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PLA2R1 et THSD7A, deux auto-antigènes de la glomérulonéphrite extra-membraneuse (GEM) :
caractérisation des formes solubles, des épitopes, et rôles biomarqueurs
Guillaume Dolla
To cite this version:
Guillaume Dolla. PLA2R1 et THSD7A, deux auto-antigènes de la glomérulonéphrite extra- membraneuse (GEM) : caractérisation des formes solubles, des épitopes, et rôles biomarqueurs. Sci- ences agricoles. Université Côte d’Azur, 2017. Français. �NNT : 2017AZUR4000�. �tel-01970771�
Th` ese de Doctorat
Pr´esent´ee en vue de l’obtention du
grade de docteur en Sciences de la Vie et de la Sant´e de
UNIVERSIT´E C ˆOTE D’AZUR
par
Guillaume DOLLA
PLA2R1 et THSD7A, deux
auto-antig` enes de la glom´ erulon´ ephrite extra-membraneuse (GEM) :
caract´ erisation des formes solubles, des
´ epitopes, et rˆ oles biomarqueurs
Th`ese dirig´ee parG´erard LAMBEAU
Soutenue le 09 Janvier 2017 Devant le jury compos´e de :
Fr´ed´eric CARRIERE, D.R., EIPL Rapporteur Fr´ed´eric CHECLER, D.R., IPMC Examinateur G´erard LAMBEAU, D.R. Directeur de th`ese Michel LAZDUNSKI, Professeur, IPMC Pr´esident du Jury Pierre RONCO, Professeur, UPMC-APHP Rapporteur
«To those paying for the gift of others.» (R.C. Deth, [1]) A mes parents.`
Remerciements
Je tiens tout d’abord `a remercier vivement les membres du jury, le Pr. Michel Laz- dunski, le Pr. Pierre Ronco, le Dr. Fr´ed´eric Carri`ere et le Dr. Fr´ed´eric Checler d’avoir accept´e de participer `a ce jury de th`ese et de consacrer de leur temps pr´ecieux `a l’´eva- luation de ce travail de th`ese. Je remercie le Pr. Pierre Ronco et le Dr. Fr´ed´eric Carri`ere, pour leurs rapports et leurs commentaires qui ont permis d’am´eliorer ce manuscrit.
Je remercie sinc`erement et profond´ement le Dr G´erard Lambeau pour m’avoir pro- pos´e ce projet de th`ese, m’avoir fait confiance et m’avoir fourni cette occasion de pleinement concr´etiser ma transition vers le domaine de la biologie. Je tiens `a saluer votre grand d´evouement, votre p´edagogie, votre rigueur, votre patience et votre inves- tissement pour l’am´elioration substantielle de ce manuscrit. Je sais que la somme des connaissances et des attitudes scientifiques que vous m’avez transmises seront des bases fondamentales pour mon futur professionnel.
Je remercie l’ensemble du personnel de l’IPMC et plus sp´ecifiquement les personnes de l’´etage R+2 pour leur accueil chaleureux et les discussions stimulantes que nous avons eues.
Je remercie toute l’´equipe pour les moments partag´es, l’aide offerte et les commen- taires sur ce manuscrit. Louise, merci pour ton humour et nos discussions passionnantes, incongrues, et surtout celles qui furent les deux `a la fois. Joana et Kristel, les « sœurs jumelles», merci pour votre bonne humeur, votre gentillesse, votre vivacit´e d’esprit et votre enthousiasme communicatif pour la science. Ce fut un plaisir pour moi de vous accueillir dans l’´equipe. Christine, merci pour ton humanit´e et pour nos discussions « philosophiques »! Vesna, merci pour ta s´er´enit´e, ton amabilit´e, ta serviabilit´e, et ton expertise scientifique. Barbara, merci pour tout ce que j’ai pu apprendre par toi sur le monde m´edical. Dominique, merci pour tes conseils et ta gentillesse. Merci `a tous pour les relectures des figures !
Je tiens `a remercier les membres pass´es de l’´equipe, en particulier Jo¨el, pour son aide et sa bonne humeur, Nicola Tomas pour tout ce que j’ai appris `a son contact et son enthousiasme lumineux, Charlaine Revel pour sa jovialit´e, Roberto Delgadillo et Christophe Girard pour ce que j’ai pu vivre aupr`es d’eux. Je tiens `a saluer le travail fourni par les stagiaires du laboratoire, dont les fruits ont ´et´e importants pour nos recherches. Je remercie en particulier Madeline McNamara, Olivia Manuelian et Laurie Venant, que j’ai eu le plaisir d’encadrer, pour leur investissement et leur enthousiasme.
Je remercie aussi Laetitia Robuchon pour son travail de purification des anticorps.
Je tiens `a saluer l’enthousiasme, la t´enacit´e et l’expertise technique de Pascal Man- suelle, de la plateforme prot´eomique de l’Institut de Microbiologie de la M´editerran´ee (IMM) `a Marseille.
seignement durant ces quatre ann´ees : Fabienne, Alexandre, Sabine, Marie-C´ecile et Sandra.
Je remercie tr`es chaudement toutes les personnes qui ont ´et´e des guides, des com- pagnons, et dont la bont´e m’a permis de traverser des p´eriodes tr`es difficiles. En parti- culier, je salue le travail d´evou´e, la grandeur d’ˆame et la g´en´erosit´e du Dr. Amy A. Y., pour m’avoir offert une seconde vie, et m’avoir plac´e sur le chemin qui m’a amen´e `a d´ecouvrir mon aspiration `a offrir des solutions th´erapeutiques innovantes. Je remercie
´
egalement Jean-Michel C. pour son aide, et pour avoir ´et´e un rep`ere dont le discerne- ment, la sagesse et le cœur m’ont aid´e `a me tourner vers l’essentiel.
Je remercie profond´ement mes parents pour leur amour, leur soutien sans faille, leurs encouragements et leurs sacrifices. Je remercie ´egalement mon fr`ere et ma sœur pour leur amour et leurs conseils.
Je remercie toutes les personnes qui m’ont offert leur amiti´e : Ruben, Anna et Romain pour leur amiti´e de longue date, leur soutien et leurs encouragements pendant ma reconversion et leurs exhortations `a « chercher le rem`ede contre le cancer », et salue toutes les amiti´es tiss´ees `a Valbonne : Thierry, Janny, Philippe, Corinne, Antoine, Cathy, Guillaume, Sandrine, Sibylle. Et surtout, je m’excuse par avance `a tous ceux qui ne sont pas mentionn´es ici et les remercie de ce qu’ils m’ont offert !
