Thérapies ciblées du cancer pulmonaire : tests moléculaires à partir d’échantillons cytologiques

M. Pusztaszeri J.-C. Pache N. Mach P. M. Soccal T. McKee

introduction

Le cancer du poumon est l’affection tumorale qui fait le plus de victimes dans le monde tant chez l’homme que chez la femme. Le carcinome non à petites cellules (CNPC), catégorie constituée majoritairement par l’adénocarcinome, représente environ 80% des cancers pulmonaires.^1,2 Lors du diagnostic, environ 70% des patients présentent une maladie locale­

ment avancée et/ou métastatique et ne sont pas opérables.

Parmi les patients opérables, la majorité développera une récidive.

Au cours de la dernière décennie, d’importants progrès thérapeutiques ont été réalisés avec le développement et l’application de nouvelles thérapies ciblant des voies de signalisation impliquées dans la croissance et la survie des cel­

lules cancéreuses (thérapies ciblées) et adaptées en fonction des caractéristi­

ques morphologiques et moléculaires de la tumeur (thérapies personnalisées).

Un nombre croissant d’agents ciblant ces voies de signalisation est actuelle­

ment disponible sur le marché ou en cours de développement. Il s’agit généra­

lement de petites molécules (par exemple : inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) : géfitinib, erlotinib et afatinib pour l’EGFR ; crizotinib pour ALK-EML4) agissant à l’intérieur de la cellule, ou d’anticorps monoclonaux (par exemple : cétuximab pour l’EGFR et bévacizumab pour le VEGF), agissant à l’extérieur de la cellule.

L’efficacité de ces thérapies ciblées dépend directement de l’état d’activation/

inactivation de ces voies de signalisation (et de leurs diverses molécules) dans les cellules tumorales ainsi que de l’affinité du médicament avec sa cible, influen­

cés par la présence de certaines mutations, en particulier de l’EGFR et du KRAS pour l’adénocarcinome. D’autres mécanismes d’activation (nombre augmenté de copies du gène et/ou surexpression de la protéine, comme l’HER­2/neu pour le cancer du sein) existent et peuvent également être recherchés en vue d’une thé­

rapie ciblée.¹ Dans cette revue, nous allons considérer uniquement les mutations, altérations dont l’impact clinique est le mieux défini.²

Targeted therapy in lung cancer : molecular testing using cytological specimens

Important advances in lung cancer treatment have been made over the last decade. Several drugs designed to target molecular path ways involved in cancer­cell growth and survival have been shown to be effective in a selec­

ted fraction (l 20%) of non­small cell lung cancer patients. Somatic mutations in several genes (i.e. : EGFR and KRAS) can predict pa­

tient’s response to targeted therapies. Those mutations are commonly detected on histo­

pathological samples (core­needle biopsy/

surgical resection). However, when tissue biop sies are not available, molecular testing has to be performed on cytological speci­

mens. Issues raised by molecular testing on cytological specimen are discussed in this arti cle.

Rev Med Suisse 2011 ; 7 :1486-90

D’importants progrès thérapeutiques ont été réalisés au cours de la dernière décennie pour le cancer pulmonaire. Des thé­

rapies ciblant les voies de signalisation impliquées dans la croissance et la survie des cellules tumorales ont démontré leur efficacité pour une fraction des patients (l 20%). L’effica­

cité de ces thérapies ciblées est influencée notamment par la présence de mutations de différents gènes impliqués dans les voies de signalisation (par exemple : EGFR, KRAS). La recher­

che de ces mutations avant traitement se fait idéalement sur du matériel histologique (biopsie/pièce opératoire). Néanmoins, en raison des nouvelles approches diagnostiques dont l’écho­

graphie endobronchique (EBUS), il y a une demande croissante pour la réalisation des tests moléculaires sur du matériel cyto­

logique. Cette application cytologique est discutée dans cet article.

