en fr

Texte intégral

(1)Régulation de l’excitabilité musculaire par le canal potassique EGL-23 et la voie de signalisation LIN-12/Notch chez le nématode C. elegans Sonia El Mouridi. To cite this version: Sonia El Mouridi. Régulation de l’excitabilité musculaire par le canal potassique EGL-23 et la voie de signalisation LIN-12/Notch chez le nématode C. elegans. Neurobiologie. Université de Lyon, 2018. Français. �NNT : 2018LYSE1199�. �tel-03081284�. HAL Id: tel-03081284 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03081284 Submitted on 18 Dec 2020. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) . N°d’ordre NNT : xxx. THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON opérée au sein de. l’Université Claude Bernard Lyon 1 Ecole Doctorale N° 340 Ecole Doctorale de Biologie Moléculaire, Intégrative et Cellulaire de Lyon Spécialité de doctorat :. Biologie cellulaire – Génétique - Neurobiologie Soutenue publiquement le 18/10/2018, par :. Sonia El Mouridi. Régulation de l’excitabilité musculaire par le canal potassique EGL-23 et la voie de signalisation LIN-12/Notch chez le nématode C. elegans. Devant le jury composé de : Bessereau Jean-Louis Jarriault Sophie Goaillard Jean-Marc Bichet Delphine Boulin Thomas. Pr DR CR DR CR. UCBL IGBMC UNIS UNS UCBL. Président Rapporteure Rapporteur Examinatrice Directeur de thèse.

(3) UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1 Président de l’Université. M. le Professeur Frédéric FLEURY. Président du Conseil Académique. M. le Professeur Hamda BEN HADID. Vice-président du Conseil d’Administration. M. le Professeur Didier REVEL. Vice-président du Conseil Formation et Vie Universitaire. M. le Professeur Philippe CHEVALIER. Vice-président de la Commission Recherche. M. Fabrice VALLÉE. Directrice Générale des Services. Mme Dominique MARCHAND. COMPOSANTES SANTE Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard. Directeur : M. le Professeur G.RODE. Faculté de Médecine et de Maïeutique Lyon Sud – Charles Mérieux. Directeur : Mme la Professeure C. BURILLON. Faculté d’Odontologie Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine. Directeur : M. le Professeur D. BOURGEOIS Directeur : Mme la Professeure C. VINCIGUERRA Directeur : M. X. PERROT Directeur : Mme la Professeure A-M. SCHOTT. COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE Faculté des Sciences et Technologies. Directeur : M. F. DE MARCHI. Département Biologie. Directeur : M. le Professeur F. THEVENARD. Département Chimie Biochimie. Directeur : Mme C. FELIX. Département GEP. Directeur : M. Hassan HAMMOURI. Département Informatique. Directeur : M. le Professeur S. AKKOUCHE. Département Mathématiques. Directeur : M. le Professeur G. TOMANOV. Département Mécanique. Directeur : M. le Professeur H. BEN HADID. Département Physique. Directeur : M. le Professeur J-C PLENET. UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives Directeur : M. Y.VANPOULLE Observatoire des Sciences de l’Univers de Lyon. Directeur : M. B. GUIDERDONI. Polytech Lyon. Directeur : M. le Professeur E.PERRIN. Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique. Directeur : M. G. PIGNAULT. Institut Universitaire de Technologie de Lyon 1. Directeur : M. le Professeur C. VITON. Ecole Supérieure du Professorat et de l’Education. Directeur : M. le Professeur A. MOUGNIOTTE. Institut de Science Financière et d'Assurances. Directeur : M. N. LEBOISNE.

(4) Remerciements Avant toute chose, je tiens à remercier Jean-Louis Bessereau, Delphine Bichet, Sophie Jarriault et Jean-Marc Goaillard de faire partie de mon jury et d’évaluer mon travail. Malgré mes vagues notions de génétique et biologie moléculaire quelqu’un m’a fait confiance et m’a permis d’en arriver là aujourd’hui. Je tiens tout particulièrement à te remercier Thomas pour m’avoir donné l’opportunité de travailler à tes côtés. Tu m’as formée et encadrée … Attendez, il y a quelque chose qui ne va pas. Je me suis laissée aller. Je reprends. Vous m’avez formée, encadrée et encouragée durant ces 3 années de thèse. Je vous remercie sincèrement pour tout ce que vous avez fait pour moi. Votre implication m’a poussé à en vouloir toujours plus et c’est grâce à vous que nous avons pu faire tout ce travail. Merci. A présent, je souhaiterais remercier l’ensemble des membres de l’équipe Boulin. Je vais débuter avec ma petite Alice LB. Tu as débuté sur mon projet comme stagiaire mais à la fin on était un vrai binôme. Ton acharnement au travail a fait qu’on allait toujours plus loin toujours plus vite mais avec une extrême rigueur. Je te remercie sincèrement pour ton aide et ton soutien. Bon, je ne vais pas dire que nous avons fait que travailler pendant tout ce temps et ce n’est pas Philou qui dira le contraire. Je ne sais pas si c’était une bonne idée de nous laisser tous les trois sans surveillance. En même temps, nous faisions de la science ;) Mélissa B : Je te remercie de m’avoir accueilli au sein de l’équipe comme tu l’as fait, avec beaucoup de bienveillance et gentillesse. Tu as été d’un grand soutien pour moi durant les moments difficiles, peu de gens m’ont aidé comme tu l’as fait à ce moment-là. MERCI ! Monsieur Tardy : Que dire ! On va fait cette thèse en parallèle et j’ai vraiment apprécié travailler à tes côtés. Je te remercie pour les discussions scientifiques, non scientifiques, pour ton aide à la procrastination, … J’en ai appris énormément sur moi grâce à tes séances de psychanalyse ☺ rien ne vaut un bon graphique si tu vois ce que je veux dire. En tout cas merci pour tout et bon courage pour la suite. Je souhaite également remercier tous les autres membres de l’équipe, avec qui ce fut un véritable plaisir de travailler : Olga (et le petit Lucas ou Sonio comme j’aime à l’appeler ☺), Ismaïl (et son petit Salim), le binôme Nora Z et Alice P, Caroline B, Soso lasticot, Marie G, Marine M et sans oublié Claire L. Je tiens également à remercier les membres de l’équipe Jacquemont/Allard qui ont été pendant 4 ans nos proches voisins. Un grand merci à Vincent J pour nos discussions du samedi et pour vos conseils. Merci aux membres de l’équipe : Candice K, Coline S, Clarisse F, Christine B et bien sûr Bruno A vos cours d’électrophy et physiologie musculaire resteront mémorables !.