Sommaire
Liste des figures 1
Liste des tables 3
Abr´eviations 5
1 Introduction - PLA2R1 7
1.1 D´ecouverte de PLA2R1. . . 7
1.2 Propri´et´es structurales de PLA2R1 . . . 8
1.2.1 Structure compar´ee des orthologues et paralogues de PLA2R1 . 10 1.2.2 PLA2R1 est une prot´eine contenant des CTLD . . . 11
1.2.3 Formes solubles de PLA2R1 . . . 15
1.3 Propri´et´es de liaison de PLA2R1 . . . 16
1.3.1 Propri´et´es de liaison des CTLD de PLA2R1 . . . 16
1.3.2 Autres ligands de prot´eines de la famille des CTLD . . . 18
1.4 Propri´et´es fonctionnelles de PLA2R1 . . . 19
1.4.1 PLA2R1 poss`ede des propri´et´es d’endocytose. . . 19
1.4.2 Signalisation et partenaires de PLA2R1 . . . 20
1.4.3 Expression tissulaire de PLA2R1 . . . 20
1.4.4 Rˆoles physiologiques et physiopathologiques de PLA2R1 . . . . 20
1.4.5 Fonctions des paralogues de PLA2R1 . . . 24
2 Introduction - La glom´erunon´ephrite extra-membraneuse 27 2.1 D´efinition de la GEM . . . 27
2.1.1 Physiologie du glom´erule . . . 27
2.1.2 Clinique de la GEM . . . 29
2.1.3 Pronostics et traitements de la GEM . . . 29
2.1.4 Caract´eristiques histologiques de la GEM . . . 29
2.2 Antig`enes dans la GEM idiopathique . . . 30
2.2.1 Le mod`ele de la n´ephrite de Heymann . . . 30
2.2.2 Endopeptidase neutre (NEP) . . . 30
2.2.3 PLA2R1 est l’auto-antig`ene majeur dans la GEM idiopathique . 31 2.2.4 G´en´etique de la GEM . . . 33
2.2.5 Autres antig`enes dans la GEM . . . 33
2.3 Physiopathologie et histoire naturelle de la glom´erulon´ephrite extra- membraneuse . . . 34
2.3.1 Origine des auto-anticorps . . . 34
2.3.2 M´ecanismes d’apparition des d´epˆots glom´erulaires . . . 36
2.3.3 Effets physiopathologiques des anticorps . . . 38
2.4 Outils diagnostiques et pronostiques de la GEM . . . 40
2.4.1 M´ethodes de d´etection des anticorps . . . 41
2.4.2 Immunomarquage des antig`enes sur biopsies . . . 41
2.4.3 Comparaison des pr´evalences mesur´ees par western blot, IIFT et ELISA . . . 42
2.4.4 Valeur pronostic des diff´erents outils . . . 42
3 Objectifs 45 4 R´esultats 47 4.1 Shedding de PLA2R1 et formes solubles . . . 47
4.1.1 D´efinition du shedding . . . 48
4.1.2 La famille des ADAMs . . . 49
4.1.3 PLA2R1 est shedd´e in vitro . . . 53
4.1.4 Modulation du shedding par les anticorps anti-PLA2R1 . . . 66
4.1.5 Existe-t-il un shedding de PLA2R1 dans le rein in vivo ? . . . . 67
4.1.6 Mat´eriel et m´ethodes succintes. . . 70
4.2 D´eveloppement de tests ELISA bas´es sur les prot´eines PLA2R1 de lapin et de souris . . . 70
4.2.1 R´eactivit´e crois´ee des anticorps de patients contre les prot´eines PLA2R1 humaine, de lapin et de souris . . . 71
4.2.2 Le titre des anticorps contre mPLA2R1 pr´edit l’´evolution de la maladie . . . 72
Article 1 . . . 73
4.3 Identification des ´epitopes de PLA2R1 dans la GEM idiopathique . . . 99
4.3.1 PLA2R1 humain contient trois ´epitopes distincts et ind´ependants 101 4.3.2 Un ´etalement ´epitopique intramol´eculaire dans PLA2R1 est as- soci´e `a un mauvais pronostic . . . 107
Article 2 . . . 111
4.4 Thrombospondin Type-A Domain-Containing 7A (THSD7A) est une cible antig´enique dans la glom´erulon´ephrite extra-membraneuse . . . . 153
4.4.1 D´ecouverte d’un nouvel antig`ene dans la GEM idiopathique . . 153
4.4.2 Nouveaux objectifs amen´es par la d´ecouverte de THSD7A . . . 155
4.4.3 Production recombinante de l’antig`ene . . . 156
Article 3 . . . 161
5 Discussion 219 5.1 D´ecouverte d’un nouvel auto-antig`ene dans la GEM idiopathique . . . . 219
5.1.1 Pr´evalence de THSD7A dans la GEM idiopathique . . . 219
5.1.2 Rˆole physiologique . . . 220
5.1.3 Mod`ele animal : PLA2R1 ou THSD7A . . . 220
5.2 Formes solubles de PLA2R1 . . . 222
5.2.1 Shedding de PLA2R1 . . . 222
5.2.2 D´eterminants structuraux du shedding . . . 222
5.2.3 Identit´e de la sheddase . . . 225
5.2.4 Localisation du shedding . . . 226
5.2.5 Rˆole physiologique de la forme soluble chez l’homme . . . 227
5.2.6 Forme soluble de THSD7A . . . 228
5.3 Epitopes dans la GEM idiopathique . . . 228
5.3.1 Analyse ´epitopique par librairie de peptides . . . 229
5.3.2 Identification de la r´egion immunodominante de PLA2R1 . . . . 232
SOMMAIRE SOMMAIRE
5.3.3 Le domaine CysR contient l’´epitope immunodominant. . . 240
5.3.4 Etalement ´epitopique dans la GEM idiopathique . . . 241
5.3.5 Divergences entre les ´etudes : un r´esum´e . . . 242
5.3.6 R´esultats non publi´es et questions en suspens . . . 243
5.3.7 Epitope Spreading sur THSD7A . . . 245
5.4 G´en´eration des d´epˆots glom´erulaires dans la GEM . . . 246
5.4.1 Sc´enario de la forme membranaire shedd´ee . . . 248
5.4.2 Sc´enario de la forme soluble circulante . . . 250
5.5 Conclusion g´en´erale . . . 251
Article 4 255
R´ef´erences bibliographiques 263
Liste des figures
1.1 R´eaction enzymatique catalys´ee par les phospholipases A2 . . . 7
1.2 Domaines de PLA2R1 . . . 9
1.3 Structure des domaines Cysteine-rich . . . 9
1.4 Structure du domaine FNII . . . 10
1.5 R´egion cytoplasmique de PLA2R1 . . . 11
1.6 Prot´eines contenant des CTLD . . . 13
1.7 Structure des CTLD . . . 14
2.1 Glom´erules r´enaux dans la GEM . . . 28
2.2 Trois sc´enarios pour l’apparition de d´epˆots glom´erulaires . . . 37
2.3 Immunomarquage augment´e de PLA2R1 dans la GEM . . . 41
4.1 ARN messagers de PLA2R1 dans le rein . . . 48
4.2 Shedding de l’ectodomaine d’une prot´eine . . . 49
4.3 Structure d’une sheddase ADAM . . . 50
4.4 Shedding de hPLA2R1 . . . 54
4.5 PLA2R1 peut exister sous trois formes chez l’homme . . . 55
4.6 Shedding des orthologues et paralogues de PLA2R1 . . . 56
4.7 Le shedding de PLA2R1 d´epend de sa zone juxtamembranaire . . . 57
4.8 Shedding de PLA2R1 et internalisation du r´ecepteur . . . 58
4.9 D´eterminants mol´eculaires du shedding . . . 60
4.10 Identification du site de shedding de hPLA2R1 . . . 61
4.11 hPLA2R1 est cliv´e dans sa zone juxtamembranaire . . . 63
4.12 Expression stable et inductible de hPLA2R1 dans des HEK-TRexTM . . 64
4.13 Modulation pharmacologique du shedding . . . 65
4.14 Dose-r´eponse du GI254023X sur le shedding de hPLA2R1. . . 66
4.15 Modulation du shedding par des anticorps anti-PLA2R1 . . . 67
4.16 Caract´erisation de l’anticorps «ctld8-ab» . . . 68
4.17 Deux formes solubles de PLA2R1 sont pr´esentes dans le rein humain . 69 4.18 Structure de la m´egaline . . . 100
4.19 D´elimitations des CTLD de PLA2R1 . . . 103
4.20 CTLD8 contient un 4e´epitope . . . 108
4.21 D´etection des anticorps anti-CTLD8 . . . 109
4.22 Expression de hPLA2R1 et ses paralogues dans diff´erents tissus . . . . 154
4.23 Expression recombinante de THSD7A . . . 159
5.1 Identit´e entre les r´ecepteurs PLA2R1 humain, de lapin et de souris. . . 221
5.2 La r´egion juxtamembranaire de PLA2R1 est peu conserv´ee . . . 223
5.3 Comparaison des ´epitopes de PLA2R1 propos´es dans la litt´erature . . . 230 5.4 Contradictions entre les diff´erents ´epitopes propos´es sur le domaine CysR231
5.5 S´equence tronqu´ee du CTLD1 produit par Kao et al. . . 234 5.6 Critique de la strat´egie de digestion par la thrombine de Kao et al. . . 236 5.7 Suggestion d’´epitopes additionnels sur PLA2R1 . . . 238 5.8 Contribution des domaines CysR, FNII et CTLD1 `a la reconnaissance
de PLA2R1 . . . 239 5.9 Les cyst´eines C0 et C0’ du CTLD1 et sa reconnaissance ´epitopique . . 240 5.10 Choix de hMRC2 pour les chim`eres ´epitopiques . . . 245 5.11 Sc´enario propos´e pour la formation des d´epˆots glom´erulaires . . . 247
Liste des tables
1.1 Propri´et´es de liaison de diff´erentes sPLA2 par PLA2R1 . . . 18
Abr´ eviations
PLA2R1 R´ecepteur aux phospholipases A2 s´ecr´et´ees 1 hPLA2R1 PLA2R1 humain
mPLA2R1 PLA2R1 de souris rbPLA2R1 PLA2R1 de lapin
ADAM A Disintegrin And Metalloproteinase
ADAMTS A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin motifs ANCA Anticorps anti-cytoplasmiques des polynucl´eaires neutrophiles AR Aldose R´eductase
BSA Albumine de s´erum bovin
CHO Lign´ee cellulaire«Chinese Hamster Ovary» CTLD Domaine lectine de type C
CysR Domaine «riche en cyst´eine» DTT Dithiothr´eitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Acide ´ethyl`ene diamine t´etra-ac´etique EGF Facteur de croissance ´epidermique ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FGF Facteur de croissance des fibroblastes FNII Domaine Fibronectine de type II
gp130 Sous unit´eβ du r´ecepteur `a l’interleukin-6
HEK293T Lign´ee cellulaire«Human Embryonic Kidney 293» HGE Human Glomerular Extract (extrait glom´erulaire humain) HLA Human Leukocyte Antigen
IgG Immunoglobuline de type G IL Interleukine
IM Ionomycine
JAK2 Janus kinase 2
LBD Domaine de liaison du ligand LDL Lipoprot´eines de basse densit´e LH Hormone lut´einisante
LIF-R Leukemia Inhibitory Factor Receptor LPS Lipopolysaccharide
LY75 Lymphocyte Antigen 75
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MMP M´etalloprot´einase matricielle MRC1 R´ecepteur mannose du macrophage MRC2 R´ecepteur mannose C-type 2 NEP Endopeptidase Neutre
NIH 3T3 Lign´ee de fibroblastes d’embryon de souris «Swiss Albino» NOG n-Octyl β-D-glucopyranoside
PDB-ID Protein Data Bank - Structure Identifier PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
PVDF Polyfluorure de vinylid`ene
RANKL Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand
RPE-1 Lign´ee immortalis´ee de cellules de l’´epith´elium r´etinien pigment´e SNP Single-Nucleotide Polymorphism
SOD2 Superoxide Dismutase d´ependante du mangan`ese sPLA2 Phospholipase A2 s´ecr´et´ee
TCA Acide trichlorac´etique
TGF Facteur de croissance transformant
THSD7A Thrombospondin Domain containing protein 7A TNF Tumor Necrosis Factor
TNF-α Facteur de n´ecrose tumorale α TSH Thyr´eostimuline
Chapitre 1
Introduction - PLA2R1
1.1 D´ ecouverte de PLA2R1
Le r´ecepteur des phospholipases A2 s´ecr´et´ees (PLA2R1) a ´et´e identifi´e pour ses pro- pri´et´es de liaison des phospholipases A2 s´ecr´et´ees (sPLA2). Les sPLA2sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse de la liaison estersn-2 des glyc´erophospholipides et lib`erent des acides gras comme l’acide arachidonique, et des lysophospholipides comme le LPC ou le LPA (Fig. 1.1). L’acide arachidonique est un pr´ecurseur majeur des m´ediateurs lipidiques avec par exemple une fonction cl´e dans la r´egulation de l’inflammation, `a l’origine de la synth`ese des prostaglandines et des leukotri`enes. Plus de 10 g`enes de sPLA2 sont pr´esents chez les mammif`eres, et celles-ci sont impliqu´ees dans diff´erentes conditions physiologiques et physiopathologiques (m´etabolisme des lipides, inflamma- tion, d´efense antimicrobienne, contraction musculaire, reproduction, prolif´eration, dif- f´erenciation et apoptose cellulaire, cancer, etc). Les sPLA2 sont aussi pr´esentes dans les venins de serpents, d’abeille, de scorpions ou de cnidaires, o`u elles ont des propri´et´es digestives, mais aussi toxiques et pharmacologiques.
