Adaptation et régulation du monocyte-macrophage pour la production de l'interleukine 1 et du "tumor necrosis factor" alpha

Thesis

Reference

Adaptation et régulation du monocyte-macrophage pour la production de l'interleukine 1 et du "tumor necrosis factor" alpha

BAUMBERGER, Christophe

Abstract Pas de résumé disponible.

BAUMBERGER, Christophe. Adaptation et régulation du monocyte-macrophage pour la production de l'interleukine 1 et du "tumor necrosis factor" alpha. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 1991, no. Sc. 2518

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:104913

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:104913

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1 / 1

Département de Médecine

FACULTÉ DE MÉDECINE Professeur J.-M. Dayer

ADAPTATION ET REGULATION DU MONOCYTE.MACROPHAGE POUR LA PRODUCTION DE L.INTERLEUKINE 1

ET DU TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA

THÈSE

présentée à la Faculté des Sciences de l'Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès Science, mention biochimique

par

Christophe, Léon BAUMBERGER de

Genève

Thèse n'2518

Genève

1 992

d'immnunologie

et

d'allergologie, Hôpital cantonal universitaire), J.-C. JATON, professeur ordinaire (Faculté de Médecine

-

Département de

biochimie médicale), S. EDELSTEIN, professeur ordinaire et répondant devant la Faculté des Sciences (Département de biochimie) et J.-P. MACH, professeur associé (Institut de biochimie, Lausanne), autorise I'impression

de la présente thèse, sans exprimer d'opinion sur les propositions qui y

sont énoncées.

Genève, le 16 décembre l99l

Thèse -

2518

Le

Doyen, Pierre BURI

meilleur ^{dt eux-mêmes.}

À Dominique, donL ^J-a patience, I.e soutien

et

Ia

compréhension m'ont accompagné au long de ce

travail et

^m'ont pernis de

le

mener à ^terme.

A Luc-Alain, un maçFrifique rayon de so1eil.

Au Professeur J.-M. Dayer, gui m'a guidé avec compétence tout au long de ce travail réalisé dans son

laboratoire. Je le remercie de sa ^constante

disponibilité, de son soutien constructif et de son

esplit critique. ^,Je le remercie de m'avoir dirigé avec

paLience, fermeté et enseigné, à un profane, Ia recherche dans le milieu médicale.

Au Professeur À. Cruchaud qui m'a accueilli au sein de Ia Division d'Immunologie et d'Allergologie. Je Ie remercie pour Ia richesse de son enseignement et de Ia chaleureuse atmosphère de travail gu'i1 a su créer autour de lui.

Àux Professeurs J.-C. Jaton et J.-P. ^Mach qui m'ont

fait I'honneur d'accepter de juger ce travail.

Au Professeur S. Edelstein, représentant ^du

département de Biochimie.

Aux Professeurs M. Fenton et R. Ulevitch pour leur enrichissant conseil et leur constante disponibilité lors de nos col]aborations.

Aux Docteurs S. ^Demczuck

et tout

particulièrement À.

Shaw qui m'ont

initié

à

Ia

Biologie Moléculaire. Toute ma

gratitude pour

leur disponibilité et leur

aide.

À tous

les

collaborateurs de

I'unité

d'Immunopathologie clinigue

et

d'Immunochimie qui m'ont soutenu, supporté, encouragé

et

conseillé avec patience

et

enthousiasme

et

de

I'amitié gu'ils

m'ont prodigué.

TABLE PES MAÎIERES

1. Introduction ^générale.

1.1. Le monocyte-macrophage.

1.1.1. Aspect général et développement.

1 .1 .2. Àctivation du monocyte-macrophage.

p.:

p.:

p.:

p.:

p.

p.

p.

p.

p.

p.

p.

p.

10.

10.

10.

14.

15.

17.

17.

18.

5 5 5

I

1.2

1 .2.1 ^.

Les monokines.

L'Interleukine 1 ^(IL-1 ).

Caractérisation biochimique et moléculaire.

Activités biologiques de I'IL-1.

Les inhibiteurs de I ^I IL-1 .

Le "Tumor Necrosis Factor alpha" ^(TNF a).

Caractérisation biochimique et moléculaire.

Activités biologiques du TNF a.

Définition du projet.

Chapitre

I:

Adaptation

et

contrôIe ^par

les

^protéines plasnatiques de

I'activation

du monocyte-macrophage stimulé par

le

^LPS.

Introduction.

Structure et composition de lrendotoxine.

Interaction du lipopolysaccharide avec

Ie système de médiation de I'hôte.

Modulation de I'activité endotoxigue du lipopolysaccharide par les

2 2 2 2 2 2

1

1

1

.1.1.

.1.2.

1

1

1

2 1 .3.

2.1 2.2

2

3

p.

:

^20.

p.

:

^22.

22.

22.

p.:

30.

3.1 3.1.1 3.1 .2

P

p

3.2

3.2.1 ^. 3.2,2.

3.3.

3.3. ^{1 .} 3.3.2.

3.4

4

4.1

4.2.

4.2.1.

4.2.2.

llpoprotélnes de haute densité.

nésumé.

Article.

ContrôIe par des protéines plasmatigues

et

^par

Ie

lipopolysaccharide de

la

^production

des cytokines monocytaires humaines stimulées

par

le lipopolysaccharide.