(5) Je remercie à présent l’ensemble de l’équipe Bessereau : Maëlle J, Marine G, Océane R, Xin Z, Camille V, Aurore V, Florence S, Camilla L, Manuelle D, Laure G. Et non je ne t’ai pas oublié !!! Un grand grand merci Alexis. Je ne te remercie pas pour tes leçons sur la protection de l’environnement mais plutôt pour nos discussions et nos pauses (essentielles !). Enfin, je te remercie pour ton aide concernant ma recherche de post-doc. Tu m’as permis d’obtenir un post avant même la fin de ma thèse ce qui m’a allégé d’un poids énorme. Merci. Merci à tous les membres de l’équipe Gieseler. Plus particulièrement à Charlotte S, que je n’ai pas laissé dormir durant notre séjour à Los Angeles. Et ouiii, je t’avais prévenu ! Et merci à Ilhem T et Karima M. Je remercie également les autres membres de l’INMG et tous ceux que j’aurais oublié de citer. Je souhaite à présent remercier ma famille. Tout d’abord, je veux remercier mes parents, mon papinouch et ma Mi, sans qui rien n’aurait été possible. Merci pour leur soutien et leur compréhension. Je n’ai pas été très présente durant ces 3 années de thèse et vous avez toujours fait en sorte que je le vive bien. C’est bon Mi, je l’ai fait ☺ !!! Ensuite je souhaite remercier Nana, ma femme de ménage, cuisinière et pourvoyeuse de fonds ! Je remercie aussi Katia la plouc et ses histoires fantastiques qui m’ont permis de m’évader par procuration. Et Merci à toute la famille Kessal. Viens le tour de Gibus, Willy, Wafa, Ibtihel, Louinou, Jade Sonia, Amel,… Oulaaaaa mais ils sont combien dans la famille ?! Je m’arrête là, en tout cas vous avez tous assuré bsahtkoum ! Et pour finir ma Mélanouch. Un grand merci à ma coupinsh de toujours. De BourgoinJoyeux à Lyon, toujours ensemble et rien a changé. Merci pour ton aide, ton soutien et ta motivation. T’as eu ton bébé (Raphaël) et moi j’ai eu ma thèse ☺ tout ça la même année. Plus sérieusement, heureusement que tu étais là. Et sache que rien est fini, ça continue ….

(6) Table des matières : Table des figures : ...........................................................................................................................2 Résumé : ...........................................................................................................................................5 Abstract :...........................................................................................................................................6 Projets développés durant ma thèse ............................................................................................7. Introduction :..................................................................................................................................9 Partie I ..............................................................................................................................................9 Structure et physiologie des canaux K2P.....................................................................................9 I.. Les canaux potassiques et la genèse du potentiel de membrane ...................................9. II.. Structure des canaux potassiques ...................................................................................... 11 A. Architecture générale des canaux potassique K2P ...................................................... 11 B. Les six sous-familles de canaux K2P chez l’homme ...................................................... 13 C. Les K2P du nématode C. elegans ................................................................................... 13. III.. Quelles sont les localisations subcellulaires des K2P chez C. elegans ? .................. 17. IV.. Existe-t-il une redondance fonctionnelle des K2P ? .................................................... 18. V. Existe-t-il une régulation de l’expression des K2P commune ou spécifique à chaque K2P ? ............................................................................................................................................. 20 Cribles génétiques et régulations fonctionnelles des K2P chez C. elegans ........................ 21 I.. Principe des cribles génétiques chez C. elegans ............................................................. 21. II.. Caractérisations des K2P ayant des phénotypes gain de fonction chez C. elegans .. 25 A. Contrôle du trafic du canal potassique K2P UNC-58 par UNC-44/Ankyrin .............. 25 B. Résultats des cribles génétiques sur EGL-23 ................................................................ 26. III. A. B.. Le système de ponte de C. elegans ............................................................................... 29 Modulation du système de ponte par des indices sensoriels ..................................... 30 Description du phénomène de ponte............................................................................ 34. IV. A. B.. Le développement de la vulve par la voie de signalisation LIN-12/Notch ............... 40 Généralités sur la voie de signalisation LIN-12/Notch ................................................. 40 Développement de la vulve chez C. elegans ................................................................ 41. IV. Régulation de la spécification du destin cellulaire des muscles impliqués dans la ponte chez C. elegans par différents facteurs de transcription ............................................ 50. Partie II .......................................................................................................................................... 52 I.. Modification dirigée du génome de C. elegans ............................................................... 52. II.. Optimisation de la stratégie CRISPR/Cas9 chez C. elegans ............................................ 60. III.. Guide des bonnes pratiques ........................................................................................... 62.

(7) Résultats : ..................................................................................................................................... 67 Partie 1 : An extrinsic signal regulates intrinsic excitability of Caenorhabditis elegans muscle ............................................................................................................................................ 67 Partie 2: Mutation of a single conserved residue promotes gating of vertebrate and invertebrate two-pore domain potassium channels ............................................................... 68 Partie 3: Reliable CRISPR/Cas9 genome engineering in Caenorhabditis elegans using a single efficient sgRNA and an easily recognizable phenotype………………………………..69. Discussion : .................................................................................................................................. 70 I. Bilan des cribles génétiques d’egl-23 ..................................................................................... 71 II. Régulation des canaux exprimés dans les muscles de la vulve vm2 ................................. 73 III. Modulation de l’activité des K2P par l’insertion d’une mutation dans le résidu TM2.6 . 74 IV. egl-23 comme modèle d’étude des mutations pathogènes de la préséniline impliquées dans la maladie d’Alzheimer chez l’homme .............................................................................. 76 V. SEL-2/Neurobeachin est un régulateur négatif de la voie LIN-12/Notch et de l’expression d’EGL-23 dans les neurones .................................................................................. 80 VI. Comment est régulé egl-23 dans les neurones ? ............................................................... 87 VII. Efficacité et spécificité de l’ingénierie du génome par injection de Cas9 recombinante (collaboration avec la société Merck)......................................................................................... 88 VIII. Optimisation de l’utilisation de la Cas9 recombinante .................................................... 89 IX. Conversion d’un rapporteur fusion protéique en un « rapporteur co-traductionnel P2A »............................................................................................................................................... 93. Annexe: Liste des présentations et publications .................................................................... 96 Références : ................................................................................................................................. 98.

(8) Table des figures : Figure 1. Topologie et assemblage des trois familles de canaux potassiques. .......... 10 Figure 2. Illustration de la composition d’une sous-unité de canal potassique K2P. ...... 12 Figure 3. Les canaux K2P de C. elegans et de vertébrés ne partagent que peu d’homologie de séquence................................................................................................... 15 Figure 4. Résumé des données d’expression obtenues pour les 47 K2P de C. elegans……. .......................................................................................................................... 16 Figure 5. Six canaux K2P de C. elegans possédant 6 distributions subcellulaires distinctes dans les muscles striés squelettiques................................................................................. 17 Figure 6. Localisation subcellulaire de deux K2P de C. elegans.. ..................................... 18 Figure 7. Différents stades embryonnaires chez C. elegans. ............................................. 19 Figure 8. Photos des embryons fraichement pondus par des vers sauvages et des vers mutants perte de fonction d’egl-23. ................................................................................... 19 Figure 9. Représentation schématique des facteurs régulant la fonction des K2P. ........ 20 Figure 10. Stratégie des cribles génétiques suppresseurs de gains de fonction réalisés sur les K2P. ............................................................................................................................. 21 Figure 11. Détail du croisement réalisé avant envoi des échantillons pour le reséquençage complet du génome. .................................................................................. 24 Figure 12. Représentation de la stratégie utilisée afin d’identifier la mutation causale lors de l’analyse du WGS. ............................................................................................................ 25 Figure 13. Représentation du crible suppresseur egl-23(n601). ..................................... 26 Figure 14. Principe du crible visuel basé sur l’observation directe du canal egl-23. .... 27 Figure 15. Résultats des cribles réalisés pour le gène egl-23. La majorité des mutants suppresseurs sont des mutants perte de fonction d’egl-23. ........................................... 28 Figure 16. Rythmicité de la ponte qui a lieu durant le déplacement des vers. .............. 29 Figure 17. Les hermaphrodites egl-10 ont un système de ponte défectueux. .............. 30 Figure 18. Inhibition de la ponte en réponse aux vibrations requière la fonction des neurones mécanosensorielles............................................................................................. 30 Figure 19. Effets de la sérotonine et de l’octopamine sur la ponte. ................................ 31 Figure 20. Progéniture produite par des animaux sauvages après différentes périodes sans nourriture....................................................................................................................... 31 Figure 21. Le phénomène de ponte des mutants egl-4 est insensible à la présence ou non de nourriture. ................................................................................................................. 32 Figure 22. Mutations modulant de l’activité du canal EGL-23.......................................... 33 Figure 23. Nombre d’œufs retenus dans l’utérus des vers des mutants constitutif « dauer » et des mutants daf-5. ........................................................................................... 34 Figure 24. Schéma représentatif du système de ponte chez C. elegans. ....................... 34 Figure 25. Modèle de la régulation de la contraction conduisant aux différentes contractions des muscles impliqués dans la ponte. ......................................................... 35 Figure 26. Représentation schématique du système de ponte chez C. elegans. .......... 35 Figure 27. Différente contraction des muscles de la vulve. .............................................. 36 Figure 28. Photos représentatives des mutants de ponte hyper-actifs présentant des défauts morphologiques aux niveau des neurones VC. .................................................. 39 Figure 29. Composants clefs de la voie de signalisation LIN-12/Notch. ........................ 40. 2.

