du suivi, B. bruxellen- sis est l’espèce majoritaire dans les deux vins. Au bout de 120 jours, les quantités de phénols volatils produites dans les deux modalités ne sont pas significativement différentes. Lorsque le vin est filtré, les B. bruxellensis apportées par les eaux de lavage se développent dans le vin mais après une phase conséquente de déclin et puis de latence. La population maximale atteinte est légèrement inférieure à 103 UFC/mL, alors que dans les vins non-filtrés celle-ci était supérieure à 104 UFC/
mL. À la fin du suivi, l’espèce B. bruxellensis est la seule espèce détectée dans le vin filtré et inoculé mais les quantités de phénols volatils produits sont nettement infé- rieures aux quantités mesurées dans les vins non-filtrés.
Une expérience similaire à celle réalisée pour l’étude des B. bruxellensis a été menée afin d’évaluer la contamination d’un vin avec des bactéries acétiques. Les BA sont dénombrées dans le vin témoin, le vin inoculé au 1/100 avec des eaux de lavage à la concentration de 3,2.103 UFC/mL en BA et dans le vin filtré puis inoculé au 1/100. L’acide acétique est mesuré dans les trois modalités après 70 jours de suivi. Les résultats obtenus sont analogues à ceux obtenus pour l’étude précédente.
Les populations de BA dans les vins non-filtrés présentent la même évolution et la concentration finale en acide acétique est de 0,77 ± 0,16 g/L dans le vin témoin et 0,80 ± 0,02 g/L dans le vin non-filtré et inoculé. Dans le vin filtré les BA apportées par les eaux de lavage également se développent et atteignent une population maxi- male semblable à celle obtenue dans les vins non-filtrés (environ 3.105 UFC/mL) et la quantité d’acide acétique dans le vin filtré est du même ordre (0,84 ± 0,13 g/L).
Vin avant FML
Vin avant FML : pH = 3,69 TAV (% v/v) = 12,88 Sucres résiduels (g/L) = 0,8 AT (g d’H2SO4) = 3,88 AV (g d’H2SO4) = 0,12 SO2 libre (mg/L) = 8 SO2 total (mg/L) = 44
Vin après FML : pH = 3,77 TAV = 12,88
Sucres résiduels (g/L) = 0,8 AT (g d’H2SO4) = 2,97 AV (g d’H2SO4) = 0,43 SO2 libre = 6 SO2 total = 44
BA
BL LT
UFC/mL
1E + 06 1E + 05 1E + 04 1E + 03 1E + 02 1E + 01 1E + 00
Vin après FML
BA
BL LT
UFC/mL
1E + 06 1E + 05 1E + 04 1E + 03 1E + 02 1E + 01 1E + 00
Figure 5
Populations de bactéries lactiques (BL), bactéries acétiques (BA) et de levures totales (LT) dans un vin filtré (0,22 µm) avant FML et dans le même vin filtré mais après FML, inoculés
avec de l’eau de lavage des barriques. Le dénombrement est réalisé après 30 jours.
Figure 5
Lactic acid bacteria (BL), acetic acid bacteria (BA) and total yeast (LT) populations in a filtered wine (0.22 µm) before MLF and in a filtered wine (0.22 µm) after MLF inoculated with barrels washing water. The counting was made after 30 days of culture.
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Tableau 3
Dénombrement et identification des levures et concentrations des phénols volatils lors de l’évaluation de contamination d’un vin en levures par des eaux de lavages de barriques.
Table 3
Yeast populations, species distribution (%) and volatiles phenols concentrations during the trials of wine contamination.
Vin de départ + eau
stérile Eau de lavage Vin filtré + eau
stérile Vin non-filtré + eau
de lavage Vin filtré + eau de lavage t = 0 t = 120 j t = 0 t = 120 j t = 0 t = 120 j t = 0 t = 120 j t = 0 t = 120 j Population de levures totales (UFC/
mL) 1,3 ± 0,5.103 2,1 ± 0,2.103 1,2 ± 0,2.102
Population de levures non-
Saccharomyces 0,8 ± 0,5.103 1,7 ± 0,8.103 1,2 ± 0,7.102 –
% des espèces de levures identifiées par PCR- RFLP-ITS
Saccharomyces
cerevisiae 25 % 10 % 20 % 0 % – – 20 % 10 % – –
Brettanomyces
bruxellensis 55 % 90 % 80 % 100 % – – 65 % 85 % 100 % 100 %
Candida stellata 10 % – – – – – 5 % – – –
Hanseniaspora uvarum 5 % – – – – – 0 % – – –
Zygosaccharomyces
baïli 5 % – – – – – 10 % 5 % – –
4-Ethyphénol (µg/L) 144 ± 12 440 ± 28 – – 144 ± 12 147 ± 17 144 ± 12 423 ± 28 144 ± 12 187 ± 22
4-Ethylgaïacol (µg/L) 16 ± 5 47 ± 17 – – 16 ± 5 17 ± 7 16 ± 5 47 ± 17 16 ± 5 26 ± 8
Jours
UFC/mL
1E+00 1E+01 1E+02 1E+03 1E+04 1E+05
0 20 40 60 80 100 120
Figure 6
Dynamique des populations de levures totales durant l’étude de contamination en levures d’un vin par des eaux de lavages des barriques. (∆ : vin filtré + °eau stérile, 앪 : vin filtré (0,2 µm) + eau de lavage, 앮 : vin non-filtré + eau de lavage, ◊ : vin non-filtré + eau stérile).