^p

nésumé.

^p

Articl-e.

^p

Conclusion.

Chapitre II: Àctivation et régrulation des ^gènes de I'rL-l a et de I'IL-I 8.

Introduction.

p

P

p

31 .

31 .

33.

39.

39.

41 .

p.: 67.

p.: 69.

p.: 69.

p

73.

73.

p.: 76.

Expression de ^lfARNm de I'rL-1 c et ^B et de L'activité Uiotogique de I'rL-1

dans les cellules mononucléées du

sang périphérique humain.

nésumé.

Àrticle.

p

Effet différentiel

de

f infection

i.n

vitro

par J.e nycoplasme sur l'expression de 1'ARNm de

lrIL-1

a

et

B dans

les

cellules U937

et

4431. p.:

4.3

87.

4.3.1 4.3.2

4.4.

4.4.1 4.4.2

3

nésumé.

Article.

Régulation

et

activation du ^promoteur du ^gène de

I'IL-I

8.

Introduction.

Matériels

et

rnéthodes.

Résultats

et

discussion.

Conclusion.

Conclusion

finale.

Bibliographie.

p p

P. ^!

p.:

p.:

P.:

p.:

87.

89.

96.

96.

100.

102.

109.

4 5 4 4

5

6

p.:

112.

p.:

115.

LISTE DES ABREVIATIONS.

Acide désoxyribonucléique complémentaire Àcide ribonucléique messager

Concanavaline À

Protéine C réactive

"Electrophoretic rnobility shift ^assay"

ttEndogenous pyrogen"

"High density lipoprotein"

Interféron ^gamma

Immunoglobuline

Immunoglobuline de type ^G Interleukine ¹

Interleukine 1 recepteur antagoniste

2- cêt'o ³ -déoxy-octulosonate 'rLymphocyte activating factor"

"LPs binding protein"

t'Leukocytic endogenous mediatortt Lipopolysaccharide

ttmononuclear cell factortt

"Peripheral ^blood mononuclear cells"

Prostaglandine ^E2 Phytohémagglutinine

Phorbol myristate acetate ttserum amyloid ^Atl

ttTumor necrosis factortt

ÀDNc ÀRNm ConA CRP EMSA EP HDL

rFN _Y Ig

IgG

IL-1 IL-1 ra

KDO

LÀF LBP LEM LPS MCF PBMC PGE2 PHA PMA SAÀ TNF

1 IIITRODUCTTON GENERAI,E.

1.1 TE ITIONOCYTE-MACROPHAGE .

Aspect général

et

Développenent.

1.1.1.

Le monocyte-macrophage joue _un rôIe central et

essentiel dans la réponse immuner êr ayant des fonctions de protection te1 ^que en ingérant et tuant des organismes

invasifs, êt en relâchant un grand nombre de facteurs participant à Ia défense de 1'hôte et à I'inflammation.

De plusr êr relâchant des facteurs solubles et ^en présentant un antigène aux lymphocytes, le monocyte- macrophage participe au développement d'une immunité

spécifigue.

Dans ces dernières années, le développement

d'anticorps monoclonaux et le clonage moléculaire de nombreuses cytokines ont permis de mieux identifier et

comprendre les mécanismes d'activation et de régulation de cette ceIIuIe.

Les cellules du ^système monocytaire sont dérivées des cellules souches hématopoïétigues gui, chez I'être

humain adutte, résident principalement dans la moelle osseuse où elles se divisent activement ^(Goud et coll.

1975). Certaines d'entre elles deviennent des

promonocytes puis des monocytes qui passent dans Ia

circulation sanguine où leur demi-vie est estimée à trois jours (Vùhitelaw 1972) et migrent dans les divers tissus du corps où ils seront appelés macrophages ou ils

prennent un nom tel ^que les cellules de Kûpfer, ostéoclastes ou autres ^(van Furth 1982).

En réponse à divers signaux, les monocytes adhèrent

à I'endothélium et migrent ^dans divers tissus où ils deviennent des cellules spécialisées, comme par exemple

des macrophages alvéolaires dans le ^poumon ou ^des

macrophages synoviaux dans la cavité articulaire. ^Les ce1lu1es du ^système monocytaire ont des caractéristiques

communes, conme par exemple: la capacité de phagocytose,

Ieur contenu en estérase, Ia sécrétion de ^lysozyme,

I'expression de récepteurs membranaires pour le ^fragment Fc des immunoglobulines et ^pour des protéines _de Ia

cascade du complément (van Furth 1988).

Certaines de ces caractéristiques sont ^{communes à} tous les monocytes-macrophages du même stade ^de

développement et sont résumées dans le tableau 1. Les

différents stades de maturation et localisation sont mentionnés dans Ie schéma 1.

système des phagocytes mononuclées.

-.>

cellule sowhe

Taille Prolifération Adhérence Estérases Granules de

myéloperoxydase Lysosomes

Phagocytose Fc ^récepteurs C3b récepteurs Sécrétion de

lysozyme

Moëlle osseuse

- 6 Purs

--->

monobla$e

10-12 rrm ++++

+ +++

+

promonocyle monocyle

12-18 rrm ^{12-15 rrm}

macrophage tissu conpnctif

os (o$éoclesles) poumon

loie _1c. de Kûpffer)

ime$in rate ganglion moèlle osseuse Cerveau(c. microgl ^ia.l es )

cavilés séreuses

æau (c. de Langeôans)

20-80 _rrm

t

+++

+++

0 +++

+++

+++

+++

r sang tl-

_Tissus I

I 1-3purs ll _pusæurs ^I

rnors

+

Schéma adapté de Johnston,1988

Tableau 1 : Propriétés caractéristiques de la maturation des cellules du système des phagocytes mononucléés.