(9) Représentation schématique de la voie de signalisation LIN-12/Notch. ..... 41 Figure 30. Figure 31. Lignage mésodermale post-embryonique des hermaphrodites sauvages chez C. elegans. .................................................................................................................... 42 Figure 32. Bright-field photomicrographs des hermaphrodites mutants pour le gène lin12……….. ............................................................................................................................... 43 Figure 33. Transformation du destin cellulaire dans la gonade des cellules Z1.aaa et Z4.ppp chez les hermaphrodites. ....................................................................................... 44 Figure 34. Développement de la vulve d’hermaphrodite de type sauvage et système d'expression hétérologue utilisé. ....................................................................................... 45 Figure 35. Absence des bras musculaires dans les vm2 des mutants lin-12(wy750), apx1(wy755) et sel-12(wy760). .................................................................................................. 46 Figure 36. Les mutants ayant une absence de bras musculaire dans les vm2 présentent des défauts de ponte. .......................................................................................................... 46 Figure 37. Nécessité temporelle de lin-12 pour la formation des bras musculaires..... 47 Figure 38. La perte de fonction sel-2 améliore l’activité lin-12(d) dans les VPC.. .......... 48 Figure 39. Analyse de la séquence sel-2. ............................................................................ 49 Figure 40 La perte de mls-1 entraîne la transformation des muscles utérins en muscles de la vulve. . ........................................................................................................................... 50 Figure 41 Les muscles utérins et muscles de la vulve de type II sont convertis en muscles de la vulve de type II dans les mutants unc-62(ku234)… ................................................. 51 Figure 42 La voie de signalisation LIN-12/Notch est requise pour la spécification du destin des muscles de la vulve de type II. .......................................................................... 51 Figure 43. Représentation schématique des deux voies de réparation de l’ADN après induction d’une cassure de l’ADN double brin................................................................. 52 Figure 44. Conversion génique par l’utilisation de transgène chez C. elegans. ........... 54 Figure 45. Représentation schématique de la matrice de reparation utilisée dans la stratégie MosTIC afin d’insérer une mutation”M” dans le génome. ……………………54 Figure 46. Représentation schématique d’une nucléase à doigts de zinc se liant à l’ADN…… ............................................................................................................................... 55 Figure 47. Représentation schématique d’un dimère de nucléases TALE (TALEN) se fixant à l’ADN. ........................................................................................................................ 56 Figure 48. Représentation schématique de la stratégie de ligation par le système de clonage Golden Gate pour générer une protéine TALEN artificiel. .............................. 56 Figure 49. Représentation schématique de la construction d’un TALEN par la stratégie de ligation successive. .......................................................................................................... 57 Figure 50. Schéma représentatif de l’immunité adaptative chez la bactérie. ................ 58 Figure 51 : Représentation schématique du système CRISPR/Cas9...................................... 59 Figure 52 : Modification dirigée du génome par le système CRISPR/Cas9. Séquence des indels trouvés dans les mutants perte de fonction générés……………. ....................... 60 Figure 53. Modèle représentant l’activité des sgRNA. ...................................................... 61 Figure 54. Une conception de l'ARN guide qui donne des fréquences reproductibles élevées de la mutagenèse dirigée par Cas9. .................................................................... 61 Figure 55. Efficacité d’insertion de 3XFLAG avec des bras d’homologie court (30 pb) en fonction de la distance de la coupure par la Cas9.. ......................................................... 63 Figure 56. Effet de la longueur des bras d’homologie sur la fréquence d’insertion de la GFP à partir d’un fragment de PCR.. .................................................................................. 64. 3.

(10) Efficacité de la réparation avec un fragment d’ADN simple brin en fonction Figure 57. du sens de ce brin. ................................................................................................................ 65 Figure 58. Bilan des cribles génétiques d’egl-23.. ............................................................ 71 Figure 59. Liste des gènes impliqués dans la voie de signalisation LIN-12/Notch et leurs orthologues chez la Drosophile et les mammifères. ........................................................ 72 Figure 60. Localisation subcellulaire de twk-24.. ............................................................... 74 Figure 61. Localisation subcellulaire du canal TWK-20. Image représentative de la localisation du canal K2P TWK-20 fusionné à la protéine fluorescente wrmScarlet dans son contexte natif. ................................................................................................................. 75 Figure 62. Représentation de la séquence protéique de la préséniline humaine PSEN1 associée à la pathogénicité de chaque acide aminé. ...................................................... 76 Figure 63. sel-12 régule l’expression d’egl-23. .................................................................. 77 Figure 64. Alignement des séquences protéiques de SEL-12 de C. elegans, PSEN1 et PSEN2 chez l’homme............................................................................................................ 79 Figure 65. Représentation des domaines protéiques conservé de la neurobeachin et ses orthologues. .......................................................................................................................... 80 Figure 66. Les mutants issus du crible présentent une forte réduction de l’expression d’egl-23 dans 4 neurones. ................................................................................................... 81 Figure 67. Localisation des allèles identifiés dans le crible visuel d’egl-23.. ................. 81 Figure 68. Sauvetage du phénotype par injection de fosmide dans les mutants sel-2…………. ........................................................................................................................ 82 Figure 69. Caractérisation de la distribution des canaux ELG-23 dans les mutant sel-2…………….. ................................................................................................................... 83 Figure 70. Représentation schématique de la régulation de la voie de signalisation LIN-12/Notch par sel-2. ........................................................................................................ 83 Figure 71. Représentation de l’expression de sel-2 chez C. elegans. ............................. 84 Figure 72. sel-2 est exprimé dans les muscles du pharynx et des neurones au niveau de l’anneau nerveux. .................................................................................................................. 85 Figure 73. sel-2 ne régule pas l’expression de twk-28 et unc-58. .................................... 85 Figure 74. Localisation et identification des mutants DIG-1 identifié dans le crible visuel d’egl-23. ............................................................................................................................... 87 Figure 75. Comparaison de la spécificité et efficacité des Cas9 protéiques et plasmidique. .......................................................................................................................... 89 Figure 76. Détermination de la concentration optimale de Cas9 recombinante. ......... 91 Figure 77. Efficacité de l’édition du génome en fonction des différentes matrices de réparation.. ............................................................................................................................. 92 Figure 78. Les peptides viraux 2A permettent la production efficace de deux polypeptides indépendants dans différents tissus. .......................................................... 93 Figure 79. Représentation des différentes expressions d’egl-23. ................................... 94. 4.