Les effets des sPLA2 de venin ne sont pas facilement expliqu´es par leurs actions enzymatiques. Certaines sPLA2 de venins de serpent sont d’ailleurs catalytiquement inactives mais myotoxiques et cytotoxiques [3] : il existe donc des cibles sp´ecifiques qui vont lier les sPLA2 et promouvoir leurs actions. Inversement, des tissus des ani- maux venimeux comme le foie produisent des prot´eines inhibitrices des sPLA2s qui les prot`egent de l’action toxique de leurs propres sPLA2 de venin.
PLA2R1 a ´et´e d´ecouvert en recherchant des prot´eines membranaires pr´esentes chez les mammif`eres capables de lier des sPLA2 toxiques. L’utilisation de la sPLA2 neuro- toxique OS2 (extraite du venin du serpent australien«Ta¨ıpan»,Oxyuranus scutellatus scutellatus) en tant que ligand a permis de mettre en ´evidence deux types de prot´eines
1-Palmitoyl-2-arachidonyl-phosphatidylcholine Acide arachidonique 1-Palmitoyl-lysophosphatidylcholine
Figure1.1 – Une r´eaction catalys´ee par les Phospholipases A2. Les PLA2hydrolysent la liaison ester sn-2 des phospholipides : ici le 1-palmitoyl-2-archidonyl-phosphatidylcholine est hydrolys´e en acide arachidonique et en 1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine.Adapt´e de [2] avec permission de l’auteur.
de liaison. Le premier type est appel´e «r´ecepteurs de type N», pour neuronal. Ces r´ecepteurs sont enrichis `a la surface des membranes synaptiques pr´epar´ees `a partir de cerveau de rat [4]. L’identit´e de ces cibles prot´eiques n’est pas connue `a ce jour. Le deuxi`eme type de r´ecepteur est appel´e «r´ecepteur de type M» car il fut d´ecouvert en 1990 `a la surface de myotubes en culture issus de muscle squelettique de lapin [5]. Des exp´eriences de liaison `a l’´equilibre ont permis de d´eterminer une affinit´e de 7 pM entre ce r´ecepteur et la sPLA2 OS2, et de 38 pM pour OS1, une autre sPLA2 du mˆeme serpent.
Des exp´eriences de r´eticulation covalente du r´ecepteur pr´esent dans des membranes de myotube avec la sPLA2 OS2 iod´ee montrent que le r´ecepteur a une masse mol´ecu- laire d’environ 180 kDa [5]. Un pas important fut la mise en ´evidence que ce mˆeme r´ecepteur, chez la souris, n’´etait pas seulement la cible de certaines sPLA2 pr´esentes dans les venins, mais avait ´egalement pour ligand au moins une sPLA2 de mammif`eres, la sPLA2 de groupe IB, produite entre autre par le pancr´eas [6]. Le r´ecepteur n’´etait cependant pas encore clon´e, et sa fonction restait inconnue.
Le clonage du r´ecepteur de type M fut r´ealis´e en 1994, `a l’IPMC [7]. Le r´ecepteur de 180 kDa a ´et´e purifi´e `a partir des myotubes de lapin en culture, purifi´e par affinit´e avec la sPLA2 OS2 [7], puis son extr´emit´e N-terminale et des peptides g´en´er´es par coupure au bromure de cyanog`ene ont ´et´e s´equenc´es par la technique d’Edman. Suite `a cette d´ecouverte, la mˆeme prot´eine fut clon´ee chez le bœuf apr`es purification `a partir du corps jaune bovin [8], chez la souris [9], et enfin chez l’homme `a partir de rein humain
`
a l’IPMC en 1995 [10]. Ce r´ecepteur fut le premier, et reste le seul r´ecepteur de sPLA2 clon´e `a ce jour. A ce titre, il a ´et´e baptis´e «PLA2R1».
1.2 Propri´ et´ es structurales de PLA2R1
Chez l’homme, PLA2R1 est une prot´eine transmembranaire de type I de 1463 acides amin´es, tr`es glycosyl´ee, et d’une masse mol´eculaire totale d’environ 180 kDa. PLA2R1 est constitu´e d’un peptide signal de 21 acides amin´es, d’une large partie extracellulaire, d’un seul segment transmembranaire et d’une courte partie cytoplasmique [10]. La partie extracellulaire est constitu´ee, `a partir de l’extr´emit´e N-terminale, d’un domaine
«Cysteine-Rich» (CysR, ou de type «ricine»), d’un domaine «fibronectine de type II»(FNII) et 8 domaines«C-Type Lectin»(CTLD), tous diff´erents les uns des autres (Fig. 1.2-A).
Nous ne disposons pas `a l’heure actuelle de donn´ees de haute r´esolution sur la structure des diff´erents domaines de PLA2R1. Le seul mod`ele propos´e est de basse r´esolution (20 ˚A) et concerne sa r´egion extracellulaire. Il a ´et´e r´ealis´e `a partir de clich´es de monom`eres en solution par microscopie ´electronique `a basse r´esolution (Fig. 1.2-B et C), sugg´erant que cette r´egion prend en solution la forme du symbole «π » [11].
Ce mod`ele est compl´et´e grˆace `a la comparaison des diff´erents domaines de PLA2R1 avec des domaines homologues, contenus dans d’autres prot´eines et pour lesquels une structure cristallographique a ´et´e obtenue. C’est notamment le cas de certains domaines contenus par des paralogues de PLA2R1, qui seront d´ecrit au chapitre 1.2.1.
Le domaine CysR est le domaine le plus N-terminal de PLA2R1. Ce type de domaine a pour la premi`ere fois ´et´e d´ecrit dans la toxine ricine, c’est pourquoi les domaines CysR sont aussi appel´es «domaines ricines» ou«lectines de type R ». Des domaines de type Cysteine-rich sont ´egalement retrouv´es dans l’IL-1α et l’IL-1β, le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) et l’inhibiteur de la trypsine pr´esent dans le soja [12]. Dans la ricine et le paralogue de PLA2R1 appel´e MRC1, le domaine CysR a une forme globulaire β-trilob´ee (β-trefoil en anglais), o`u la disposition des diff´erents lobes
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.2. PROPRI ´ET ´ES STRUCTURALES
CysR Structure de PLA2R1
Modèle ajusté de PLA2R1
B
C CysR
FNII
1 2 3 4 5 6 7 8
A25Å
25Å
Figure 1.2 – (A) Domaines composant le r´ecepteur aux phospholipases A2 secr´et´ees (PLA2R1).
La r´egion extracellulaire de PLA2R1 est compos´ee d’un domaine Cysteine-rich (CysR), d’un domaine Fibronectine de type II (FnII), et de 8 domaines C-Type Lectin (CTLD). PLAR1 comprend ´egalement un segment transmembranaire et une courte r´egion cytoplasmique. (B) Densit´e ´electronique de la r´egion extracellulaire de PLA2R1 calcul´ee `a partir de clich´es de microscopie ´electronique de 20 000 particules `a une r´esolution de 20 ˚A. (C) Mod´elisation de la r´egion extracellulaire de PLA2R1 d’apr`es la densit´e ´electronique.B et C adapt´es de [11] avec permission de l’«American Society of Nephrology».