ÇeEqérlslqs

Ms-æuæle Brs'î-q!sv!e l4p-rlat-re ^[4eçre!h3æ

++++

+ +++

+++

+++

++

+++

++ ++

++

++

++

++

+

t

+ +

t

+

t ⁺⁺

+ +

'4.

^{a t}

a

t

\ _a

?

t

Adapté de Van Furth, 1988 et Papadimitriou, 1989

++ ++

1 2 Actiyation du monocvte-macrophaqe.

Que ce soit Ie monocyte du sang périphérique _ou le

macrophage résident, ces cellules ^peuvent subir des changements dans leur phénotype ou dans leur fonction

quand elles sont activées, lors de ^processus inflammatoires ou infectieux se développant dans

I'organisme. Tout d'abord ces cellules se transforment en macrophages inflammatoires ou stimulés. EIIes ^possèdent alors une intense activité de sécrétion, en particulier des protéases; par contre leurs propriétés de

bactéricidie et de cytotoxicité envers les cellules invasives (bactéries, virus ou cellules tumorales) sont

toujours réduites ^(Van Furth 1980, Takemura et co1l.

1984). Cette stimulation semble être induite par une

assez grande variété d'agents inflammatoires ^peu spécifigues, tels que les dérivés de la cascade du

complément, C5a et facteur Bb ou 1es complexes immuns,

mais le principal signal est Ie lipopolysaccharide ^(tPS) provenant de la paroi cellulaire des bactéries gram-

négatives (Rosenstreich 1981, Adams et coll. ¹⁹⁸⁴¹

Westphal et coll. ^1952).

Dans un deuxième temps le macrophage inflammatoire reçoit des signaux d'origine lymphocytaire, les

lynphokines, et achevant ainsi sa maturation _en devenant un macrophage activé.

Lractivation des lymphocytes T résulte dans le

relâchement de plusieurs facteurs activant les monocytes.

L'interféron ganma (rrn V) apparaît ^{comme un des}

1

principaux facteurs activant les monocytes (Nathan et col1. 1983, Schultz et coll. 1983). L'interleukine 2 (rr,-

2l joue aussi un rôle dans 1'activation du monocyte (Malkovsky et coll. 1987), de ^{même que} les "colony

stimulating factors" (csrs1, l'interleukine 4 (rL-4), Ie

"transforming ^growth factor beta" ^(TGF B) et les

prostaglandines ^(Crawford et coll. 1987, Lindemann et coII. 1988, ^Rouzer et coll. ¹⁹⁸⁰ et $lahl et coll. 1980).

Les principales fonctions du monocyte-macrophage dans Ia défense de I'hôte et les principaux changements

de ces fonctions sont ^résumés dans le Tableau 2.

Tableau 2: Modulation de la sécrétion au cours de l'évolution des macrophages résidents en macrophages inflammatoires ou activés.

proOuits _Oe

secretm

_[4O resiOCO L4e_:qlammato{q MO activé Activateur du

plasminogène Elastase

Métalloproléases Apolipoprotéine E

Dérivés de I'acide arachidonique Métabolites de

I'oxygène

+ + +

+++

+++

+++

+++

+ +++

++

+++

+

+++

+

+

t ++

Adapté de Takemura et Werb, 1984, et Johnston,19B8

+++

1.2 LES lrlONOKIl[ES.

Les monocytes, stimulés par I'endotoxine, produisent des médiateurs, appelés monokines,

qui

assurent des

fonctions multiples

et

fondamentales dans

la

réponse de

I'hôte

aux infections

et

aux traumatismes.

Elles

^jouent

aussi un

rôIe très

important dans

les

^processus

inflammatoires

et

tumoraux en modulant

les

fonctions d'autres

cellules

^(ttathan 1987 ) ^.

Parmis

elles, Irinterleukine 1 (IL-1) et Ie

tumor

necrosis

factor

alpha (rwr

a)

sont

les

médiateurs majeurs de

I'interaction

du monocyte-macrophage avec

les

autres

cellules

du système immun ou non-immun.

1.2.1

1 .2.1 .1

Lrlnterleukine 1 ^(Ir,-1 ).

Caractérisation biochinique et noléculaire.

L'IL-1 a été décrite par Gery et trlaksman en 1972. En

raison de ses diverses activités biologiques, différents

noms ont été donnés à cette protéine, entre autres

"endogenous pyrogen" ^(EP) r t'mononuclear celI factortt

(MCF), "leukocytic endogenous mediator" (LEM) et

"Iymphocyte activating factor'r ^{(LAF) .}

L|EP, décrit par Dinarello en 1977, est une molécule pyrogène trouvée dans la circulation sanguine, lors

d'infections ou de maladies immunologiques ou

inflammatoires. _E1Ie est associée à I'augmentation de ra production de prostaglandine E2 (oinarello et coII.