(11) Résumé : Les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) sont des régulateurs principaux de l’excitabilité cellulaire car ils jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules animales. Malgré leur rôle fondamental, peu d’informations sont connues sur les processus cellulaires qui contrôlent la fonction des canaux K2P in vivo. En particulier, nous ne connaissons que quelques facteurs qui contrôlent directement le nombre, l’activité et la localisation des K2P à la surface des cellules. Durant ma thèse, j’ai utilisé des stratégies d’ingénieries du génome que j’ai associé à des approches génétiques afin de caractériser le canal potassique EGL-23. Pour cela, j’ai réalisé un crible suppresseur du phénotype de défaut de ponte du mutant egl-23(n601) et un crible visuel sur le rapporteur fluorescent traductionnel egl-23::TagRFP-T. Grâce au reséquençage complet du génome, j’ai pu cloner 4 gènes impliqués dans la régulation du canal EGL-23. Trois gènes identifiés font partie de la voie de signalisation Notch : (1) apx-1/DSL un ligand de, (2) lin-12/Notch son récepteur et (3) sel-12/présénilin la γ-sécrétase qui clive LIN-12 pour activer la cascade transcriptionnelle en aval. J’ai également trouvé deux allèles de la protéine à multidomaine sel-2/Neurobeachin (Nbea), un régulateur négatif de la voie Notch. Durant ma thèse, j’ai démontré que (1) la voie de signalisation LIN-12/Notch régule de façon directe et spécifique l’expression du canal egl-23 dans les muscles de la vulve vm2 ; (2) sel-2/Nbea régule le nombre de canaux EGL-23 dans les neurones ; (3) la préséniline SEL12 peut servir de modèle pour évaluer la pathogénicité des variants humains de la préséniline, révélant ainsi des mutations pouvant contribuer au développement de la maladie d’Alzheimer.. 5.

(12) Abstract : Two-pore domain potassium channels (K2P) are major regulators of cell excitability, playing a central role in the establishment and maintenance of the resting potential of animal cells. Despite their fundamental role, little is known about the cellular processes that control K2P channels function in vivo. In particular, we know only few factors that directly control the number, activity, and localization of K2P on the cell surface. During my thesis, I used state-of-the art genome engineering technologies combined with genetic approaches to characterize the C. elegans potassium channel EGL-23. For this, I realized a phenotypic suppressor screen of the egg-laying defective mutant egl-23(n601) and a visual screen on an egl-23 translational fluorescent reporter. Using whole genome sequencing, I was able to clone for new genes involved in EGL-23 regulation. Interestingly, three of these four genes identified are all part of the LIN-12/Notch signaling pathway: (1) apx-1/DSL, a ligand of, (2) lin-12/Notch, its receptor and (3) sel-12/presenilin, a γ-secretase which cleaves LIN-12 to activate Notch-dependent gene transcription. I also found 2 alleles of sel-2/Neurobeachin (Nbea), a multidomain protein, that is a negative regulator of LIN-12/Notch. During my thesis, I demonstrated that (1) the LIN-12/Notch signaling pathway directly and specifically regulates the expression of the egl-23 gene in vm2 vulval muscles; (2) that sel-2 /Nbea regulates the number of EGL-23 in neurons; (3) that SEL-12 can be used as a model system to evaluate the pathogenicity of human presenilin variants, thus revealing mutations that may contribute to the development of Alzheimer's disease.. 6.

(13) Projets développés durant ma thèse Projet 1 : Mise au point d’une technique permettant la modification dirigée du génome de façon simple et efficace grâce au système CRISPR/Cas9. (El Mouridi et al., 2017) L’objectif principal de ma thèse était la caractérisation fonctionnelle du canal potassique K2P EGL-23. Or, la seule donnée disponible sur ce canal était l’existence du gain de fonction egl-23(n601). De fait, la génération d’outils était indispensable pour approfondir l’étude de ce canal comme la génération d’un rapporteur transcriptionnel pour déterminer le patron d’expression ou d’un rapporteur traductionnel afin d’analyser sa localisation subcellulaire. L’établissement de tous ces outils nécessite une stratégie efficace permettant la modification du génome de façon dirigée. Cependant, au début de ma thèse, les techniques décrites étaient peu efficaces et laborieuses. C’est pourquoi nous avons décidé de mettre au point une stratégie simple et efficace basée sur l’utilisation du système CIRSPR/Cas9 pour générer nos différents mutants. La technique que nous avons développée nécessite deux étapes : 1- Introduire au locus d’intérêt le protospacer dpy-10 qui est hautement efficace. 2- Utiliser le sgRNA dpy-10 afin d’introduire la mutation désirée : mutation ponctuelle, fragments ADN ou protéines fluorescentes ou même générer des délétions.. Projet 2 : Génération de mutants gains de fonction grâce à la mutation d’un résidu conservé permettant l’augmentation de l’activité des canaux potassiques à deux domaines pore. (Ben Soussia*, El Mouridi* et al., en revue) Afin de mieux comprendre et analyser la biologie des K2P, nous utilisons une stratégie basée sur des cribles génétiques qui reposent sur l’utilisation de mutations gains de fonction. Or chez C. elegans, sur les 47 K2P, il n’existe que quatre canaux ayant des mutants gains de fonction décrits : unc-58, twk-18, sup-9 et egl-23. Afin de ne pas être limité dans le choix des canaux à étudier, nous avons mis au point une stratégie permettant l’augmentation de l’activité de ces canaux conduisant à des phénotypes gains de fonction. Sachant que les K2P permettent l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules, en augmentant l’activité de ces canaux, nous modifions l’état d’excitabilité des cellules. Ainsi, une activité accrue des K2P conduit à une sortie de potassium dans les cellules exprimant le gène concerné ce qui engendre une forte hyperpolarisation des cellules. Cette hyperpolarisation va rendre les cellules moins excitables ce qui conduira à un phénotype gain de fonction qui donnera aux vers un comportement particulier comme une paralysie ou une incapacité à pondre ses œufs par exemples. Nous avons donc mis en évidence le rôle d’un résidu (TM2.6), localisé dans le deuxième domaine transmembranaire, dans la régulation de l’activité des K2P. Les insertions de différentes mutations ont permis de générer des mutants gains de fonction semblables aux. 7.