Le temps t = 0 correspond au premier point réalisé 6 heures après inoculation.
Figure 6
Total yeast populations during trials of yeast contamination by barrels washing water (∆: filtered wine (0.22 µm) + °sterile water, 앪: filtered wine (0.22 µm) + barrels washing
water, 앮: no-filtered wine + barrels washing water, ◊: no-filtered wine + sterile water).
The time t=0 is the first counting made 6 hours after the inoculation.
4 – DISCUSSION
Avant leur première utilisation, les barriques neuves contiennent une importante flore microbienne composée principalement de levures (environ 103 UFC/mL d’eau de lavage), majoritairement des basidiomycètes appartenant aux genres Cryptococ- cus, Rhodotorula et Bulleromyces et de bactéries à Gram négatif capables de se développer en absence d’oxygène (environ 2,5.104 UFC/mL), espèces proches des genres Shigella et Serratia. Des bactéries à Gram positif proches du genre Bacillus (bande VI), sont également détectées. Ces espèces ne sont pas des micro-organis- mes couramment rencontrés dans le vin, mais des espèces caractéristiques du bois (MUSSA et al., 2000) et elles sont fréquemment rencontrées à la surface des baies de raisins (RENOUF et al., 2005b). Pour la plupart, elles ne sont pas adaptées aux condi- tions de survie dans le vin (alcool, pH, composés phénoliques) et ne résistent pas à l’exposition prolongée avec le vin. Néanmoins, certaines levures : Cryptococcus sp.
et Bulleromyces sp. et certaines bactéries (Bacillus sp., Serratia sp.) demeurent à la surface des barriques après leur utilisation. Parmi ces espèces, certaines sont con- nues pour leur capacité à dégrader les composés glucosidiques du bois comme la cellulose. C’est notamment le cas des levures du genre Cryptococcus et des bacté- ries du genre Serratia (PREM et SRIPHATI, 2004). La libération de substrats glucosidi- ques du bois par ces micro-organismes, qui n’ont pas a priori d’importance œnologique, pourrait faciliter la survie des micro-organismes du vin en fin de fer- mentations.
Les bactéries Gluconobacter oxydans et Lactobacillus sp. qui sont détectées à la surface des bois neufs sont également présentes à la surface des barriques usa- gées. Leur résistance au vin est connue puisqu’elles sont couramment détectées dans le moût en fermentation (RENOUF et al., 2006b) et dans le vin fini (MILLET et al., 1995). Les principales espèces rencontrées dans le vin : S. cerevisiae, C. cantarelli et B. bruxellensis pour les levures, et O. oeni, P. parvulus et L. plantarum pour les bactéries lactiques ne sont jamais détectées à la surface du bois neuf, mais unique- ment dans les eaux de barriques ayant au préalable contenu du vin. Ces micro- organismes sont donc apportés par le vin logé dans la barrique, et plus particulière- ment par les lies qui sont très concentrées en micro-organismes (RENOUF et LON- VAUD-FUNEL, 2004). Ils adhèrent à la surface des barriques, comme cela peut être le cas à la surface des cuves inox (SWAFFIELD et al., 1997) mais ils peuvent également pénétrer dans le bois (FREDETTE, 1970). Dans ce cas, un simple rinçage des barri- ques n’est pas suffisant pour les extraire. Il est admis que le bois des barriques peut absorber l’équivalent de 5 à 6 litres de vin et donc accueillir les micro-organismes contenus dans ce volume (ABRISHAMI et al., 1994).
Les eaux de lavage des barriques ayant contenu du vin en FML contiennent une population non négligeable en O. oeni. Les souches du vin pendant la fermentation malolactique sont identiques à celles qui adhèrent à la surface du bois. Elles demeu- rent à la surface du bois plusieurs mois après la fin des fermentations, tandis que les populations résiduelles dans le vin ont significativement chuté à la suite du sulfitage.
Les essais de laboratoire montrent que ces bactéries sont capables de déclencher la FML dans un vin entonné dans des barriques ayant déjà été utilisées pour la FML.