1977'). Le ^LEM induit la réponse de Ia ^phase aiguër ên

stimulant la synthèse des protéines caractéristiques de

cette ^phase, telles ^que le fibrinogène et Ia protéine C-

réactive ^(cnp) (Dinarello _1984a). LrEP et le ^LEM ont été apparentés par I'essai biologique du ^pyrogène.

rn étudiant les cellules de la membrane synoviale inflammatoire et leur sécrétion, Dayer et coll. ont mis

en évidence un facteur, produit par les monocytes- macrophages stimulés, gui induit la synthèse des

prostaglandines E2 ^(PGE2) et de La collagénase dans les cultures de cellules synoviales ^(oayer et coII. ^1979).

En 1979, lors de l"'International Lymphokine

Workshop" drErmatingen en Suisse, Ie terme Interleukine ¹ a été suggéré pour _désigner cette famille de ^molécules produites par les monocytes-macrophages (aarden et coII.

19791. Des recherches biochimiques ont mis en évidence une sirnilitude structurale entre ces protéines

biologiquement considêrées comme distinctes les unes des

autres.

L'isolement de I' acide ribonucléique messager (anNm), le clonage des gènes, leur expression dans des

bactéries et leur séquençage ont confirmé ces analogies et Irexistence d'au moins deux gènes ctr.ez lthomme.

En 1984, Auron et coll. ont cloné Ia première IL-1 humaine à partir de monocytes humains du sang

périphérique (Auron et coII. 1984). L' acide

déoxyribonucléique complémentaire (epn)c _code pour un

précurseur de ²⁶⁹ acides aminés, comprenant un large

segment N-terminal qui sera clivé pour donner Ia forme

mature de 153 acides aminés, d'un poids moléculaire de ¹⁷

kDa et d'un point isoélectrique de 7.0.

March et co1l. ont décrit, ^{quelques mois} plus tard, le clonage, à partir d'une bangue d'ADNc de macrophages

humains, de 2 ^ADNc distincts de IrIL-l qui furent appelés

IL-1 c et IL-l B ^(uarch et coll. ^1985).

LTADNc codant pour lrIL-l I est identique à celui isolé par Auron et coll., et I'ADNc pour lrll,-l a est, homologue

à l'ÀDNc murin isolé par ^Lomedico et coll. (l,omedico et coII. 1984). LrIL-1 a humaine est produite sous forme

d'un précurseur de ²⁷¹ acides ^aminés qui sera clivée pour donner une forme mature de 159 acides aminés, d'un ^poids moléculaire de ^{17 kDa} et d'un point isoétectrique de 5.5.

On observe une homologie de 45 t entre les ^séquences de nucléotides et de 26 t au niveau de la séquence des

acides aminés entre I'rL-l c et I'IL-1 B humaines ^(March

et coll. 1985, Gubler et coII. ^1986).

tes ^gènes génomiques contiennent tous les deux ⁷ exons (Clark et coll. 1986, Furutani et coll. 1986). Ils sont localisés sur Ie long bras du chromosome 2 à ta

bande 913 ^(webb et coII. 1986, Lafage et coII. ^1989).

L'expression de ces deux gènes est régulée au niveau de

Ia transcription par des éIéments agissant en cis et trans sur les ^{gènes (Auron} et coII. 19S9).

Le précurseur de I'IL-1 B est biologiguement inactif, contrairement à celui de I'rL-1 c ^(March et coII. 1985).

Les nécanismes de traduction sont probablement

différents car, par détection antigéniguêr plus d'IL-1 ^a que d'IL-1 B est détectée ^(nndres et coll. 1988, Endres

et coll. 1989, Lonnemann et coll. 1989). ÀIors gu'environ 50 t de ltIL-1 B est relâchée, Iorsque les monocytes sont

stimulés avec Ie LPS, oD ne trouve que 10 t drIL-1 q dans

Ie surnageant des cultures cellulaires ^(Hurme et coll.

1988, Chensue et coII. 1989, Lonnemann et coll. ^1989).

L'IL-1 B est trouvée dans Ie surnageant de culture sous

forme mature et immature (xazuda et co1l. 1988, Beuscher

et coll. 1990). Alors que I'rL-1 a est biologiguement

actif dans les formes immatures et matures, seul la forme

de 17 ^kDa de 1'II-1 B possède une activité biologique (Beuscher et coll. 1990).

Les activités biologigues de I'IL-1 c et de I'IL-1 ^B sont bien connues et documentées alors ^que les mécanismes

concernant leur induction et Ia régulation de leur

expression Ie sont peu. l,es précurseurs de 1'IL-1 q et ^de I'IL-1 B ne contiennent ^pas de séquence signal

caractéristique des protéines sécrétées. Les ^mécanismes de clivage et de sécrétion ne sont pas encore élucidés.

De nombreux chercheurs ont tenté de mettre en évidence une forme membranaire de lrIL-1 cr (Kurt-Jones et coll.

1985 et 1986), mais leurs résultats sont contestés ^par d'autres ^groupes (Suttles et coII. t990a); seule

I'existence de formes intracellulaires de lrIL-1 a et ^de 1'IL-1 g a été confirmée par plusieurs groupes de

chercheurs (ttlinnich-Carruth et coll. 1989, Suttles et coII. 1990b).