Thérapies ciblées du cancer pulmonaire : tests moléculaires

à partir d’échantillons cytologiques

le point sur…

mutationscourantes dans lecarcinome non àpetitescellules

Les mutations les plus fréquemment retrouvées dans l’adénocarcinome pulmonaire sont mentionnées dans la fi­

gure 1.^2­4 Ces mutations sont généralement activatrices et mutuellement exclusives.²

Le gène EGFR, situé sur le bras court du chromosome 7 (7p11.2), comporte 28 exons et code pour une protéine transmembranaire comportant un site extra­membranaire (récepteur) et un domaine cytoplasmique avec une activi­

té tyrosine kinase.^1,5 L’EGFR fait partie de la famille de ré­

cepteurs tyrosine kinase HER/erbB comprenant quatre pro­

téines (EGFR/HER­1, HER­2/neu, HER­3, HER­4) avec une structure moléculaire similaire. La liaison du ligand avec l’EGFR entraîne une activation du système tyrosine kinase et une transduction du signal en aval contrôlant la prolifé­

ration, l’apoptose, l’angiogenèse, l’invasion tumorale et la métastatisation (figure 2).^1,6 Les mutations de l’EGFR sont présentes dans environ 10% des CNPC.^4,6 Elles sont plus fréquentes dans les adénocarcinomes (15­20%),⁴ en parti­

culier chez les patients de sexe féminin, non fumeurs et d’origine asiatique (environ 40­50%).^3­6 Elles sont associées à un meilleur pronostic (survie globale de 37 mois).^3,7 Il s’agit majoritairement de mutations des exons 18­21 avec dans 90% des cas des délétions de l’exon 19 (associées à 70­100%

de réponses aux TKI) ou des mutations ponctuelles dans l’exon 21 (associées à 20­70% de réponses aux TKI).^2,5 Les cellules cancéreuses avec ces mutations de l’EGFR ont une sensibilité augmentée aux TKI, d’une part, parce que leur survie dépend de cette voie de signalisation et, d’autre part, parce que les TKI ont vraisemblablement une plus grande affinité avec l’EGFR muté.

L’évaluation de l’efficacité potentielle des traitements anti­EGFR chez des patients avec un CNPC est malheureu­

sement compliquée du fait qu’il existe de nombreuses mutations différentes de l’EGFR. Certaines mutations de l’EGFR comme T790M (primaire ou secondaire), en dimi­

nuant l’affinité du médicament avec l’EGFR, prédisent à l’inverse une résistance à la thérapie. Par ailleurs, une ré­

sistance acquise s’observe chez les patients après traite­

ment par des anti­EGFR de type TKI, due au développe­

ment de nouvelles mutations (par exemple : T790M).^1,2,8 Des

anti­EGFR de deuxième génération sont en cours d’éva­

luation clinique pour ces patients.⁹

KRAS est une GTPase qui se trouve en aval de la voie de signalisation d’EGFR (figure 2). Bien qu’il s’agisse de la mutation la plus fréquente (25­30%),⁴ il n’existe pour l’ins­

tant pas de thérapie ciblée pour KRAS. Typique chez les patients fumeurs, elle est associée à une résistance aux anti­

EGFR et à un mauvais pronostic (survie globale de quinze mois).^3,7

Les mutations du gène BRAF (par exemple : V600E), codant pour une kinase située immédiatement en aval de KRAS dans la voie de signalisation, se retrouvent dans en­

viron 3% des adénocarcinomes avec EGFR et KRAS non mutés.⁴ Elles sont aussi associées à une résistance aux anti­

EGFR. Des inhibiteurs sélectifs de BRAF (par exemple : PLX4032) sont en cours d’évaluation.^4,10

Le gène de fusion ALK-EML4(Anaplastic lymphoma recep- tor tyrosine kinase-Echinoderm microtubule-associated protein-like 4) sur le chromosome 2p est présent dans environ 3­7% des adénocarcinomes. Ces cancers ne répondant pas non plus aux TKI.^7,11 La recherche de cette altération moléculaire rare sera peut­être généralisée sous réserve de la confir­

mation des résultats encourageants sur l’efficacité d’un inhi­

biteur sélectif des récepteurs tyrosine kinase ALK et MET/

HGF et leurs variantes oncogéniques (crizotinib).