Ricine B Récepteur Mannose du macrophage
Figure1.3 – Structure des domaines Cysteine-rich. Diagramme en ruban de la structureβ-lob´ee des domaines CysR de la ricine B (PDB : 2AAI) et du r´ecepteur mannose du macrophage (MRC1, PDB : 1DQG). Les ponts disulfures sont repr´esent´es en jaune, le lobe 1 en bleu, le lobe 2 en vert et le lobe 3 en rose. Le ligand galactose est montr´e associ´e `a la ricine B, et le 4-SO4-N-acetylgalactosamine associ´e
`
a MRC1.Adapt´e de [12] avec permission de«The Rockefeller University Press».
Figure1.4 – Structure du domaine Fibronectine de type II. Diagramme en ruban du domaine FNII de la prot´eine MRC2 (PDB : 5AO5), avec les brins β et les ponts disulfures en jaune.
entre eux se fait selon une sym´etrie interne de 120◦. Chaque lobe est form´e de 4 brins b´eta, avec trois brins qui s’entrecroisent au centre du lobe, et un brin qui connecte un lobe au lobe suivant (Fig.1.3). La conformation du lobe est maintenue par trois ponts disulfures : le premier est entre les brins β2 etβ5. Le second a une position ´equivalente dans le second lobe, entre les brins β6 et β7. La position du troisi`eme pont n’est pas canonique. Dans MRC1, ce pont relie le dernier brin du second lobe (β8) avec la fin du domaine, apr`es le brin β12 [12].
Un domaine FNII est compos´e de deux feuilletsβ perpendiculaires chacun compos´e de deux brins antiparall`eles, qui forment un long sillon accessible au solvant traversant le domaine de part en part (Fig. 1.4). Les domaines fibronectine de type II se re- trouvent entre autres dans la fibronectine, une glycoprot´eine pr´esente dans la matrice extracellulaire essentielle `a l’adh´esion des cellules, ou encore dans les m´etalloprot´eases matricielles MMP-2 et MMP-9 (voir chapitre 1.3).
La r´egion extracellulaire de PLA2R1 comprend ensuite 8 «C-type lectin-like do- main»(CTLD), tous diff´erents les uns des autres, depuis le«CTLD1»au«CTLD8».
Ces domaines ont en commun une structure globulaire sp´ecifique qui sera d´ecrite en d´etail au chapitre 1.2.2 et qui sont s´epar´es les uns des autres par de courts segments peptidiques appel´es «linker». Dans la prot´eine PLA2R1, ces zones linkers ont une longueur comprise entre 5 et 16 acides amin´es, leurs d´elimitations sont pr´esent´ees dans la figure 4.19.
Le domaine CTLD8 est suivi d’une r´egion juxtamembranaire de 15 acides amin´es, suivie par un seul segment transmembranaire et une courte r´egion cytoplasmique de 42 acides amin´es. La r´egion cytoplasmique contient un motif NPYY permettant l’in- ternalisation par des v´esicules d’endocytose `a clathrine.
1.2.1 Structure compar´ ee des orthologues et paralogues de PLA2R1
Des prot´eines orthologues `a PLA2R1 sont largement retrouv´ees chez les vert´ebr´es dont le g´enome est s´equenc´e. Le r´ecepteur humain (hPLA2R1) et ceux des autres mam- mif`eres ont plus de 70 % d’identit´e. Le r´ecepteur de lapin (rbPLA2R1) a par exemple 86 % d’identit´e avec hPLA2R1, alors que les r´ecepteurs de souris (mPLA2R1) ou de rat ont 74 % d’identit´e (Fig.5.1). De mani`ere exceptionnelle, la r´egion cytoplasmique est plus longue chez la souris, avec 67 amin´es au lieu de 42, et contient une cyst´eine
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.2. PROPRI ´ET ´ES STRUCTURALES
PLA2R1(Human) -HNGGFFRRLAGFRNPYYPATNFST-VYLEENILISDLEKSDQ--- PLA2R1(lapin) KQNKGFFRRLAGVGNSYYPTTNFST-IHLEENILISDLEKND--- PLA2R1(souris) KQKSDIFQRLTGSRGSYYPTLNFST-AHLEENILISDLEKNTNDEEVRDAPATESKRGHKGRPICISP MRC1 KKRRVHLPQEGAFENTLYFNSQSSPGTS-DMKDLVGNIEQNEHSVI--- MRC2 -RRRQSIER-GAFEGARYSRSSSSPTEATEKNILVSDMEMNEQQE--- LY75 -QRHRL--HLAGFSSVRYAQGVN---EDEIMLPSFHD--- Motifs d’endocytose FxNxxY E---LL
Figure 1.5 – R´egions cytoplasmiques de PLA2R1 et de certains homologues. Alignements des s´e- quences prot´eiques des r´egions cytoplasmiques de PLA2R1, de ses orthologues lapin et souris, et de ses trois paralogues humains : le r´ecepteur mannose du macrophage (MRC1), Endo180 (MRC2) et LY75. Le motif d’internalisation tyrosine est surlign´e en jaune. Le motif di-hydrophobe en surlign´e en bleu clair et l’acide amin´e conserv´e 4 acides amin´es en amont en bleu fonc´e. La s´erine pr´edite comme cible d’une phosphorylation par la cas´eine-kinase II est surlign´ee en rouge, et les acides amin´es charg´es n´egativement qui participent au motif sont color´es en rose pˆale.
impaire. Les cons´equences de ces changements structurels ne sont pas connues. La conservation de PLA2R1 diminue beaucoup dans les autres groupes de vert´ebr´es, avec 45 % d’identit´e entre l’homme et le x´enope, et 41 % avec le poisson-z`ebre. Dans les autres groupes de vert´ebr´es, on retrouve les mˆemes 10 domaines extracellulaires, mais certains de ces domaines contiennent des cyst´eines surnum´eraires.
PLA2R1 fait partie de la «famille du r´ecepteur mannose du macrophage»appel´e MRC1. Cette famille comprend 4 membres : PLA2R1, MRC1, le r´ecepteur mannose C-type 2 (MRC2, aussi appel´e Endo180 car historiquement clon´e dans les cellules en- doth´eliales [13]) et le r´ecepteur «antig`ene du lymphocyte 75» LY75 (aussi appel´e DEC-205 car historiquement clon´e dans les cellules dendritiques [14]). La r´egion ex- tracellulaire de la prot´eine MRC1 humaine poss`ede 31 % d’identit´e avec hPLA2R1 (Fig. 5.10-B), alors que hMRC2 est plus proche avec 37 % d’identit´e. Ces r´ecepteurs sont tous constitu´es d’un domaine CysR, d’un domaine fibronectine, et de 8 domaines CTLD, except´e LY75 qui contient 10 CTLD au total. Les domaines CysR des diff´erents membres de la famille du r´ecepteur mannose ont entre 25 et 30 % d’identit´e. Les do- maines Fibronectine de Type-II sont les domaines les plus conserv´es `a travers la famille du r´ecepteur mannose, avec 44 `a 60 % d’identit´e. Les domaines CTLD sont plus ou moins conserv´es, avec 30 `a 45 % d’identit´e pour les domaines CTLD1 `a CTLD4, alors que les domaines CTLD5 `a CTLD8 ont un taux d’identit´e en g´en´eral inf´erieur `a 30 %.
Les r´egions cytoplasmiques sont courtes, et ont en commun un motif d’internalisation tyrosine consensus d´ej`a d´ecrit pour PLA2R1 (Fig. 1.5). LY75 poss`ede toutefois ´egale- ment un trio d’acides amin´es charg´es n´egativement (1712EDE1714) plus distal, que l’on retrouve dans les r´ecepteurs impliqu´es dans le tri intracellulaire des prot´eines [15]. Les zones linkers et juxtamembranaires sont tr`es peu conserv´ees.
1.2.2 PLA2R1 est une prot´ eine contenant des CTLD
PLA2R1 contient 8 CTLD, tous diff´erents les uns des autres. A ce titre, PLA2R1 est classifi´e comme une«prot´eine contenant des CTLD»appartenant `a la superfamille des lectines de type C [16].
D´efinition
Le terme C-Type lectin domain (CTLD, historiquement appel´e CRD pour carbo- hydrate recognition domain) regroupait les domaines de certaines prot´eines ayant une activit´e lectine (c’est-`a-dire de liaison des sucres) qui d´epend du calcium [17]. Les pre-
mi`eres ´etudes des structures cristallographiques de ces CTLD ont r´ev´el´e une structure globulaire compacte tr`es particuli`ere, diff´erente des structures des autres domaines pro- t´eiques connues `a cette ´epoque. Aujourd’hui, le terme CTLD n’est plus utilis´e dans un sens fonctionnel, mais dans un sens structural, et d´ecrit les membres de la superfamille des «C-type lectin-like domain». Tous les membres de cette superfamille pr´esentent cette structure globulaire, compacte, et leurs s´equences comprennent les d´eterminants structuraux d´ecrits ci-apr`es. De fait, tous les CTLD n’ont pas une activit´e lectine, et pour ceux qui ont une telle activit´e, elle n’est pas syst´ematiquement d´ependante du calcium.