1.2.1 .2. Activités biologiques de L'IL-l ^.

L'IL-1 est responsable d'un très grand nombre

d'activités biologiques. Mais à L'heure actuelle aucune

étude-n'a pu dissocier I'activité de I'rL-1 c de celle de

I ^I rL-1 B.

L|IL-1 augmente Ia production de PGE2 et de Ia collagénase par les fibroblastes et par les cellules synoviales, fonction qui ^permet d'identifier Ie

"mononuclear ceII factor", êt favorise leur prolifération (Dayer et coll. 1977, Dayer et coll. 1986). LrIL-1

augmente aussi Ia production, par les chondrocytes de

protéases neutres, telles ^que I'activateur du

plasminogène (ttliller et coII. 198?). ElIe stimule Ia résorption osseuse, en activant les ostéoclastes et ^en diminuant Ie taux de phosphatase alcaline contenue dans

les os ^(Lee et co1l. 1987, MiIIer et coll. ^1987).

L'IL-1 stimule les cellules endothéliales à produire des PGE2, du "platelet activating factor" ^(PAF), des

prostacyclines et de I'inhibiteur de I'activateur du

plasminogène, êt active le facteur procoagulant tissulaire à Ia surface de ces cellules ^(r,e et coll.

1987, Dinarello 1989).

De même, toujours sur les cellules endothéIiales, L'IL-1

augmente I'expression des molécules inpliquées dans

I'adhésion intercellulaire, telles ^que Ir "intercellular

adhesion molecule" ^(ICAM 1)(Prober et coll. 1986),

l"'endothelial leukocyte adhesion molecule" ^(ELAM

1)(Belavicqa et coll. 1989) et le "vascular celI ^adhesion

molecule" ^(vCÀM 1)(Osborn

et coll

1989),

et

de ce

fait

favorise I'adhérence des lyrnphocytes, monocytes et neutrophiles aux parois vasculaires.

L'IL-1 agit

sur

les

hépatocytes en modifiant Ia synthèse des protéines de

la

^réponse de

Ia

phase aiguë, en dininuant

la

production dtalbumine

et

de transferrine,

et

en augmentant

la

synthèse de I'q-antichymotrypsine, des composés du complément C3

et

B

et

de

Ia

^protéine

associée à 1'amyloidose À sérique ^(Saa1,

tout

^en

diminuant

I'activité

du cytochrome P450 (Sherry

et coll.

1988, Dinarello ^1989).

L'IL-1

a ses

effets les

plus importants sur les

Iymphocytes:

elle

active

les

lymphocytes T

et

favorise Ieur

prolifération

en réponse aux mitogènes. ^Le

"Iymphocyte activating factor'r (Lar)

est

Irun des

premiers essais biologiques mis au point pour la

détection de

I'rL-1

^(Gery

et coll.

1972a1.

L'rL-1

stimule

Ia

synthèse de

I'interleukine 2

^(ff,-Z)

et

de

I'interféron

gamma (rrN _V)

et

augmente I'expression des récepteurs de 1r

IL-2

^(fqaizet

et coll.

¹⁹⁸¹

,

^Kaye

et coll.

1984 ) ^.

Enfin

IrIL-1 induit

aussi

Ia

synthèse de

I'interleukine 6,

facteur activant

les

cellules B (Dinarello 1989).

1.2.1 .3. Les inhibiteurs de 1'IL-l ^.

11 existe toute une série de substances naturelles

qui

inhibent

les activités

biologiques de

I'IL-1,

conme

les

lipoprotéines,

les lipides et I'q-2

macroglobuline,

mais ces substances inhibent aussi des cytokines, telles que I'rL-2 et I'rL-6.

Un polypeptide, inhibant spécifiquement I'rL-l, a été trouvé dans les urines de patients ayant une leucénie monocytaire (galavoine et coll. 1985, Seckinger et coll.

1987a et 1987b, Vtazzel et coll. 1990) et dans le

surnaçteant de culture de monocytes humains ayant adhéré à

une surface recouverte d'immunoglobuline de type ^G (Igc) (Àrend et coII. ^1989).

Cet inhibiteur naturel de I'IL-1 est une protéine de

23-25 ^KDa gui bloque la capacité de I'rL-1 à stimuler Ia production de PcE2 et Ia collagénase par les fibroblastes et les cellules synoviales. II inhibe la prolifération des thymocytes et diminue Ia sécrétion d'insuline par les ilôts pancréatiques (Dayer-Mêtroz et coll. 1989). Cet

inhibiteur bloque Ia liaison de I'IL-1 à son récepteur d'où Ie ^nom de recepteur antagoniste (IL-1ra), mais

n'affecte pas Ia liaison du ^TNF ou de I'IL-2 à leur récepteur (Seckinger et coll. ^1987).

En utilisant I'inhibiteur de I'IL-l purifié à partir du

surnageant de monocytes ayant adhéré sur des r9G, Ia

séquence N-terminale a été obtenue , êt la ^molécule clonée ^(Hannum et coll. 1990, Eisenberg et coII. ^1990).