Certaines mutations peuvent être associées à une mor­

phologie et/ou à des sous­types histologiques particuliers d’adénocarcinomes (tableau 1).⁹ De ce fait, les mutations les plus probables et à rechercher en priorité pourraient être prédites sur la base de la morphologie de l’adénocar­

cinome.

diagnosticettypisationtumorale

surlesspécimens cytologiques

A l’ère des thérapies ciblées, un diagnostic générique de CNPC est devenu insuffisant pour la prise en charge thérapeutique et le cytopathologiste doit pouvoir, si pos­

sible, trancher entre l’adénocarcinome et le carcinome épi­

dermoïde. En effet, ce dernier n’est pas éligible pour une Figure 1. Profil mutationnel des adénocarcinomes

pulmonaires

Pas de mutation décelable 40%

KRAS 25-30%

EGFR 15-20%

ELM4-ALK 3-7%

BRAF 3%

Autres 10% (CTNNB1 (bêtacaténine), PIK3CA, MEK, HER-2, PTEN)

Figure 2. Voie de signalisation de l’EGFR

(source : http://healthcare.sourcebioscience.com/diagnostic-tests/egfr).

thérapie ciblée anti­EGFR et anti­VEGF (bévacizumab) com­

me l’adénocarcinome ; il existe sous bévacizumab, un risque d’hémorragie pulmonaire fatale chez les patients avec un carcinome épidermoïde (souvent central et massif).^2,9,12,13 L’immunocytochimie à l’aide de plusieurs anticorps (par exemple : TTF­1, p63, cytokératines 7 et 5/6), utilisée de manière complémentaire sur des frottis cytologiques déjà colorés et/ou sur des cell-blocks, permet dans la majorité des cas de faire pencher la balance d’un côté ou de l’autre lors­

que la morphologie du CNPC est ambiguë. Les adénocar­

cinomes pulmonaires sont typiquement positifs pour TTF­1 et les cytokératines 7 et sont négatifs pour p63 et les cyto­

kératines 5/6. Les carcinomes épidermoïdes ont typique­

ment le profil inverse.¹³ Néanmoins, cette sous­typisation à partir d’un nombre limité de cellules tumorales soulève le problème de la représentativité et de l’hétérogénéité tumorale sur le plan morphologique mais également molé­

culaire (par exemple : mutations). Les carcinomes adéno­

squameux (au moins 10% de l’une des deux composantes en histologie) existent mais sont rares. Une fois le diagnos­

tic d’adénocarcinome (ou de CNPC compatible avec un adénocarcinome) posé, la réalisation de tests moléculaires (EGFR, KRAS, autres) peut être entreprise.

utilisationdeséchantillons cytolo

-

giques pourles testsmoléculaires

Les échantillons histologiques obtenus par biopsies trans pariétales/transbronchiques ou par résection chirurgi­

cale sont le plus souvent utilisés et sont adéquats pour tester les mutations spécifiques en vue d’une thérapie ci­

blée.¹² Toutefois, chez un nombre croissant de patients susceptibles de bénéficier d’une thérapie ciblée, seul du matériel cytologique est disponible pour le diagnostic de la tumeur et pour les tests moléculaires. Selon le cas, il peut s’agir de matériel provenant de l’épanchement pleural/pé­

ricardique, de l’aspiration ou du brossage bronchique, du lavage bronchoalvéolaire (LBA), de la ponction à l’aiguille

fine (21­22G) de la masse pulmonaire ou de la cytoponc­

tion transbronchique d’adénopathies (Transbronchial needle aspiration – TBNA ) guidée ou pas par ultrasons (Endobron- chial-ultrasound – EBUS). Cette dernière technique, apparue dès 2007 dans les algorithmes européens de stratégies diagnostiques,¹⁴ remplace progressivement la médiasti­