Des CTLD ont ´et´e identifi´es dans plus de 1000 prot´eines diff´erentes pr´esentes chez les m´etazoaires, des ´eponges `a l’homme. On appelle alors ces prot´eines des «prot´eines contenant des CTLD»ou«CTLDcp». Le g´enome humain, par exemple, code pour plus de 100 prot´eines contenant des CTLD, y compris PLA2R1, qui contient 8 CTLD, et la polycystine-1 (PKD1), une prot´eine impliqu´ee dans la majorit´e des cas de polykystose r´enale autosomique dominante. Il existe ´egalement des exemples de CTLDcp dans des prot´eines bact´eriennes, comme la toxine pertussique, ou virales comme la prot´eine enveloppe gp42 du virus Epstein Barr.
Les CTLDcp sont actuellement r´eparties en 17 groupes (Fig. 1.6). PLA2R1 appar- tient `a la famille du r´ecepteur mannose du macrophage, qui correspond au groupe VI, et dont les 4 membres sont les seules prot´eines connues pour poss´eder plusieurs CTLD en tandem [17,16]. Toutes les autres prot´eines avec des domaines CTLD ne contiennent qu’un seul domaine par sous-unit´e mais souvent, ces prot´eines se multim´erisent, ce qui am´eliore probablement leur avidit´e pour leurs ligands. Parmi ces diff´erents groupes, on retrouve la famille des collectines, impliqu´ees dans l’immunit´e inn´ee et qui recon- naissent les sucres de pathog`enes, ou celle des s´electines, impliqu´ees dans l’adh´esion cellulaire et le guidage de cellules immunitaires vers les sites inflammatoires.
Structure des domaines CTLD
La s´equence prot´eique d’un domaine CTLD comprend entre 110 et 150 acides ami- n´es. Tous les CTLD pr´esentent une structure tertiaire globulaire compacte, dont l’axe central, hydrophobique, est form´e par les brins b´eta N-terminal (β1) et C-terminal (β5). Ils se rejoignent et forment un feuillet b´eta antiparall`ele, qui est flanqu´e de deux h´elices α lat´erales (α1 et α2, Fig. 1.7-A). Le sommet d’un CTLD pr´esente une poche form´ee par un feuillet `a trois brins b´eta (β2, β3, β4, [18]). Cette poche est le site de liaison des ligands pour les CTLD qui ont une activit´e lectine. Dans la majeure partie des CTLD, cette poche est entour´ee d’une suite d’acides amin´es, qui forme une boucle appel´ee «long loop». La s´equence des acides amin´es composant la «long loop» est
´
evolutivement tr`es variable et influence directement la sp´ecificit´e de la liaison du CTLD
`
a ses ligands de type sucre [17]. Tous les CTLD de PLA2R1 ont une«long loop», d’une taille comprise entre 34 et 40 acides amin´es. La long loop du CTLD1 de hMRC2 est montr´ee en bleu dans la figure 1.7-A.
Quatre cyst´eines, ´evolutivement tr`es conserv´ees, maintiennent cette structure par- ticuli`ere en un volume dense et globulaire. Les cyst´eines C1 et C4 forment un premier pont cyst´eine qui relie les brins β5 et β1 et stabilise la boucle d´ecrite par le domaine dans son ensemble. Les deux autres cyst´eines, C2 et C3, relient les brins β3 et β4 et maintiennent le cot´e de la «long loop» finissant en β3 (Fig. 1.7-A). Certains CTLD pr´esentent du cot´e N-terminal une courte extension form´ee par une ´epingle-`a-cheveu b´eta, stabilis´e par un pont disulfure suppl´ementaire. Dans PLA2R1, c’est le cas de tous
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.2. PROPRI ´ET ´ES STRUCTURALES
PSI (plexines, sémaphorines, intégrines) Domaine CUB Domaine WSC PKD (Ig-like) Domaine type C du facteur vonWillebrand
Domaine Ig-like Domaine EGF Domaine SCP Domaine Calx-β Domaine CCP (Sushi)
Domaine classe A du LDL Domaine REJ Domaine Ricine B Domaine Fibronectine type II
Domaine Link
Héliceα Domaine collagène Domaine Ser/Thr-rich (O-glycosylé) Orientation de la chaine polypeptiditique
Répétition CSPG CTLD
(canonique)
Figure 1.6 – Superfamille des«C-Type Lectin domains» (CTLD). Architecture des prot´eines de vert´ebr´es contenant des CTLD, r´eparties en 17 groupes dont 10 groupes r´eunissent des prot´eines mem- branaires et 7 des prot´eines secr´et´ees. I – Lecticans, II – Groupe du r´ecepteur aux asialoglycoprot´eines, III – Collectines, IV – S´electines, V – R´ecepteur NK, VI – Groupe du r´ecepteur mannose du macro- phage, VII – Prot´eines REG, VIII – Groupe de la chondrolectine, IX – Groupe de la t´etranectine, X – Polycystine 1, XI – Attractine, XII – EMBP, XIII – DGCR2, XIV – Groupe de la thrombomoduline, XV – Bimlec (CD302), XVI – SEEC, XVII - CBCP.Adapt´e de [16] avec permission de«John Wiley
& Sons, Inc.».
DC-SIGN (1k9i) CTLD1 de MRC2 (5AO5)
ASGR (1dv8) MBP-A (2msb)
A
B
β1 β2 β3 β4
β5
β1 β2
β3 β4
α1 β5
α2 α1
α2
β1' β1'
C0'
C0 C1
C4 C3
C2
C0 C0'
C4
C2 C3
C1
Figure1.7 – Structure des C-Type Lectin Domains (CTLD). (A) Structure 3D de deux CTLD cano- niques : DC-SIGN (PDB : 1k9i, `a gauche) et le CTLD1 de MRC2 (PDB : 5AO5, `a droite). La r´egion
«long loop»est en bleue, les ponts disulfures en orange. Le pont C0-C0’ est sp´ecifique des CTLD dits
«long form». (B) Sites de fixation du calcium dans les CTLD. Deux CTLD repr´esentatifs montrent quatre emplacements typiques des ions calcium dans le CTLD : le r´ecepteur aux asialoglycoprot´eines (`a gauche) et la «mannose binding protein-A» (`a droite). Les ions Ca2+ sont des sph`eres noires, la num´erotation des sites se fait selon la nomenclature cit´ee dans [16], dont la figure est adapt´ee, avec permission de «John Wiley & Sons, Inc.».
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.2. PROPRI ´ET ´ES STRUCTURALES
les domaines CTLD, except´e le CTLD5 et le CTLD7. Les cyst´eines impliqu´ees dans ce pont surnum´eraire sont alors num´erot´ees C0-C0’.
Une proportion importante des structures cristallines obtenues `a ce jour pour des CTLD incluent dans leur structure un ou plusieurs ions calcium : quatre sites possibles ont ´et´e recens´es pour ces ions (Fig. 1.7-B). Dans un CTLD donn´e, de z´ero `a trois sites peuvent ˆetre occup´es par un ion calcium. Les sites 1, 2 et 3 sont situ´es au sommet de la structure, entour´es par la «long loop», alors que le site 4 est situ´e sur l’un des cot´es.
Ces quatre sites de liaison du calcium ont un rˆole structural. Par exemple, lorsqu’un ion calcium est pr´esent dans le site 4, il permet la formation d’un pont salin entre l’h´elice α2 et le feuillet centralβ1/β5, ces ´el´ements structuraux essentiels des CTLD sont alors stabilis´es. En absence de calcium, la conformation du CTLD change, ce qui va moduler sa stabilit´e structurelle, la liaison de ses ligands, et sa sensibilit´e `a la prot´eolyse [16].
C’est le cas de la t´etranectine, une prot´eine trim´erique que l’on peut retrouver dans le s´erum humain et qui lie le plasminog`ene, l’active, et r´egule la prot´eolyse de la matrice extracellulaire pendant le d´eveloppement. En pr´esence de calcium, les sites 1 et 2 de la t´etranectine sont occup´es, alors que dans la forme apo, lalong loop perd sa compacit´e, et de multiples changements conformationnels s’effectuent, y compris une isom´erisation d’une proline conserv´ee de cis `atrans [19].
1.2.3 Formes solubles de PLA2R1
Deux ARNm codent pour PLA2R1 chez l’homme : l’un code pour une forme mem- branaire, l’autre code pour une forme tronqu´ee en C-terminal, contenant uniquement la r´egion extracellulaire [10]. Ce deuxi`eme ARNm est g´en´er´e `a partir d’un site de poly- ad´enylation alternatif pr´esent dans un intron et avant l’´epissage de l’ARNm primaire.
Dans la prot´eine soluble cod´ee par cet ARNm, le dernier domaine, le CTLD8, est tron- qu´e. La pr´esence de cette prot´eine soluble chez l’homme reste `a d´emontrer. Ce point sera d´etaill´e dans la partie r´esultats, dans le chapitre 4.1.