(14) mutants canoniques connus (twk-18, unc-58, egl-23, sup-9) mais aussi de générer de nouveaux mutants d’autres canaux K2P. La génération de ces mutants permet d’ouvrir la voie à de nouvelles études qui permettront d’identifier de nouvelles fonctions et régulations des K2P.. Projet 3 : Caractérisation fonctionnelle du canal potassique à deux domaines P EGL-23. (El Mouridi et al., en préparation) Grâce à notre nouvelle stratégie CRISPR/Cas9, j’ai pu générer des rapporteurs qui m’ont permis de déterminer le patron d’expression et la localisation subcellulaire du canal EGL23. Afin de comprendre comment ce canal était régulé, j’ai effectué deux cribles génétiques. Le premier était un crible suppresseur du mutant gain de fonction egl-23(n601). 32 mutants ont été isolés dont 28 intragéniques et 4 extragéniques. Cette proportion de suppresseurs intragéniques révèle que le meilleur moyen de restaurer l’état excitabilité des cellules à des valeurs normales est de muter le canal EGL-23 lui-même. Ce crible étant biaisé, j’ai effectué un deuxième crible basé cette fois-ci sur la visualisation directe du canal in vivo en utilisant le rapporteur egl-23::tagRFP-T. Ce crible m’a permis d’identifier 5 mutants dont seulement 1 était intragénique. Grâce à l’association de techniques de cartographie génétique et de reséquençage complet du génome, j’ai pu cloner 3 nouveaux gènes impliqués dans la régulation de l’expression du canal EGL-23. Les trois gènes qui ont été identifiés font tous partie de la voie de signalisation LIN-12/Notch : (1) apx-1/DSL qui est un ligand, (2) lin-12/Notch qui est le récepteur et (3) sel-12/préséniline, qui est une γ-sécrétase qui, après fixation du ligand, va cliver le récepteur pour permettre la translocation dans le noyau de la partie cytoplasmique du récepteur et ainsi induire la transcription des gènes cibles. J’ai ensuite mis en évidence le rôle de la voie LIN-12/Notch dans le contrôle de l’excitabilité musculaire par la régulation du canal EGL-23 chez C. elegans.. Projet 4 : Les différentes collaborations. Durant ma thèse, j’ai eu l’opportunité de faire deux collaborations dont les résultats feront partis de publications qui sont en cours d’écriture. Je n’ai pas inclus ces résultats dans ce manuscrit. 1- Equipe du Dr. Mei Zhen (Canada) : J’ai généré plusieurs rapporteurs et un nouveau mutant gain de fonction non caractérisé qui leur a permis d’effectuer un crible génétique suppresseur. 2- Equipe du Dr. Christian Braendle (France) : J’ai généré un rapporteur traductionnel afin d’établir le patron d’expression du gène et j’ai effectué des expériences afin de mettre en évidence les tissus impliqués dans le phénotype gain de fonction du canal qu’ils étudient. J’ai également fait des tests d’efficacité et de spécificité sur des nouvelles Cas9 recombinantes pour le groupe Merck.. 8.

(15) Partie I Structure et physiologie des canaux K2P I. Les canaux potassiques et la genèse du potentiel de membrane Les canaux potassiques sont des complexes protéiques qui permettent la diffusion passive et sélective des ions potassium (K+) au travers de la membrane plasmique. La conductance membranaire ionique de repos étant majoritairement potassique dans toutes les cellules animales, le potentiel de membrane de repos se fixe ainsi à des valeurs proches des valeurs du potentiel d’équilibre du potassium (EK). Etant donné que dans les conditions physiologiques les concentrations de K+ est de l’ordre de 150 mM à l’intérieur des cellules et de quelques mM à l’extérieur, le potentiel d’équilibre pour le potassium, calculé à l’aide de l’équation de Nernst, EX= (RT/zF) (ln([X]out/[X]in)), à une valeur l’ordre de -100 mV. Dans ces conditions, le potentiel de repos des cellules s’établit généralement entre -60 à -90 mV. Dans le génome de l’homme et de C. elegans, les canaux potassiques représentent la plus grande famille de canaux ioniques avec respectivement 81 et 72 canaux. Enfin, il existe trois grandes classes de canaux répartis selon leurs organisations structurales (Figure 1) et leurs propriétés biophysiques : Les canaux dépendants du potentiel o (Kv; « voltage-dependent potassium channel ») Les canaux à rectification entrante o (Kir; « inwardly rectifying potassium channel ») Les canaux potassiques à deux domaines pore o (K2P; « two-pore domain potassium channel »). 9.

(16) Figure 1. Topologie et assemblage des trois familles de canaux potassiques. Partie supérieure : les canaux potassiques sont organisés en fonction du nombre de domaines transmembranaires. Partie inférieure : structure cristallographique des canaux potassiques assemblés : les sous-unités sont alternativement représentées en bleu ou en rouge. Références Protéine Data bank : 2A79 pour Kv, 2QKS pour Kir, 4XDK pour K2P. Figure de Philippe Tardy.. a) Les canaux dépendants du potentiel (Kv) Au repos, les canaux dépendants du potentiel ont une probabilité d’ouverture qui est proche de zéro. Ce n’est que lorsque le potentiel de membrane de la cellule dépasse une certaine valeur de dépolarisation (le seuil d’activation) que la probabilité d’ouverture de ces canaux va augmenter. Les valeurs de dépolarisation déclenchant l’ouverture des canaux étant supérieures à EK, l’ouverture de ces canaux provoque une sortie de K+ qui contribue à hyperpolariser la cellule. Les Kv jouent principalement un rôle dans la phase de repolarisation des potentiels d’actions, étant donné que ces canaux s’ouvrent plus tardivement que les canaux responsables de la dépolarisation (canaux sodiques ou calciques voltage-dépendants). Dans ces conditions, les Kv interviennent majoritairement dans le contrôle de l’amplitude, la durée et la fréquence des potentiels d’actions. Il existe dans le génome de l’homme 50 gènes codant des sous-unités de canaux Kv contre 22 chez C. elegans. Les Kv sont composés de sous-unités possédant six domaines transmembranaires et sont fonctionnels sous forme de tétramères (Figure 1).. 10.

(17) b) Les canaux à rectification entrante (Kir) La conformation des canaux Kir est indépendante du potentiel de membrane de la cellule. En effet, ces canaux ne possèdent pas de senseur de potentiel. Les Kir sont régulés par des facteurs extracellulaires comme les variations de pH ou la concentration en K+, et par des facteurs intracellulaires tels que les polyamines, le magnésium, l’ATP ou les protéines G (Kurata et al., 2004; Lopatin et al., 1994; Loussouarn, 2005). Les Kir sont dits à rectification entrante car ces canaux conduisent plus efficacement les ions K+ dans le sens entrant lorsque Em<EK que dans le sens sortant lorsque Em>EK. Malgré leur rectification entrante, la capacité des canaux Kir à laisser sortir du potassium lorsque Em est supérieur et proche de EK leur permet de participer très efficacement à l’établissement et au maintien du potentiel de repos des cellules. Dans le génome de l’homme, il existe 16 Kir contre 3 chez C. elegans. Les Kir sont composés de sous-unités possédant deux domaines transmembranaires et sont fonctionnels sous forme de tétramères (Figure 1). c) Les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) Les K2P sont ouverts quel que soit le potentiel de membrane et jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules. Il existe de nombreux facteurs régulant les K2P comme la température, les interactions avec les lipides, la sensibilité au pH (Sandoz et al., 2006) et aux tensions mécaniques (Chemin et al., 2005) mais il existe peu de données concernant la biologie cellulaire de ces canaux. Il existe dans le génome de l’homme 15 K2P contre 47 chez C. elegans. Les sous-unités de K2P sont composées de quatre domaines transmembranaires et sont actifs sous forme de dimères (Figure 1). II. Structure des canaux potassiques La structure cristallographique du canal potassique bactérien KcsA (Doyle et al., 1998) était la première structure disponible dans les années 2000. L’obtention de cette structure a permis de visualiser pour la première fois l’architecture tridimensionnelle du canal et de comprendre les bases moléculaires de ses caractéristiques biophysiques, notamment sa sélectivité pour les ions potassium. Depuis, de nombreuses structures cristallographiques sont disponibles et référencées dans la base de données « Protein Data Bank ». Ces structures associées aux données fonctionnelles des canaux ont permis une grande avancée dans la compréhension des mécanismes de régulations des canaux.. . #%%&##$&(!%$$"&$ 4 En 1996, Florian Lesage a cloné le premier K2P humain, TWIK-1, dont la structure cristallographique a été réalisée en 2012 (Miller & Long, 2012).. 11.