La séguence de lrÀDNc code pour un polypeptide d'environ

17 kDa. La différence observée avec la protéine naturelle de 25 kDa est due à une glycosylation. Lranalyse des

acides aminés révèle une homologie de 26 t avec lrIL-1 ^B et de 19 * avec I'IL-1 c.

l,a protéine recombinante de I'IL-1ra de 17 KDa entre en compétition avec lrrL-1 c ou J'IL-1 B pour la liaison à son récepteur et eIle a les ^mêmes activités biologiques que le produit naturel. En raison de ces

caractéristiques, Ie ^nom d'rL-l récepteur antagoniste (rL-1ra) a été ^{proposé pour} cette molécule, basée sur 1'observation de la liaison avec le récepteur ^(Seckinger et coll ^1990).

1.2.2. Le "Tumor Necrosis Factor alpha" ^(TNF a).

1 .2.2.1 . Caractérisation biochimigue et moléculaire.

En 1975, Carswell et coll. ont décrit une protéine sérigue, induite par le bacille de Calmette et Guérin

(BcG), qui provoque des nécroses des tumeurs in vivo et

possède une activité cytotoxique in vitro ^(Carswell et coll. 19?5). Le nom de "tumor necrosis factor" (rNr) fut

donné à cette protéine. Une lignée cellulaire leucémique humaine promyéIocytaire, HL60, produit du ^TNF en réponse au phorbol myristate acetate (fua1 Cette observation permit Ia purification du TNF (Àggarwal et coll. 1985) et

son gène fut isolé et cloné ^(Pennica et coll. 1984).

Cette protéine est structurellenent et fonctionnellement proche d'un autre produit sécrété par les lymphocytes, appelé lymphotoxine ^(uedwin et coll. 1985a). Le nom de TNF c a été ^proposé pour Ie produit sécrété par les

monocytes, et ^TNF B pour la lymphotoxine ^(Nedwin et coll.

198sb) .

Le TNF a ^humain est une protéine non glycosilée de

157 acides aminés, d'un poids moléculaire de 17 kDa et d'un point isoélectrique de 5.3. EIle est ^{sécrétée sous} forme d'un précurseur de 163 acides aminés qui est clivé avant son excrétion dans Ie rnilieu extracellulaire

(Pennica et coll. 1984, ^Wang et coIl. 1985, OId ¹⁹⁸⁵ et 1987). Le ^TNF a contient une séquence signal atypique, avec des résidus basiques et acides inhabituels dans

cette région ^(Pennica et colI. 1984).

La forme naturetle du ^TNF a en condition non-dénaturante

a un poids moléculaire de 45 kDa, ce qui correspond à ^une forme trimérique plus active ^que le monomère (Smith et coll. ^1987).

Le ^gène du ^TNF a est localisé sur Ie chromosome 6, ^proche des ^gènes du complexe majeur d'histocompatibilité. II

comporte 4 exons et 3 introns ^(Nedwin et coll. 1985a,

Spies et coIl. ^1986).

1 .2.2.2. Àctivités biologiques du Tt{F c.

Le ^TNF q possède une grande variété d'activités biologiques. La principale et Ia mieux connue est ^son rôIe de nédiateur de l'endotoxine bactérienne dans les chocs septiques (Beutler et coll. 1985, Old 1987). Le ^TNF c joue aussi un rôIe important dans I'inflammation par ^sa capacité de stimuler in vivo et in vitro la production d'IL-1 par les monocytes-macrophages, et drinduire Ia

production de PGE2 et de collagénase' par les

fibroblastes et les cellules synoviales ^(Dayer et coll.

1984 et ^1985, Dinarello et coll. 1986). Le TNF c a ^un effet sur la régénérescence tissulaire ^(Vlassara et coll.

1988, Brenner et coII. 1989). rl induit la croissance ^des cellules (Vilcek et coIl. ¹⁹⁸⁶⁾ et a un effet mitogénique

sur les fibroblastes ^(Sugerman et coll. 1985). II stimule la production d'rL-6 par les fibroblastes ^{(van Damme} et coll. 1985). Combiné avec I'rL-1 ou lrrL-6, le TNF ^q

induit la synthèse de nombreuses protéines de la réponse

de Ia ^phase aiguë, conme par exemple la protéine C-

réactive, êt diminue la synthèse de I'albumine et I'activité de la lipoprotéine Iipase et du cytochrome P450. Le ^TNF c abaisse les taux plasmatiques de fer et ^de zinc. In vivor êD synergie avec lrIL-1, Ie TNF c ^provogue un choc hémodynamique avec acidose métabolique et

hypotension, ainsi ^gu'une coagulation intra-vasculaire qui peut aboutir à ta mort ^(Okusawa et coll. 1988, ^glaage et coll. 1988) et une étude a ^démontré qu'ily a ^une

corréIation entre Ie ^TNFa et la mortafité chez l'homme

(Girardin et co1l. ^1990).

2 DEFINITION DU PROJET.

Depuis une centaine d'années,

il

est reconnu gue les bactéries ^gram négatives ont de profonds

effets

sur

1'êtie

^humain

et

sur

les

animaux.

Il

existe deux classes de produits bactériens

qui

sont responsables des effets biologiques attribués aux bactéries ^gram négatives: les exotoxines, synthétisés

et

sécrétés,

et les

endotoxines, associées aux bactéries mais pouvant

être

relâchées lors de

Ia

lyse bactérienne.