Chez la souris, aucun transcrit codant pour la forme soluble n’a ´et´e retrouv´e, pour- tant une prot´eine soluble circulante est d´etect´ee dans le s´erum [20]. Le r´ecepteur mem- branaire de souris transfect´e dans des cellules CHO est prot´eolys´e, et une forme soluble s’accumule dans le milieu de culture [21]. Cette prot´eolyse est inhib´ee par l’EDTA et le BB2516 (un inhibiteur `a spectre large des m´etalloprot´eases), mais pas par les inhi- biteurs p-APMSF, la leupeptine ou la pepstatine A, qui inhibent respectivement les prot´eases `a s´erine, `a cyst´eine, et `a aspartate. Ces r´esultats indiquent que le r´ecepteur PLA2R1 de souris est prot´eolys´e par une ou plusieurs enzymes de la famille des m´etal- loprot´eases. A ce jour, la ou les enzymes responsables de cette prot´eolyse de mPLA2R1 ne sont pas identifi´ees.
Des formes solubles de certains paralogues de PLA2R1 ont d´ej`a ´et´e d´ecrites. Une forme soluble du r´ecepteur mannose du macrophage de la souris, contenant toute la r´egion extracellulaire et lib´er´ee apr`es prot´eolyse par une m´etalloprot´ease non identifi´ee, est pr´esente dans le milieu de culture de macrophages de souris en culture, ainsi que dans le s´erum de souris [22]. R´ecemment, une forme soluble de MRC1 ´equivalente a
´et´e identifi´ee dans le s´erum humain [23]. De mˆeme, une forme soluble de MRC2 a ´et´e d´ecrite dans le s´erum humain peu apr`es le d´ebut de cette th`ese [24]. Leurs fonctions sp´ecifiques seront d´ecrites au chapitre 1.4.5.
1.3 Propri´ et´ es de liaison de PLA2R1
La partie extracellulaire du r´ecepteur PLA2R1 est donc constitu´ee d’un domaine CysR, d’un domaine FNII et de 8 domaines CTLD distincts. Depuis sa d´ecouverte, diff´erents ligands ont ´et´e identifi´es pour PLA2R1, et des ´etudes utilisant des mutants de d´el´etion ont permis de mettre en ´evidence les domaines qui contribuent `a ces liaisons.
Les propri´et´es de liaison du domaine CysR de PLA2R1 restent inconnues. Ce do- maine, dans MRC1, reconnait le N-acetylgalactosamine sulfat´e que l’on retrouve dans certaines hormones comme l’hormone lut´einisante et la thyr´eostimuline [25, 12]. Tou- tefois, le brin β11 de MRC1, responsable de cette propri´et´e, est peu conserv´e avec PLA2R1, ce qui rend peu probable une telle fonction pour PLA2R1 [26].
D`es 1995, il a ´et´e ´etabli que le domaine FNII de PLA2R1 participe `a l’adh´esion de cellules HEK293 exprimant ce dernier aux collag`enes de type I et de type IV [27].
En effet, ces cellules adh`erent mieux aux boˆıtes de culture dont le fond est trait´e avec ces types de collag`ene lorsqu’elles expriment la forme compl`ete de rbPLA2R1, mais cette meilleure adh´erence n’est pas conf´er´ee par l’expression d’un mutant de d´el´etion d´epourvu des domaines CysR et FNII. Cette augmentation est sp´ecifique car l’ajout d’un exc`es de forme soluble de PLA2R1 dans le milieu de culture abolit cette adh´esion [27]. Une ´etude r´ecente confirme, grˆace `a diff´erents mutants de d´el´etion de hPLA2R1 et de mPLA2R1 que l’acteur principal de cette adh´esion augment´e est bien le domaine FNII [28]. Ce domaine tr`es conserv´e parmi les paralogues de PLA2R1 est ´egalement responsable de la liaison au collag`ene et `a la g´elatine dans les prot´eines MRC1 [29]
et MRC2 [30], la fibronectine (une prot´eine impliqu´ee dans l’adh´esion cellulaire qui lie le collag`ene et les int´egrines, [31]) et des MMP-2 et MMP-9 (des m´etalloprot´eases matricielles participant `a la d´egradation et au remodelage de la matrice extracellulaire, [32]).
1.3.1 Propri´ et´ es de liaison des CTLD de PLA2R1
Les domaines CTLD constituent une vaste superfamille, et leurs ligands sont tr`es h´et´erog`enes : certains ont une activit´e lectine et lient des sucres, d’autres des prot´eines, des lipides ou mˆeme des ligands inorganiques (voir chapitre 1.3.2). Concernant les CTLD de PLA2R1, plusieurs ligands ont ´et´e identifi´es `a ce jour. Certains d´ependent d’une activit´e lectine de ces domaines, d’autres impliquent une interaction prot´eine- prot´eine.
L’activit´e lectine des domaines CTLD d´epend de diff´erents d´eterminants structu- raux qui permettent l’interaction avec des sucres ou avec un ion calcium qui stabilise cette interaction. En particulier, la pr´esence de motifs `a des positions cl´es dans la«long loop»est bien ´etudi´ee, mais ne suffit pas `a pr´edire avec certitude si un CTLD lie des sucres ou non [16]. Ainsi, chez l’homme, le lapin et la souris, aucun des CTLD de PLA2R1 ne comporte dans sa long loop les motifs attendus pour la liaison de sucres.
Pourtant, la prot´eine PLA2R1 de lapin reconnait avec une haute affinit´e, de l’ordre du nM, l’albumine de s´erum bovin (BSA) coupl´ee `a du mannose, du galactose ou de la N-acetylglucosamine, et ce, aussi bien en absence ou en pr´esence de calcium [7, 33].
Des mutants de d´el´etion ont montr´e que cette reconnaissance est principalement due au CTLD4 [34]. De mani`ere intrigante, cette liaison de la BSA conjugu´ee `a des sucres ne se retrouve ni pour le r´ecepteur mPLA2R1 exprim´e de mani`ere endog`ene par une li- gn´ee cellulaire de fibroblastes embryonnaires de NIH 3T3, ni pour le r´ecepteur PLA2R1 humain exprim´e dans des cellules CHO transfect´ees. On sait que les domaines CTLD1
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.3. PROPRI ´ET ´ES DE LIAISON
et CTLD2 de hPLA2R1 et mPLA2R1 contribuent `a la liaison du collag`ene, dont le domaine FNII voisin est le principal responsable [28], mais il n’est pas ´etabli si cette participation d´epend d’une activit´e lectine.
L’activit´e lectine des CTLD d´epend fr´equemment de la coordination d’un ion cal- cium, en particulier au site 2 (voir chapitre1.2.2). Puisqu’aucun CTLD de PLA2R1 n’a
´et´e cristallis´e `a ce jour, l’inclusion ou non de calcium dans chacun des 4 sites potentiels n’est pas connue pour le moment. En tout cas, l’analyse pr´edictive de la s´equence des CTLD de PLA2R1 ne montre pas les d´eterminants structuraux connus pour favoriser la liaison d’un ion calcium au site 2.
Parmi les paralogues de PLA2R1, certains domaines CTLD de MRC1 et MRC2 pr´e- sentent des activit´es lectines document´ees. C’est le cas du domaine CTLD4 de MRC1, qui est responsable de la reconnaissance d´ependante du calcium de la BSA coupl´ee au mannose, au fucose, et au N-acetylglucosamine [35], grˆace aux motifs «EPN» et
«WND»pr´esents dans sa long loop. La reconnaissance des mˆemes ligands par MRC2 est ´egalement due `a une activit´e lectine d´ependante du calcium, mais elle est due au CTLD2 [36]. Cette activit´e lectine participe aussi `a la liaison par le r´ecepteur des col- lag`enes glycosyl´es (comme le collag`ene de type IV). Le domaine CTLD1 de MRC2, lui, contribue `a la reconnaissance des collag`enes non glycosyl´es (comme celui de type I) [37].
Liaison des sPLA2 par PLA2R1
Historiquement, PLA2R1 a ´et´e d´ecouvert pour ses propri´et´es de liaison des sPLA2 de venin OS1 et OS2 pr´esentes dans le venin du serpent Oxyuranus scutellatus scu- tellatus [5]. Il a ´et´e d´emontr´e grˆace `a des mutants de d´el´etion de rbPLA2R1 que la reconnaissance des sPLA2 est majoritairement due au CTLD5 de PLA2R1 (bien que le CTLD4 et CTLD6 y contribuent ´egalement) qu’elle ne n´ecessite pas la glycosylation de la sPLA2, et qu’elle est ind´ependante du calcium [34]. Il s’agit donc d’une interaction prot´eine-prot´eine et non d’une interaction due aux propri´et´es lectine de rbPLA2R1. La sPLA2 OS1 se lie `a PLA2R1 avec une affinit´e de l’ordre de 0.1 nM chez le bœuf, le rat, la souris, le lapin, ou encore le poulet ou le x´enope. Cependant, son affinit´e apparaˆıt plus faible sur le r´ecepteur recombinant humain, de l’ordre du nM [10].