(18) L’organisation des canaux K2P est définiÒ par (Figure 2): Les hélices internes M2 et M4 (« inner helices ») : Les parois internes du pore sont composées d’hélices α transmembranaires. La boucle P (« P-loop ») : Les hélices internes et externes sont reliées par cette boucle P qui contient le filtre de sélectivité. Cette « P-loop » est composée : o D’une cap qui s’organise en deux hélices α extracellulaires o De l’hélice du pore qui est situé à l’arrière du pore et est composée d’une courte hélice α. Cette hélice joue un rôle dans la stabilisation du filtre. o Du filtre de sélectivité qui confère au canal sa sélectivité au potassium grâce au motif T-X-G-Y/F-G. Les hélices externes M1 et M3 (« outer helices ») : La stabilité du pore est assurée par la présence de ces hélices qui sont composées d’hélices α transmembranaires et qui sont en contact avec les hélices internes et les hélices P.. Figure 2. Illustration de la composition d’une sous-unité de canal potassique K2P. AReprésentation des 4 domaines transmembranaires d’une sous-unité de K2P (M1-4), de deux régions pore (P1 et P2). B- Illustration de l’arrangement 3D de la sous-unité du K2P. Les hélices internes M1, M3 sont relié aux hélices externes M2, M4 par la boucle P extracellulaire. La boucle orange représente la cap et l’hélice du pore est représentée en vert. Les ions K+ sont représentés en rouge et traversent le pore grâce au filtre de sélectivité composé de la signature du K+.. 12.

(19) . $$($&$1$&( 4 */ La famille des canaux potassiques à deux domaines pore est la dernière famille de canaux potassiques à avoir été découverte. Dans le génome de l’homme, il existe 15 sous-unités de K2P qui ont été caractérisées et classées en 6 sous-familles en fonction de leur homologie de séquence, leur régulation et leurs propriétés électrophysiologiques. TWIK (« Tandem of P domain in a weakly inward rectifying K+ channel»): TWIK-1; TWIK-2; TWIK-3 TREK (“TWIK Related K+ channel”): TREK-1; TREK-2; TRAAK TASK (“TWIK-related Acid-Sensitive K+ channel”): TASK-1; TASK-3; TASK-5 TALK (“TWIK-related ALkalin pH activated K+ channel”): TASK-2; TALK-1; TALK-2 THIK (“Tandem pore domain Halothane inhibited K+ channel”): THIK-1; THIK-2 TRESK (“TWIK-Related Spinal cord K+ channel”): TRESK. . $ 4 &% Alors que tous les canaux K2P partagent la même structure (4 domaines transmembranaires, filtre de sélectivité, 2 domaines P, parties intracellulaires N- et Cterminales), leurs séquences d'acides aminés primaires ont divergé de manière marquée. Les 15 canaux K2P des vertébrés ont été classés en 6 familles en fonction de leurs séquences d'acides aminés et de leurs propriétés fonctionnelles. Les membres appartenant à une classe donnée partagent des niveaux élevés d'homologie, mais pas ceux de classes différentes (Figure 3). La variation de la séquence est encore plus frappante pour les canaux K2P de C. elegans. Au sein des 47 gènes codant des sous-unités de canaux potassiques à deux domaines pore de C. elegans, la conservation des séquences est généralement faible, sauf pour les paralogues proches. Seuls cinq K2P de C. elegans présentent une identité de séquence significative avec les canaux vertébrés. SUP-9 et TWK-20 sont les plus similaires à TASK1 / 3 / 5, TWK-14 est un orthologue clair de THIK1 / 2, et TWK-46 et TWK-48 ressemblent à TWIK1 / 2 et TRESK, respectivement. Pour la plupart des autres canaux K2P de nématodes, en moyenne 25% des acides aminés sont identiques au canal vertébré le plus proche, même lorsque seule la « partie centrale » du canal (du premier au quatrième segment transmembranaire) est prise en compte et les régions cytoplasmiques N- et Cterminales sont omises. Pour quelques canaux K2P de C. elegans, la conservation des séquences avec les canaux vertébrés est encore plus faible, allant de 16 à 25% (TWK-6, TWK-29, TWK-32, TWK-47).. 13.

(20) Figure 3. (Page suivante) Les canaux K2P de C. elegans et de vertébrés ne partagent que peu d’homologie de séquence. Matrice d’identité de séquence des K2P de vertébrés et de C. elegans 1 pour 1 basé sur les alignements de clustal omega. Avant alignement, les parties intracellulaires N et C terminale ont été tronquées. Tiré de Ben Soussia et al., en revue.. 14.

(21) 15.

(22) La différence de quantité dans le nombre de K2P présent dans le génome de C. elegans comparé à ceux présents chez l’homme reste inexpliquée et pose plusieurs questions à savoir si ces canaux ont conservé les mêmes fonctions au cours de l’évolution, ainsi que des mécanismes de régulations et expressions identiques. Pour répondre à ces questions et ainsi comprendre les mécanismes de régulation, d’expression et d’activité de ces canaux nous avons utilisé plusieurs approches dans l’équipe. Sachant que peu de données étaient disponibles dans la littérature concernant les K2P de C. elegans, la première étape était d’analyser le patron d’expression de tous les canaux afin de déterminer si tous les K2P étaient exprimés dans l’ensemble des tissus ou s’il existait des répartitions spécifiques. Ainsi, grâce à une stratégie basée sur l’utilisation de PCR fusion (fragment de promoteur fusionné à une protéine fluorescente) associée à une recherche bibliographique, nous avons pu établir un premier atlas des K2P de C. elegans (Figure 4).. Figure 4. Résumé des données d’expression obtenues pour les 47 K2P de C. elegans.. D’après ces données, chez C. elegans tous les tissus expriment des K2P, que ce soit des cellules excitables (muscles et neurones) ou des cellules non excitables (intestin). Cependant, tous les K2P ne sont pas exprimés dans tous les tissus. Il y a des K2P exprimés dans un seul type de cellule comme twk-18 qui est strictement exprimé dans les muscles squelettiques ou des K2P qui sont plus largement exprimés comme sup-9, unc-58 ou egl-23 qui sont exprimés à la fois dans les muscles et dans plusieurs neurones. Si nous considérons les tissus cette fois-ci, nous observons qu’il existe des tissus qui n’expriment qu’un seul K2P comme l’intestin où n’est exprimé que twk-26. En revanche, dans les muscles, un certain nombre de K2P sont co-exprimés dans ce tissu. En effet, sup-9,. 16.