noscopie pour le diagnostic et le staging initial des cancers pulmonaires.^5,15

Plusieurs études récentes ont montré que la faisabilité et la sensibilité de ces analyses (EGFR, KRAS, BRAF et PIK3CA) sont aussi bonnes sur du matériel cytologique qu’histologique.1,5,6,15,16 Tous les types de préparation cy­

tologique sont potentiellement utilisables (frottis, cytospin, cell-blocks), en particulier les cell-blocks. La proportion de cas ou le matériel cytologique est insuffisant pour les analyses moléculaires est globalement inférieure à 25% mais varie beaucoup en fonction du type de prélèvement (nettement moindre pour les épanchements et le TBNA­EBUS que pour les aspirations bronchiques et les LBA).^5,6,15 L’évalua­

tion immédiate du matériel par le cytopathologiste lors des prélèvements (Rapid on-site evaluation – ROSE), applicable en particulier pour le TBNA­EBUS, permet de s’assurer que le matériel soit qualitativement et quantitativement suffi­

sant tant pour le diagnostic que pour les analyses complé­

mentaires nécessaires (immunocytochimie et tests molé­

culaires). Elle permet ainsi d’éviter les complications et les coûts liés à un nombre élevé de prélèvements, voire la ré­

pétition d’une procédure diagnostique.

Une étude a montré que le matériel provenant de lames cytologiques colorées de manière standard (Papanicolaou) se prêtait même mieux à l’analyse des mutations d’EGFR par PCR (Polymerase chain reaction) que le matériel provenant de biopsies. Ceci pourrait être expliqué par une meilleure conservation de l’ADN dans le méthanol (cytologie) que dans le formol (histologie).¹

Néanmoins, la faisabilité de ces analyses sur du maté­

riel cytologique doit être évaluée de cas en cas, car elle dé­

pend de l’abondance et surtout de la proportion de cel­

lules tumorales. En effet, contrairement à l’histologie où la zone tumorale peut être adéquatement sélectionnée, en cytologie, les cellules tumorales sont mélangées aux diffé­

rentes cellules bénignes (population hétérogène de cel­

lules), ce qui a pour effet de «diluer» l’échantillon et donc de diminuer la sensibilité des analyses.

Les méthodes les plus fréquemment utilisées pour dé­

terminer les mutations d’EGFR ou de KRAS sont la RT­PCR et le séquençage.² Le séquençage direct permet de détec­

ter toutes les mutations possibles dans les exons mais la technique est moins sensible que la RT­PCR et elle est li­

mitée par la présence des cellules non néoplasiques.^1,6 La RT­PCR utilise des oligonucléotides (primers) qui se lient spécifiquement aux régions bordant les mutations les plus fréquentes lorsqu’elles sont présentes. Cette méthode est très sensible mais elle ne permet de détecter que les mu­

tations connues, qui sont aussi les plus fréquentes. Elle ne permet pas de détecter des mutations rares ou qui n’ont pas encore été documentées.

Idéalement, il faut au moins une centaine de cellules tumo rales avec une proportion de cellules tumorales/non tumorales supérieure à 25% pour pouvoir procéder à une Type de mutation/ Sous-type histologique

altération d’adénocarcinome

EGFR Adénocarcinome bien différencié, avec composante bronchioloalvéolaire non mucineuse, papillaire et/ou micro- papillaire

KRAS Adénocarcinome (bronchioloalvéolaire ou non) de type mucineux

BRAF Adénocarcinome papillaire

ELM4-ALK Adénocarcinome de type solide et/ou avec composante à cellules isolées CTNNB1 Adénocarcinome à cellules claires (Bêtacaténine) ou de type fœtal

Tableau 1. Association possible entre le type d’alté- ration génétique et le sous-type d’adénocarcinome pulmonaire

recherche de mutation de l’EGFR ou de KRAS. Certaines études ont réussi à mettre en évidence des mutations dans des échantillons avec seulement 30 cellules tumorales ou avec une proportion de cellules tumorales de 1% en utili­

sant des techniques encore plus sensibles (High resolution melting analysis – HRMA) ou PNA­LNA (Peptide nucleic acid-Loc- ked nucleic acid – PCR).^1,17 Globalement, la qualité de l’ADN semble être plus importante que sa quantité (nombre de cellules tumorales).¹

Une dissection manuelle peut augmenter la sensibilité de l’analyse en augmentant la proportion de cellules tumo­

rales. Alternativement, une microdissection au laser peut être utilisée dans les cas où une dissection manuelle ne permet pas d’obtenir une proportion de cellules tumorales suffisante (25%). Cependant, en raison des coûts élevés des analyses et du délai supplémentaire dans la disponibilité des résultats, cette méthode reste encore peu accessible et donc limitée en pratique clinique.