PLA2R1 peut ´egalement lier des sPLA2 de mammif`eres. Aujourd’hui, 12 g`enes codant pour des sPLA2s distinctes ont ´et´e identifi´es chez les mammif`eres. Certaines lient PLA2R1 et d’autres non. Les propri´et´es de liaison des r´ecepteurs PLA2R1 aux sPLA2 de mammif`eres sont tr`es diff´erentes selon les esp`eces [33], et il est important de rechercher les propri´et´es de liaison «physiologiques, «endog`enes » de PLA2R1, c’est
`
a dire entre des sPLA2 et le r´ecepteur PLA2R1 provenant de la mˆeme esp`ece. Ainsi, le r´ecepteur de lapin lie des sPLA2 de souris et humaines, mais on ne connait pas ses propri´et´es de liaison pour ses propres sPLA2 de lapin. Par contre, le r´ecepteur de souris lie 7 des 12 sPLA2de souris connues (Table1.1, [38]). Inversement, le r´ecepteur humain ne semble lier que 3 sPLA2 : hGIIE, hGIIF et hGIII, dont deux conserv´ees avec la souris (Table1.1). Enfin, le r´ecepteur PLA2R1 de poulet, aussi appel´e«FcRY», lie OS1. On ne connait par contre pas ses propri´et´es de liaison pour les sPLA2 de poulet. De fa¸con remarquable, il lie les IgY de poulet et participe `a la transcytose de ces derni`eres dans l’embryon de poulet [39].
Les CTLD de PLA2R1 ne sont pas les seuls CTLD `a lier des sPLA2. En effet, des inhibiteurs pr´esents dans le serum de serpent appel´es PLI-α (pour PhosphoLipase Inhibibitor) sont des prot´eines circulantes qui prot`egent les serpents contre leur propre venin. Ces inhibiteurs contiennent des CTLD qui bloquent l’action catalytique et/ou
IC50 (nM)
sPLA2 Human PLA2R1 Mouse PLA2R1
OS1 4 0.1
bee-venom PLA2 >1000 >1000
hGIB >500 0.9
hGIIA >500 6
hGIID >500 >500
hGIIE 45 0.15
hGIIF 4 0.15
hGIII 8 9.5
hGV 740 >500
hGX >500 5
hGXIIA >500 >500
hGXIIB >500 >500
Table 1.1 – Propri´et´es de liaison de diff´erentes sPLA2 par les r´ecepteurs PLA2R1 humains et de souris. La plupart des sPLA2 humaines recombinantes ne lient pas le r´ecepteur PLA2R1 humain recombinant.D’apr`es Boilard et al. en pr´eparation.
toxique des sPLA2. D’un point de vue ´evolutif, ils sont plus proches des collectines que de la famille de PLA2R1 [16]. Leurs liaisons respectives des sPLA2 est donc un exemple de convergence ´evolutive.
1.3.2 Autres ligands de prot´ eines de la famille des CTLD
Les propri´et´es de liaison et les fonctions des membres de la superfamille des CTLD sont tr`es diff´erentes d’un domaine `a l’autre. La fonction physiologique associ´ee `a la majorit´e des CTLD implique la liaison de sucres. Cependant, certains CTLD lient des prot´eines non glycosyl´ees : le CTLD5 de PLA2R1, par exemple, lie les sPLA2 par une liaison prot´eine-prot´eine [34]. D’autres CTLD lient des lipides : c’est le cas des prot´eines du surfactant pulmonaire A et D, des collectines qui reconnaissent des lipides du surfactant [40]. D’autres encore peuvent lier des ligands inorganiques [16], comme les prot´eines «antigel» de poisson, qui peuvent lier les germes de cristaux de glace et empˆecher leur croissance. Certaines prot´eines contrˆolent ´egalement la croissance des cristaux de carbonate de calcium, comme la prot´eine ansocalcine chez l’oie qui induit la formation de cristaux dans la coquille d’œuf [41], ou la lithostatine, pr´esente dans le pancr´eas humain et qui empˆecherait la formation de calculs [42]. Les domaines peuvent aussi ˆetre multivalents et lier `a la fois des prot´eines et des sucres [43].
La reconnaissance des sucres est la propri´et´e la plus ´etudi´ee des CTLD. L’´el´ement structural qui semble contribuer le plus `a cette reconnaissance est la pr´esence de sites de liaison du calcium dans la prot´eine. Le site 2 (Fig.1.7-B) est particuli`erement impliqu´e dans cette reconnaissance des sucres. La capacit´e `a lier le calcium au site 2 d’un CTLD est contrˆol´ee par des d´eterminants structuraux tr`es ´etudi´es, dont la pr´esence dans une s´equence prot´eique permet de pr´edire de mani`ere assez fiable si un CTLD va reconnaitre les sucres de mani`ere d´ependante du calcium ou non. Ces d´eterminants sont un motif «WND»dans le brin β4, dans la poche du sommet du r´ecepteur, et les motifs«EPN»ou«QPD»dans la«long loop»[17]. De tels motifs sont pr´esents dans le CTLD4 de la prot´eine MRC1, et contribuent `a la coordination de l’ion calcium au
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.4. PROPRI ´ET ´ES FONCTIONNELLES
site 2 [35]. C’est cet ion qui va faire interface avec le mannose ou le galactose et assurer l’essentiel de leur liaison d´ependante du calcium. Il existe cependant des prot´eines qui contiennent de tels sites mais dont aucune activit´e lectine n’a pas pu ˆetre d´emontr´ee : c’est le cas du CTLD de la t´etranectine, dont la structure contient les sites 1 et 2 mais qui n’a pas d’activit´e lectine. Inversement, leur absence ne garantit pas qu’un CTLD ne puisse pas lier de sucres. En effet, la prot´eine PLA2R1 du lapin lie la BSA quand elle est coupl´ee `a du mannose, du galactose, ou du N-acetyl-D-glucosamine, et ce de fa¸con ind´ependante du calcium [7]. Comme dans le cas de MRC1, cette liaison semble principalement due au CTLD4, toutefois, ni le CTLD4 ni aucun autre CTLD de rbPLA2R1 ne contiennent les motifs attendus. De mani`ere coh´erente, la liaison des sucres par rbPLA2R1 est ind´ependante du calcium [7, 34]. Parfois mˆeme, la liaison du calcium et la reconnaissance des sucres s’excluent mutuellement, comme pour la t´etranectine. Seule sa forme apo peut lier le plasminog`ene, cette liaison ne se fait plus lorsque les sites 1 et 2 sont occup´es par du calcium [44].
La d´ependance au calcium de la structure d’un CTLD et son ´eventuelle activit´e lec- tine influe dramatiquement sur la fonction physiologique d’un r´ecepteur. Elle entraine une r´eversibilit´e de la liaison au CTLD suivant la concentration de calcium, et fournit un m´ecanisme qui contrˆole finement les changements conformationnels et les propri´et´es de liaison de la prot´eine dans sa fonction cellulaire, par exemple lors de cycles d’inter- nalisation ou de transcytose (cf FcRY, etc). Par exemple, lorsque le r´ecepteur mannose du macrophage est expos´e `a la membrane, il est en pr´esence de calcium, `a pH neutre, et son CTLD4 peut reconnaitre les prot´eines mannosyl´ees. Lorsque le r´ecepteur lie un ligand, il est internalis´e vers les endosomes. L`a, la baisse de pH provoque la perte du calcium, ce qui induit un changement de conformation du CTLD et la lib´eration du ligand. Le ligand sera d´egrad´e alors que le r´ecepteur sera recycl´e `a la surface cellulaire [45].
1.4 Propri´ et´ es fonctionnelles de PLA2R1
1.4.1 PLA2R1 poss` ede des propri´ et´ es d’endocytose
PLA2R1 est un r´ecepteur internalis´e de mani`ere rapide vers les endosomes, via des v´esicules tapiss´ees de clathrine [46]. La prot´eine PLA2R1 de lapin est internalis´ee grˆace
`
a un motif tyrosine consensus NPXY, similaire `a ceux retrouv´es dans le r´ecepteur au LDL (lipoprot´eines de basse densit´e), le r´ecepteur `a la transferrine ou laβ-APP, et un motif de type di-leucine [46] en aval d’un acide amin´e charg´e n´egativement (Fig.1.5) – ce type de motif est habituellement reconnu par le complexe adaptateur d’internalisation AP2.
Comme PLA2R1, MRC1, MRC2 et LY75 sont des r´ecepteurs constitutivement inter- nalis´es et recycl´es avec des cin´etiques rapides, pr´esentant ´egalement les motifs consensus tyrosine et di-leucine (Fig.1.5). Ces r´ecepteurs sont principalement internalis´es vers les endosomes, puis recycl´es `a la membrane [26], `a l’exception de LY75 qui serait adress´e aux endosomes tardifs et aux lysosomes avant son recyclage [15]. Une ´etude de liaison avec un anticorps monoclonal iod´e a montr´e que plus de 50 % des r´ecepteurs MRC2
`
a la membrane de fibroblastes humains sont internalis´es en moins de 2 minutes puis recycl´es `a la membrane plasmique, mais ´egalement que la prot´eine MRC2 a une demi- vie d’environ 24h [47]. A un instant donn´e, seuls 10 `a 30 % des r´ecepteurs seraient `a la surface de la cellule, le reste ´etant en cours de trafic dans des v´esicules intracellulaires.