Depuis les années 70, iI a été démontré in vivor _9u€

1' endotoxine, aussi appelée lipopolysaccharide ^(LPS), se

Iie à des protéines plasmatiques. Le LPS se lie spécifiquement a une classe de Ia famille des

lipoprotéines, Ies lipoprotéines de haute densité ^(HDt) dont on sait à ce jour, entre autres, gu'elles joueraient un rôIe dans Ie transport du cholestéro1 des tissus

périphérigues vers le foie.

Ces dernières années, une nouvelle protéine se liant spécifiguement au ^LPS a été découverte, séquencée et clonée: Ia "LPS binding protein" ^(LBp).

Suite à ces observations effectuées

in vivo,

nous

nous sommes particulièrement intéressés, dans un ^premier tempsr âu

rôle

^{gue peuvent jouer} ces protéines

plasmatiques dans

Ia

régulation de

la

production des

cytokines par

les

monocytes-macrophages humains. Pour ce

faire

nous avons mis au point un système dtétude

in vitro

de cette régulation.

Parmi les cytokines concernées par cette régulation, I'interleukine 1 joue un rôle critique dans la réponse immune ou ^humorale et dans la réponse non-immune.

L'expression de f interleukine 1 alpha et béta' sous

divers états, peut être cruciale pour ^gue la réponse du

systène ^immun à une infection soit un succès. Nous nous sommes donc intéressés, dans un ^deuxième temps, à

I'activation et à ta modulation des ^{gènes de}

Irinterleukine 1 alpha et béta ainsi qu'à Ia ^production et à 1'activité biotogique de ces deux cytokines. Ces

études devraient nous permettre d'avoir ^une meilleur

compréhension du système de ^réponse du monocyte- macrophage à une activation.

3. ^CIIAPITRE T: ADÀPTÀTION ET CONTR.OLE PÀR LES PRCITEII$ES PLÀSIIÀTIOT'ES DE T.AEUVATION DU ITIONOCYTE UÀCROPHÀGE SIUT'LE PÀR LE LPS.

3.1 ^.

3.1.1.

INTRODUETION.

Structure et composition de I'endotoxine.

Depuis une centaine d'années, iI est reconnu que les produits bactériens ont de profonds effets sur I'être

humain ou sur 1'animal. Une classe de ces ^substances d'origines bactériennes est associée à ta bactérie ou

bien est relâchée par Ia lyse de la ceIlule. Ces toxines sont appelées "endotoxines", ce qui ^{permet de} les

distinguer des substances toxiques synthétisées et sécrétées par les bactéries intactes: les exotoxines

(Pfeiffer. 1892).

Un des premiers effets biologiques reconnu, causé

par Ies endotoxines est Ia capacité d'induire Ia fièvre

(Westpha1 et coll. ^19771. On sait maintenant que }es

effets des endotoxines, cllez ltêtre humain et chez

I'animal, ont un large spectre dractivités biologiques.

Les recherches d'un ^grand nombre drinvestigateurs ont étaUti ^que les vraies endotoxines sont dérivêes seulement des bactéries gram-négatives et se trouvent en général dans la ^membrane bactérienne. La figure no 1 représente schématiquement la ^membrane cellulaire d'une bactérie gram-négative. La ^membrane cellulaire est constituée d'une ^membrane cytoplasmique intérieure et dtune

tricouche extérieure.

FIGIIRE 1: 'structure schémat,ique d'une mernbrane

cellulaire

bactérienne.

Lipopolysaccharides

fi11 [[

u

î

Membrane

extérieure

Membrane

intérieure

ll tr0lr

{Jil

Phospholipides Lipoprotéines

Couche

peptidoglycane

Membrane

cytoplasmique

Cytoplasne

I IlI

\

t

I tl

Cette trlcouche est constituée d'une couche

mucopolysaccharidigue-peptidoglycane, d' une couche

protéinique phospholipidique et d'une couche extérieure de lipopolysaccharide ^{(LPS) (Braun} 1973) .

La couche de lipopolysaccharide de Ia membrane cellulaire est chirniquement unigue pour chaque souche de bactérie et permet ainsi la classification sérologique des divers types d'espèces bactériennes (Lûdetitz et coII. 1968).

Lors de la lyse bactérienne, les endotoxines se trouvent sous forme d'aggrégats de ^LPS et de protéines (parfois liées à des tipides) et sont relâchées dans le milieu.

Une extraction sélective de ce matériel bactérien permet

d'établir des bases pour une meilleure compréhension

scientifique de Ia biologie et de la chimie de ces complexes bactériens. ^Deux types d'extraction sont

principalement employés pour la préparation

d'endotoxines. La ^première procédure (Boivin 1935) comprend une extraction par I'acide trichloroacétigue froid et ^permet d'obtenir une préparation d'endotoxines constituée principalement de LPS mais contenant aussi ^des protéines et des tipides. La deuxième procédure (Westphal

et coll. 19521, la plus utilisée, est une extraction ^par le ^phénol d'une suspension aqueuse chaude de bactéries et

permet drobtenir une préparation _de LPS libre de toute protéine et de lipide. Cette préparation de ^LPS a aussi une activité endotoxique.

Dfautres investigateurs ont décrit un ^{grand nombre} de méthodes pour obtenir du matériel endotoxique des

bactéries gram-négatives: extraction par l'éther (Ribi et

coll. 1959), par I'EDTÀ (Leive et coll. 1958), par Ie diétnyfèneglycol ^{(Morgan 1937} ) ^ou par le butanol

(Morrison et coll. 1975). Chacune de ces ^{méthodes donne} du matériel biologiquement actif.