(23) unc-58, twk-8, twk-12, twk-18, twk-20, twk-24, twk-28, twk-31 et twk-42 sont tous exprimés dans les muscles. Plusieurs questions se posent à présent : 1) Quelle est la localisation subcellulaire des K2P, en particulier pour ceux exprimés dans les mêmes cellules ? 2) Existe-t-il une redondance fonctionnelle de ces canaux ? 3) Par quels mécanismes ces canaux sont-ils régulés ? 4) Existe-t-il une régulation commune à l’ensemble des K2P ou une régulation spécifique à chaque K2P ?. III. Quelles sont les localisations subcellulaires des K2P chez C. elegans ? Afin de répondre à cette question, nous avons généré par CRISPR/Cas9 des rapporteurs traductionnels afin de déterminer la localisation subcellulaire des K2P. La stratégie utilisée pour générer ces rapporteurs fusions est celle décrite dans notre papier méthode (El Mouridi et al., 2017a) dans lequel nous avons mis en place une façon simple et rapide de marquer des gènes avec une protéine fluorescente afin d’observer in vivo la localisation des canaux.. Figure 5. Six canaux K2P de C. elegans possédant 6 distributions subcellulaires distinctes dans les muscles striés squelettiques. Image représentative de la distribution musculaire de chaque canal K2P fusionnée à des protéines fluorescentes, inséré au site endogène par knock-in.. 17.

(24) De façon intéressante, nous pouvons constater sur la Figure 5 que les six K2P analysés ont tous des distributions différentes. TWK-28 est localisé à la pointe antérieure des cellules musculaires. UNC-58 est diffus à la membrane des cellules musculaires. TWK-31 ne semble pas présent à la surface des cellules musculaires. Ce canal semble être localisé de façon intracellulaire et de façon ponctiforme. Enfin, les K2P TWK-18, SUP-9 et TWK-24 s ‘organisent à la membrane selon des motifs distincts réguliers autour de structure qui pourraient correspondre à des « dense bodies ». La différence de localisation de ces canaux suggère (1) que ses canaux ne s’hétérodimérisent pas entre eux ; (2) qu’ils sont régulés par des mécanismes différents.. IV. Existe-t-il une redondance fonctionnelle des K2P ? En se basant sur l’atlas des K2P (Figure 4) et des knock-in que nous avons généré (Figure 5), nous avons constaté qu’il existait des K2P qui étaient co-exprimés dans un même tissu. Cela suggère qu’une certaine redondance dans la fonction des canaux pourrait être envisageable. De plus, dans la littérature, aucun phénotype perte de fonction n’a été mis en évidence auparavant. Or, durant ma thèse j’ai identifié un phénotype perte de fonction pour le gène que j’ai étudié, à savoir egl-23.. Figure 6. Localisation subcellulaire de deux K2P de C. elegans. A- Le canal egl-23 est exprimé dans les muscles de la vulve vm2 et les neurones VC4-5. B- Le canal twk-24 est exprimé dans les muscles de la vulve vm2 et les muscles de la paroi du corps. Les têtes de flèches blanches indiquent les muscles de la vulve vm2.. Le K2P egl-23 est exprimé, entre autres, dans les muscles de la vulve vm2 (Figure 6A) qui sont des muscles impliqués dans la ponte (voir partie « système de ponte de C. elegans »). Le développement du ver est un processus stéréotypé. Ainsi, tous les vers sauvages pondent leurs embryons environ au même stade (Figure 7). De ce fait, une perturbation du niveau d’excitabilité des muscles de la vulve vm2 devrait a priori affecter le stade des embryons pondus.. 18.

(25) Figure 7. Différents stades embryonnaires chez C. elegans. Tirée de Wormbase.. L’observation et l’analyse du stade de développement des embryons fraichement déposés sur les boites par les vers sauvages et mutants m’a permis d’identifier le phénotype perte de fonction du canal egl-23. En effet, les vers sauvages pondent leurs embryons autours du stade 36 cellules (Figure 7) alors que les vers dépourvus d’egl-23 pondent des embryons à des stades beaucoup plus précoces de 4 à 8 cellules (Figure 8). Ce phénotype perte de fonction est dû à la modification du potentiel de repos dans ces cellules. En effet, la perte d’egl-23 dépolarise les cellules qui deviennent très excitables. Ainsi, la contraction des vm2 conduit à l’expulsion prématurée des embryons à l’extérieur des vers.. Figure 8. Photos des embryons fraichement pondus par des vers sauvages et des vers mutants perte de fonction d’egl-23. A- Embryon de vers sauvages. B- Embryons de vers perte de fonction egl-23(bln252).. Dans la Figure 6, nous avons mis en évidence un autre K2P, twk-24, exprimé dans les vm2. Bien que les deux canaux, egl-23 et twk-24, semblent avoir la même localisation à la membrane des cellules musculaires, un phénotype perte de fonction a été identifié lorsque. 19.

(26) les cellules sont dépourvues d’egl-23. Ces données nous permettent d’affirmer que ces deux canaux potassiques K2P ne sont pas totalement redondants. Cependant, cela ne nous permet pas d’affirmer qu’il n’y a aucune redondance fonctionnelle au sein des K2P.. V. Existe-t-il une régulation de l’expression des K2P commune ou spécifique à chaque K2P ?. Figure 9. Représentation schématique des facteurs régulant la fonction des K2P.. Les K2P sont des canaux polymodaux (Figure 9) régulés par de nombreux facteurs tels que la température (Maingret et al., 2000) ou les variations de pH intra et extracellulaires (Lesage & Barhanin, 2011). Les K2P sont également sensibles aux anesthésiques (frankslieb, 1988), aux lipides (Fink et al., 1998) et aux tensions mécaniques (Chemin et al., 2005). Cependant, peu de données existent concernant la biologie cellulaire de ces canaux. Durant ma thèse, j’ai caractérisé le canal potassique K2P EGL-23. Afin de trouver de nouveaux régulateurs de ce canal, j’ai utilisé la stratégie de cribles génétiques que nous employons dans l’équipe afin de répondre aux questions relatives aux mécanismes de régulations de l’expression, du niveau d’activité ainsi que de la distribution des canaux.. 20.

(27) Cribles génétiques et régulations fonctionnelles des K2P chez C. elegans I. Principe des cribles génétiques chez C. elegans Afin d’identifier de nouveaux régulateurs ou voies de régulations des K2P, nous pourrions utiliser une méthode classique qui repose sur l’utilisation de gènes candidats. Cependant, cette méthode a pour inconvénient de partir d’a priori forts et permet simplement de tester des gènes connus pour une certaine fonction. Dans l’équipe, nous avons décidé d’utiliser une autre approche qui repose sur des cribles génétiques non biaisés. En principe, ceci nous permet d’identifier des facteurs impliqués à tous les niveaux de la biosynthèse des K2P. La stratégie de cribles génétiques repose sur l’utilisation de mutants ayant un phénotype fort et facilement reconnaissable dû à une mutation gain de fonction. Après mutagénèse aléatoire de cette souche, si un gène requis pour la fonction du canal est muté, on observera une suppression totale ou partielle du phénotype initial (Figure 10).. Figure 10. Stratégie des cribles génétiques suppresseurs de gains de fonction réalisés sur les K2P.. Chez C. elegans, seuls 4 K2P ont des mutations gains de fonction connues : sup-9(n1550) : paralysie flasque twk-18(cn110) : paralysie thermosensible unc-58(e665) : paralysie active egl-23(n601) : défaut de ponte. 21.