1.4.2 Signalisation et partenaires de PLA2R1
La recherche des voies de signalisation de PLA2R1 se poursuit jusqu’`a aujourd’hui.
Les deux d´ecouvertes concomitantes en 2009 concernant l’implication de PLA2R1 dans la s´enescence cellulaire et son rˆole comme auto-antig`ene majeur dans la glom´erulo- n´ephrite extra-membraneuse auraient dˆu acc´el´erer nos connaissances de ces voies de signalisation. Pourtant, `a ce jour, nos connaissances sur les partenaires et la signalisa- tion de PLA2R1 restent tr`es incompl`etes.
La r´egion extracellulaire de PLA2R1 lie diff´erents ligands extracellulaires comme le collag`ene ou des prot´eines complex´es avec du mannose, du galactose ou de la N- acetylglucosamine [7,33]. Le r´ecepteur membranaire PLA2R1 lie ´egalement diff´erentes sPLA2 et cette propri´et´e se retrouve pour une forme soluble recombinante de PLA2R1 comprenant toute sa r´egion extracellulaire [48]. Une ´equipe japonaise a propos´e que PLA2R1 puisse transduire les effets des sPLA2 par l’activation de la cascade de signa- lisation cellulaire de la«Mitogen-Activated Protein Kinase»(MAPK, [49]). Toutefois,
`
a ce jour, les partenaires prot´eiques permettant `a PLA2R1 une telle transduction sont inconnus.
Aucun partenaire membranaire ou cytoplasmique de PLA2R1 n’a ´et´e identifi´e `a ce jour. De mˆeme, les m´ecanismes de signalisation auxquels PLA2R1 pourraient participer par une liaison directe restent inconnus. La r´egion cytoplasmique de PLA2R1 est courte, avec seulement 42 acides amin´es, ce qui laisse peu de place pour des motifs d’interactions avec des partenaires prot´eiques (Fig. 1.5). Au-del`a des motifs d’internalisation pr´edits et ´etudi´es, d´ej`a mentionn´es [46], PLA2R1 pr´esente dans sa partie cytoplasmique, en Ser-1456, un motif de phosphorylation par une cas´eine kinase pr´edit d`es le clonage de PLA2R1[7]. N´eanmoins une telle phosphorylation n’a jamais ´et´e mise en ´evidence, que ce soit chez l’homme ou dans une autre esp`ece. Une ´equipe fran¸caise, en collaboration avec notre ´equipe, a propos´e que PLA2R1 active dans certaines lign´ees cellulaires la voie JAK2 [50]. En effet, la kinase JAK2 semble colocaliser avec PLA2R1, mais cet effet est ind´ependant de la partie cytoplasmique de PLA2R1, et aucun m´ecanisme d’interaction directe n’a ´et´e montr´e `a ce jour.
1.4.3 Expression tissulaire de PLA2R1
Chez l’homme, PLA2R1 est fortement exprim´e dans le rein, en particulier dans des cellules ´epith´eliales tr`es diff´erenci´ees appel´ees podocytes [10, 51]. PLA2R1 est ´egale- ment exprim´e dans le poumon `a la surface de cellules ´epith´eliales alv´eolaires de type II et des macrophages alv´eolaires, par les cellules glandulaires de la thyro¨ıde, dans le pancr´eas et le placenta, ainsi que dans le cˆolon et les ovaires [10, 9, 52]. Chez la sou- ris, PLA2R1 est particuli`erement exprim´e dans les cellules ´epith´eliales alv´eolaires des poumons, certains lymphocytes dans la rate et dans le cˆolon [33, 20]. Chez le lapin, PLA2R1 est particuli`erement enrichi dans des myotubes en culture issus du muscle squelettique de nouveau-n´es [5]. L’embryon de lapin l’exprime dans ses cellules mus- culaires, ses reins et son cœur, mais cette expression est fortement diminu´ee `a l’ˆage adulte. On le retrouve aussi dans ses poumons, c’est ce tissu qui apparaˆıt le plus riche chez l’adulte [7].
1.4.4 Rˆ oles physiologiques et physiopathologiques de PLA2R1
Comme nous l’avons vu, les propri´et´es de liaisons des r´ecepteurs PLA2R1 sont dif- f´erentes selon les esp`eces [53,38]. PLA2R1 lie le collag`ene et diff´erentes prot´eines glyco-
CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.4. PROPRI ´ET ´ES FONCTIONNELLES
syl´ees, ce qui sugg`ere une fonction d’adh´esion. PLA2R1 reconnait ´egalement diff´erentes sPLA2 impliqu´ees dans l’inflammation et la prolif´eration cellulaire : PLA2R1 pourrait ˆetre un r´egulateur de ces processus physiologiques (cf ci-dessous). Ces multiples pro- pri´et´es font probablement de PLA2R1 un r´ecepteur multifonctionnel, capable sous sa forme membranaire de lier des ligands multiples et de les distribuer `a l’int´erieur de la cellule, et sous sa forme circulante de les distribuer dans le reste de l’organisme. Deux rˆoles suppl´ementaires ont ´et´e propos´es pour PLA2R1 en 2009 : l’un comme possible g`ene suppresseur de tumeur, l’autre dans la glom´erulon´ephrite extra-membraneuse (cf ci-dessous). Les propri´et´es de PLA2R1 et ses rˆoles propos´es sont synth´etis´es dans un article de revue dont je suis co-auteur, publi´e dans la revue M´edecine/Sciences, et qui est en annexe de ce manuscrit [54].
Rˆoles d´ependant des sPLA2
Les sPLA2 sont des prot´eines s´ecr´et´ees dans le milieu extracellulaire qui se re- trouvent dans de nombreux tissus chez les mammif`eres (11-12 g`enes distincts), et qui ont `a l’origine ´et´e identifi´ees en abondance dans les venins de serpent et d’insectes (les sPLA2 sont aussi pr´esentes dans diff´erents tissus de serpent ou d’insectes). Chez les mammif`eres, on peut retrouver des sPLA2 dans virtuellement tous les tissus, in- cluant les poumons, le pancr´eas, les intestins, le cerveau et le rein. Chaque sPLA2 a cependant sa propre localisation tissulaire et cellulaire et ses propres fonctions physio- logiques. De plus, selon les esp`eces, une mˆeme sPLA2 peut pr´esenter des diff´erences tr`es marqu´ees de distribution tissulaire voire de rˆoles physiologiques, ce qui complique l’´etude fonctionnelle des sPLA2 [33, 53,38].
Ainsi, le r´ecepteur de souris lie 7 sPLA2 de souris parmi les 12 produites `a ce jour [38] et la plupart des sPLA2 humaines (Table 1.1), ce qui renforce l’id´ee que les sPLA2 de mammif`eres sont bien des ligands naturels de PLA2R1. Le r´ecepteur humain lie les sPLA2 hGIIE, hGIIF, et le domaine PLA2 de hGIII, mais de mani`ere surprenante ne lie pas les sPLA2 de groupes IB et IIA humaines. Une telle disparit´e entre les esp`eces laisse supposer des rˆoles physiologiques diff´erents de PLA2R1 entre l’homme et la souris vis-`a-vis des sPLA2. Le CTLD5 de PLA2R1 est le principal responsable de la liaison des sPLA2, et ce CTLD est le plus divergent `a travers les esp`eces [34] : les diff´erences inter-esp`eces concernant ce domaine pourrait expliquer les diff´erents profils de liaison de PLA2R1.
Certaines fonctions physiologiques des sPLA2sont directement dues `a leurs activit´es catalytiques, et incluent par exemple la digestion des phospholipides alimentaires ou la d´efense contre les pathog`enes [2]. D’autres fonctions semblent ind´ependantes de l’action enzymatique des sPLA2 et seraient lier `a la liaison des sPLA2 `a PLA2R1. Ce dernier activerait certaines voies de signalisation cellulaire pour d´eclencher une stimulation de la prolif´eration, de la migration, une lib´eration d’hormones, de cytokines et de m´ediateurs lipidiques [53,49], par exemple par l’interm´ediaire des voies MAP-kinase et JAK2 d´ej`a mentionn´ees [49, 50]. Cependant, ces effets des sPLA2 passant ou non par PLA2R1 n’ont pas ´et´e confirm´es `a l’aide des souris invalid´ees pour le g`ene de PLA2R1 [49].
Un rˆole additionnel et oppos´e du r´ecepteur PLA2R1 a ´et´e propos´e : il pourrait agir comme inhibiteur de l’action des sPLA2 par plusieurs m´ecanismes. Le r´ecepteur membranaire a des propri´et´es d’endocytose et il est capable d’internaliser les sPLA2 et d’induire leur d´egradation dans les lysosomes, alors que le r´ecepteur est recycl´e vers la surface [10, 46, 55]. La liaison des sPLA2 au r´ecepteur membranaire et soluble inhibe directement leur action [27]. La forme soluble de PLA2R1 retrouv´ee chez l’homme et la