Dans un certain nombre de cas, le matériel reste quan­

titativement et/ou qualitativement insuffisant et un nouveau prélèvement histologique ou cytologique doit être réalisé pour pouvoir effectuer ces analyses.

conclusion

La détermination du type de CNPC ainsi que les ana­

lyses moléculaires sont maintenant indispensables pour pouvoir offrir les meilleurs traitements aux patients. L’amé­

lioration des techniques non (ou minimalement) invasives permet d’obtenir des prélèvements de matériel tumoral, le plus souvent sous la forme de prélèvement cytologique.

Il est donc impératif de disposer des techniques permet­

tant d’exploiter le matériel prélevé pour orienter le diag­

nostic et le choix thérapeutique. Les tests moléculaires des CNPC du poumon (en particulier d’EGFR et de KRAS) peuvent être effectués aussi bien à partir d’échantillons cyto logiques qu’histologiques. Néanmoins, les spécimens cytologiques doivent contenir un nombre et une propor­

tion suffisants de cellules tumorales pour permettre ces analyses. La ROSE, si elle est disponible, permet d’optimi­

ser les chances d’obtenir un matériel quantitativement et qualitativement suffisant à la fois pour le diagnostic et pour les tests moléculaires. Différentes techniques (dissection manuelle et microdissection au laser) permettent d’aug­

menter la proportion de cellules tumorales.

Bien que les mutations de l’EGFR fassent actuellement partie des tests moléculaires courants pour le CNPC, d’au­

tres cibles thérapeutiques potentielles sont en cours d’in­

vestigation (par exemple : BRAF, HER­2, c­KIT,). Il est donc très probable que le nombre et la diversité de ces ana­

lyses moléculaires augmentent dans le futur, globalement mais aussi pour chaque cas individuel. A terme, l’utilisation optimale des échantillons cytologiques devrait permettre d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier d’une thérapie ciblée basée sur la/les anomalie(s) moléculaire(s) détectée(s). L’amélioration des techniques de laboratoire ainsi que l’identification de nouveaux facteurs pronostics/

prédictifs de réponse aux traitements seront les prochains défis pour augmenter encore l’efficacité de la prise en charge des patients souffrant de cancers pulmonaires.

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Bibliographie

Implications pratiques

Les thérapies ciblées font maintenant partie des options thé- rapeutiques pour les patients avec un cancer pulmonaire, en particulier de type adénocarcinome

Les mutations de certains gènes, en particulier EGFR, sont des facteurs prédictifs de réponse aux thérapies ciblées La recherche de ces mutations peut se faire aussi bien sur du matériel cytologique que sur du matériel histologique Néanmoins, les spécimens cytologiques doivent contenir un nombre et une proportion suffisants de cellules tumorales pour permettre ces analyses

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Drs Marc Pusztaszeri, Jean-Claude Pache et Thomas McKee

Service de pathologie clinique

Département de médecine génétique et de laboratoire Dr Nicolas Mach

Service d’oncologie Dr Paola M. Soccal Service de pneumologie

Département des spécialités de médecine Dr Paola M. Soccal

Service de chirurgie thoracique Département de chirurgie HUG, 1211 Genève 14 Marc.Pusztaszeri@hcuge.ch Jean-Claude.Pache@hcuge.ch Thomas.A.Mckee@hcuge.ch Nicolas.Mach@hcuge.ch Paola.Soccal@hcuge.ch

Adresse

2009;27:4247-53.

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** à lire absolument