L'activité biotogique normalement attribuée aux

endotoxines bactériennes a été démontrée par

I'utilisation de LPS isolé et chimiquement pur. De ce

fait les termes ttendotoxinesttr ttlipopolysaccharidest' et

"LPS", ^termes utilisés par divers chercheurs, regroupent

les mêmes activités biologiques observées. Mais cependant, il faut reconnaître que deux produits

bactériens peuvent être différents par leur composition chimique, êt par leur activité biologique. La définition de Braude, dans I'index Merk (Windhotz 19761, de

1'endotoxine: t'complexe de lipopolysaccharide et de

protéines se trouvant dans Ia paroi cellulaire de

bactéries gram-négatives (les bactéries gram-négatives

non-infectieuses étant inclues)", permetr pâr Ia ^présence ou I'absence de composés protéiniques, _de distinguer

I'endotoxine du LPS purifié chimiquement.

Lrendotoxine est isolée de bactéries gram-négatives

et est constituée principalement de lipopolysaccharide et d'une quantité variable de protéines et de lipides. La

molécu1e de lipopolysaccharide ^(f,pS) est constituée d'une

région polysaccharidique Iiée de manière covalente à une

région lipidique, appelée "J.ipide À" par ^Wesphal

(Westphal et coII. 1954) pour la distinguer des lipides associés de manière non-covalente à ta molécule de ^LpS.

La partie polysaccharidique de Ia molécule de ^LPS est

généralement constituée de deux régions distinctes: la première est un "corps" polysaccharidigue et la deuxième

est une région polysaccharidique appelée "o-antigénigue".

Le corps est généralement identigue ^pour un large groupe de bactéries et contient un type unique de sucre

2-céto 3-déoxy-octulosonate ^(roo) (un heptose), une

phosphoryl éthanolamine et divers types d'hexoses.

La partie "O-antigénique" est, au contraire du ^t'corpstt,

chimiquement unique pour ^chague type d'organisme

bactérien. EIle est constituée normalement d'une

répétition d'unités oligosaccharidigues contenant 3 à ^a différents hexoses par unité. Le nombre de répétition de

I'unité oligosaccharidique peut all-er de 2 ( souches

semi-rugueuses) à plus de 10 ^(souches lisses)(Morrison et coll. 1975, Jann et coll. 1975, Gmeiner. 1975).

Le dessin de Ia figure 2 montre Ia structure de manière

générale du LPS. Celui de Ia figure 3 représente avec

plus _de détail une sorte de LPS ^(LPS provenant de

Escherichia Coli 0111:84)(Morrison et coll. 1975, Edstrom

et coll. 1967).

FIGURE 2: structure de base du LPS bactérien.

æ o-As

o€-o.oo

o- Às

ru9ueux semi-rugueux Iisse

FIGURE 3: ,LPs, de F.. coli,,oL11-:B4

Fa I ^{KDO- Hep-G}Ic-Ga1-GIc- ⁽

Fa

I

Co cNI

cN

I

Gal-GIc-GlcNÀc )n

FA I ^{Hep G11,,Àc}

"l ^t

F a ^EtN

lipide A

^noyau

polysaccharidique

chaine O-antigène

Les LPS d'autres ^souches bactériennes ont

la

^même structure ^{générale que}

celui

d'Escherichia

coli

⁰¹¹¹⁸⁴

(figure 3),

mais ^possédant des hexoses

différents

dans la région du corps

et

O-antigène. La

figure

3 montre Ia

structure monomérique, mais

il faut

noter

qu'iI

existe, de manaere \. rnvariable, des formes d'agrégats de haut

poids moléculaire (> ¹⁰⁶ daltons). ^De plus, des souches mutantes de bactéries rugueuses, avec une déficience ^dans la synthèse du LPs, ont été isolées (Lûderitz et coll.

1971, Galanos et coll. ^19771. Le LPS isolé de ces ^souches bactériennes ^(en particulier à partir de la souche

mutante Re 595 de Sa1mone1la minnesota (Lûderitz et coll.

1966, Tripoli et coll. ^{1956, Kim} et coll. 1967)) a ^permis de mieux définir la relation entre la structure du ^LPS et son activité biologique. ^{Ce mutant} a ^perdu la capacité de

synthétiser I'heptose. ^De ce fait te LPS est constitué

seulement du lipide A, de trisaccharide ^KDO et ^de phosphorylétanolamine. D'autres mutants déficients en

heptose ont été isolés et caraetérisés (rrvin et coII.

1975, Koplow et coll. ^19741.

La portion lipidique (Iipide A) de Ia nolécule ^de

LPS est unique. Les premiers à suggérer Ia structure chimigue furent Burton et coll. (gurton et coII. ¹⁹⁶⁴⁾ Iaquelle fut confirmée par d'autres investigateurs. ^Le tipide À, représenté ^dans Ia figure 4, est constitué de

béta 1-6 digtucosamines (structure _de soutien) unies ^par des liaisons ester ou amine à des acides gras à longue chaîne ou à des ^groupes de pyrophosphates (Gmenier et coIl. 1969). Les liaisons ester dracides gras sont ^non-