Néanmoins, les populations microbiennes adhérées à la surface du bois des bar- riques ne sont pas suffisantes pour contaminer un vin nouveau, en cours d’élevage et déjà riche en micro-organismes. La charge microbienne se trouve dans un état d’équilibre et est stabilisée à la fois par les opérations œnotechniques (soutirage, sulfitage et ouillage) et par des interactions entre les différentes espèces microbien-
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nes. En effet, les essais d’implantation dans le vin des levures et des bactéries du bois sont positifs, uniquement dans un vin filtré dépourvu de sa propre charge microbienne. Les micro-organismes présents à la surface du bois et parfaitement adaptés au vin trouvent dans le vin filtré un écosystème totalement disponible et favorable à leur multiplication. Le fait que les levures, principalement l’espèce B. bruxellensis, s’implantent plus facilement dans un vin filtré après FML, confirme des précédentes observations selon lesquelles le vin après fermentation malolacti- que est plus favorable au développement des B. bruxellensis (RENOUF et al., 2005a ; 2005c).
Les souches de B. bruxellensis présentes dans le vin et celles qui sont détectées à la surface des barriques sont identiques. Mais, compte tenu de la proportion de vin par rapport au volume de bois, il est improbable que les B. bruxellensis présen- tes dans le bois suffisent à contaminer le vin, hormis lorsque celui-ci est dépourvu de charge microbienne intrinsèque car dans ce cas les B. bruxellensis du bois trou- vent un écosystème vacant favorable à leur développement. Concernant le dévelop- pement de B. bruxellensis, le vin après FML est plus favorable que le vin avant FML, il en est de même pour les bactéries acétiques, tandis que c’est le contraire pour les bactéries lactiques.
Les espèces résiduelles à la surface du bois des barriques restent une source réelle et non négligeable de micro-organismes parfaitement adaptés au vin et les efforts d’hygiène doivent être constants tout au long de l’élevage en barriques.
Outre le méchage des barriques, chaque soutirage est l’occasion de soustraire les micro-organismes qui ont sédimentés dans les lies (RENOUF et LONVAUD-FUNEL, 2004) mais aussi d’éliminer progressivement les micro-organismes qui ont pu adhé- rer à la surface du bois durant le contact avec le vin (SWAFFIELD et SCOTT, 1995).
Pour cela, le nettoyage des barriques à l’eau semble le moyen le plus approprié (SCMIDT, 1989) et le plus facile à mettre en œuvre par le vinificateur. Il est recom- mandé d’utiliser de l’eau chaude, sous pression et balayant l’ensemble de la surface intérieure de la barrique afin d’enlever un maximum de micro-organismes. Après le lavage il est important de laisser égoutter les barriques avec la bonde dessous afin d’éliminer totalement les eaux de lavage.
5 – CONCLUSION
L’élevage du vin en barriques est une étape capitale durant son élaboration. Les composés extraits du bois contribuent largement aux qualités organoleptiques du vin. D’un point du vue microbiologique, le bois des barriques est un milieu poreux, perméable à l’oxygène et riche en substrats carbonés. Les micro-organismes peu- vent donc s’y réfugier et y trouver de nouveaux nutriments. Le vinificateur s’effor- cera de réduire les populations microbiennes dans le vin au début de l’élevage afin de prévenir d’éventuelle contamination. Le bois des barriques neuves est une source importante de levures et de bactéries. Mais pour la majorité des cas, il s’agit d’espèces spécifiques du bois et qui ne résistent pas à l’exposition prolongée du vin. Lors des soutirages, dans les eaux de rinçage, il existe une flore microbienne légèrement plus diverse que dans le vin, car en plus des micro-organismes détectés dans le vin, il est possible de retrouver des micro-organismes du bois, notamment des levures appartenant au genre Cryptococcus. La détection des espèces S. cere- visiae et O. oeni est également fréquente, mais aussi celle des espèces d’altération
B. bruxellensis, P. parvulus, et G. oxydans. Les souches d’O. oeni et de B. bruxellen- sis que l’on détecte dans les eaux de lavage sont les mêmes que celles isolées du vin. Ces populations sont néanmoins insuffisantes pour contaminer un vin dont la charge microbienne intrinsèque est fortement tamponnée par les opérations œno- techniques et les interactions entre les espèces résiduelles durant la période d’éle- vage. Néanmoins, la surface du bois des barriques constitue un réservoir de micro- organismes à ne pas négliger lorsque l’on entonne du vin préalablement dépourvu de flore microbienne, comme cela peut être le cas après une filtration ou une flash pasteurisation. Dans ce cas les micro-organismes trouvent un écosystème vacant favorable à leur multiplication. Il est donc fondamental de soustraire au maximum les micro-organismes en lavant les barriques avec plusieurs eaux successives, chaudes de préférence et dirigées sur l’ensemble de la surface intérieure du bois de la barrique.
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