(28) L’absence d’autres gains de fonction a restreint l’étude des K2P à ces 4 canaux. Afin de ne plus être limité dans le choix des canaux à étudier, nous avons développé une stratégie permettant la génération systématique de mutation gain de fonction en augmentant l’activité des canaux de façon constitutive. Cette étude a donné lieu à une publication Ben Soussia et al. qui est en cours de révision. L’utilisation de C. elegans comme modèle d’étude facilite grandement cette approche : Elevage simple : boite de Pétri contenant un milieu gélosé ensemencé avec une souche bactérienne Escherichia coli (Brenner, 1974). Deux modes de reproductions : sexuée et asexuée (clonale). Grande descendance : 300 animaux par hermaphrodites. Petite taille et pas de pigmentation : animal transparent, idéal pour la microscopie. Animal cryogénique : possibilité de congeler/décongeler les vers. Peu de gènes essentiels : animaux viables malgré la présence de mutations. a) Point de départ des cribles génétiques : la mutagenèse aléatoire La mutagenèse aléatoire est couramment utilisée pour réaliser des cribles génétiques, où des mutants défectueux dans un processus biologique d'intérêt sont recherchés. La mutagenèse peut être induite avec une variété d'agents chimiques, chacun offrant des spécificités de lésions et fréquences de mutations différentes. La mutagenèse par rayonnement ionisant est utilisée pour générer des délétions ou réarrangements complexes. Alternativement, la mutagenèse peut être réalisée avec des insertions de transposons, en utilisant soit les transposons endogènes déjà présents chez le nématode, ou un transposon Mos1 exogène issu de la Drosophile. b) Mutagenèse aléatoire induites par des agents chimiques La mutagenèse chimique fournit le moyen le plus simple d’induire des mutations dans la lignée germinale à haute fréquences. La prévalence des mutations par utilisation d’un agent chimique est suffisamment élevée pour atteindre une saturation en analysant un faible nombre de génome haploïde. Le mutagène le plus largement utilisé chez C. elegans est le méthanesulfonate d’éthyle (EMS) et le triméthylpsoralène avec de la lumière ultraviolette (UV / TMP). Cependant, beaucoup d'autres mutagènes existent avec différents spectres : le N-éthyl-N-nitrosourée (ENU), le formaldéhyde, le nitrosoguanidine (NTG), le sulfate de diéthyle (DES), l’acétaldéhyde, le diépoxybutane (DEB) et le diépoxyoctane (DEO). Il est même possible d’associer plusieurs agents tels que EMS et ENU afin d’induire un spectre de mutations plus large. Il faut bien noter que des précautions particulières doivent être prises lors de la manipulation de mutagènes chimiques telles que travailler sous une hotte chimique et porter un équipement de protection personnelle adapté. Méthanesulfonate d’éthyle (EMS) L’EMS est le mutagène le plus couramment utilisé chez C. elegans et est de loin le plus puissant avec un taux de 2,5.10-3 mutations / gène / génome. L’EMS est un agent alkylant et ajoute le plus souvent un groupe éthyle à la guanine qui a pour conséquence d’induire des. 22.

(29) transitions G/C vers A/T et donc génère des codon STOP. Les mutations que l’on retrouve à l’issu de la mutagenèse par l’EMS sont donc des mutations fortes conduisant à des pertes de fonctions ou des allèles nuls. Triméthylpsoralène (TMP) Le TMP est un agent de réticulation inter-brin sensible à la lumière dont la mutagénicité est renforcée en présence de lumière UV à ondes courtes. Les UV associés au TMP génère de petites délétions avec une taille moyenne d’un à trois kilobases. Le taux de mutation est d'environ 10-3, mais dépend de l'exposition totale aux rayons UV. N-éthyle-N-nitrosourée (ENU) L’ENU génère des lésions moléculaires variées. Ainsi, c’est le mutagène de choix si le but est d’avoir une variabilité allélique importante. La mutagénicité de l'ENU se produit en transférant son fragment éthyle à l'azote ou l'oxygène sur l'un des quatre nucléotides, créant des bases d'ADN modifiées qui plus tard vont entraver la réplication. Tous les codons sont également mutables avec l’ENU ainsi des allèles non nuls sont souvent générés. L’ENU a une fréquence de réversion élevée autour de 2,6.10-4. La fréquence de réversion est la fréquence à laquelle un phénotype muté revient à un type sauvage. Ceci est généralement le résultat d'une seconde mutation suppresseur. Dans mon cas, j’ai choisi d’utiliser l’EMS considérant la nature des mutations que cet agent génère, sa fréquence de mutations et son niveau de dangerosité d’un point de vue technique. c) Identification des mutations causales Il y a encore quelques années, l’étape d’identification des mutations causales était laborieuse. Cette étape nécessitait l’utilisation de stratégie basées sur la cartographie génétique en utilisant des souches marquées ou des mutations induisant des phénotypes visibles. Puis par croisements, la position relative des mutations causales était déterminée. Actuellement, le génome complet de C. elegans a été séquencé et annoté. Ainsi, grâce au reséquençage complet du génome des mutants trouvés dans le crible, il devient facile d’identifier les mutations. Détail de la stratégie utilisé pour détecter les mutations Après un croisement du mutant issu du crible avec un mutant perte de fonction du gène étudié, nous gardons 5 lignées indépendantes issus de 5 F2 indépendants (Figure 11). Ces lignées ont été mélangées puis nous avons extrait l’ADNg afin de reséquencer l’ensemble du génome.. 23.

(30) Figure 11. Détail du croisement réalisé avant envoi des échantillons pour le reséquençage complet du génome.. Enfin, l’identification de la mutation causale se fait en analysant la séquence de chaque chromosome. Deux situations sont à considérer : 1- Les chromosomes ne contenant pas la mutation causale auront une séquence sauvage ou des mutations hétérozygotes. 2- Le chromosome contenant la mutation causale (Figure 12) présentera deux zones homozygotes sauvages de part et d’autre d’une zone contenant des mutations homozygotes mutés. Les jonctions de ces trois zones sont composées de mutations hétérozygotes.. 24.

(31) Figure 12. Représentation de la stratégie utilisée afin d’identifier la mutation causale lors de l’analyse du WGS. Le chromosome contenant la mutation d’intérêt présentera des mutations homozygotes sauvages puis plus on se rapproche de la mutation causale plus des mutations hétérozygotes apparaitront pour ensuite arriver à une zone contenant des mutations homozygotes mutantes. Ensuite plus on s’éloigne à nouveau de la mutation plus la séquence redevient hétérozygote puis fini par être homozygote sauvage.. Cette stratégie permet (1) d’identifier le chromosome dans lequel se trouve la mutation d’intérêt, (2) de déterminer une zone restreinte dans laquelle se trouve la mutation causale.. II. Caractérisations des K2P ayant des phénotypes gain de fonction chez C. elegans. . %# &%#&!%$$"& 4

(32) 178!#

(33) 1660)# Dans notre équipe, Philippe Tardy s’est intéressé au K2P UNC-58 durant sa thèse. Afin de trouver de nouveaux régulateurs de ce canal, il a effectué un crible génétique suppresseur du phénotype gain de fonction unc-58(e665). Ce crible a permis de mettre en évidence le rôle de l’ankyrin dans l’adressage spécifique du canal UNC-58 à la surface des muscles et dans les axones des neurones mécanosenseurs ALM (Manuscrit en cours de préparation).. 25.