les propionibactéries laitières, des bactéries particulières.

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Submitted on 5 Jun 2020

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les propionibactéries laitières, des bactéries particulières.

Gwénaël Jan

To cite this version:

Gwénaël Jan. les propionibactéries laitières, des bactéries particulières.. Invitation INRA TOXALIM, Institut National de Recherche Agronomique (INRA). UMR Toxicologie Alimentaire (1331)., Feb 2019, Toulouse, France. �hal-02051585�

Les propionibactéries laitières, des bactéries particulières…

Gwénaël JAN

L’UMR STLO, en quelques mots …

100,000 fermes laitières 22 milliards de litres

700 usines 60,000 employés Production laitières en France

(3.8 millions de vaches laitières) Traitement & transformation

Le Lait …

[ 0 ; 1 [ [ 1 ; 5 [ [ 5 ; 20 [ [ 20 ; 50 [

[0 ; 1 [ [1 ; 5 [ [5 ; 20 [ [20 ; 50 [

43 % 9 %

10 % 5 %

19 %

49 %

11 %

Les œufs …

Pour visiter notre site http://www6.rennes.inra.fr/stlo

Une approche pluridisciplinaire et multi-échelle, renforcée par deux installations d’envergure :

Science et Technologie du Lait et de l’Oeuf

78 permanents 25 doctorants

Rennes

La plateforme Lait Un centre de ressources biologiques

 Structuration et mécanismes de déstructuration des matrices alimentaires : de la caractérisation structurale à la digestion

 Procédés de l’industrie laitière et fabrication fromagère : vers de systèmes durables

 Interactions microbiennes :

matrice alimentaire et cellules de l’hôte

2 outils technologiques majeurs:

Plateforme lait & centre de ressource biologique

BIONOV

Spray drying

Biological Resource Center for Food Bacteria (CIRM-BIA)

4 000 strains, of which 2000 are referenced in an online

catalogue (http://collection-cirmbia.fr) 23 genera, 113 species

• Pilote plant dedicated to dairy technology

• 800 m², fullyrenewed in 2013 (700 k€)

• Equipements at a pre-industrial scale, which cover80 % of the processes used in the dairy industry

- Continuum over the whole transfromation chain for milk treatment

-Continuum from research to pre-industrial validation

• A tool for students’ training

Des partenaires industriels

16

38

Dairy: BBA members + Ingredia, HCI, UP, Ermitage, Danone…

Equipment suppliers: GEA (Fr & Dk), Tetrapak (NL) Non-dairy: ADRO Ouest members, DSM, Lesaffre, Vapran (blood), AdroOuest (Oeuf), Standa,

4

Valio, Unilever, Mondelez, Arla Food

Clusters (Pôles de compétitivité) Commissions thématiques

Organisations interprofessionnelles

(CA, CS, instance progr.)

Instituts techniques

Actalia RMT Listral

RMT Fromages de terroir

Fromageries Bel, Bongrain, CF&R, Entremont Alliance, Eurial, Coopérative d’Isigny-Ste-Mère, Lactalis, Laïta, Laiterie de Montaigu, SILL, Maîtres Laitiers du Cotentin

Cinq équipes de recherche complémentaires

Microbiologie des filières lait et œuf

Nos travaux visent en particulier à :

Développer des aliments sains, sûrs, hédoniques et fonctionnels (bactéries lactiques et propioniques) issus de la fermentation du lait et d’autres matières premières (e.g. mixtes végétaux–lait)

Développer des aliments à effet santé pour l’homme (probiotiques)

Réduire les risques sanitaires et l’altération des œufs et des ovoproduits (e.g. Salmonella enteritidis, Bacillus cereus) Prévenir les mammites en proposant des alternatives aux traitements antibiotiques (e.g. Staphylococcus aureus, microbiote mammaire)

http://www6.rennes.inra.fr/stlo

Le fromage, une vieille histoire …

→ le fromage est le plus ancien aliment façonné par l’homme, avant le pain et le vin!

Moule à fromage de la grotte de la Pileta, Malaga

"les premières espèces domestiquées furent la chèvre, le mouton, le porc et le boeuf... elles l'ont toutes été à peu près en même temps, vers 8 500 avant J.-C., au Proche- Orient."

Qui débute avec la domestication d’animaux source de lait

- néolithique, 5000 avant JC

Salque M¹, Bogucki PI, Pyzel J, Sobkowiak-Tabaka I, Grygiel R, Szmyt M, Evershed RP.

Earliest evidence for cheese making in the sixth millennium bc in northern Europe

Des traces de lipides laitiers montrent que ces poteries ont servie à égoutter du lait….

Rendre le lait moins périssable et plus digeste…..

Salque et al.,

2013. Nature Critical step in making milk less perishable, and more digestible for

early prehistoric farmers - 8000 years

Pottery vessel Lipids analysis

Qui débute avec la domestication d’animaux source de lait

- néolithique, 5000 avant JC

Qui débute avec la domestication d’animaux source de lait - néolithique, 5000 avant JC

J Dunne et al. Nature 486, 390-394 (2012) doi:10.1038/nature11186

First dairying in green Saharan Africa in the fifth millennium bc

Représentation ancienne d’élevage, de traite de ruminants et de manipulation du lait……

Kykeon (Gr. κυκεών, de κυκάω, mixer), une vieille recette grecque de vin et de fromage

Aristote (384 BC –322 BC)

Aux pouvoirs magiques !

Et un fromage de vache des Arverni (Auvergne, France)

Pline l’ancien, AD 23–79)

«Histoire naturelle, chapitre XI «De diversitate caseorum»»

Décrit un fromage de brebis des Babales (Lozère, France)

Tous ces fromages sans ferments ajoutés !!!!

L’itinéraire technologique sélectionne les bactéries

Ferments sélectionnés Texture

Arôme Acidification

De nos jours, l’industrie

sélectionne les bactéries

sans ferments ajoutés !!!! ^Metchnikof

Plinius

Pasteur Aristotle

Hansen

D’autres bactéries sont sélectionnées sur d’autres critères

IBS, IBD, atopie, intolerance …

Probiotiques sélectionnés Immunomodulation

Digestion Douleur intestinale

Probiotiques sélectionnés Ferments sélectionnés Immunomodulation

Digestion Intestinal pain

Texture

Arôme Acidification

Bactéries « 2-en-1 »

Une

deuxième

sélection est

possible

L’Emmental et les propionibactéries …

Les propionibactéries, des actinobactéries

Gram + pleiomorphic

anaerobic to microaérophilic non motiles et non sporulated

GC Rich : 67%

P. freudenreichii

« Dairy » :

P. freudenreichii

P. jensenii - P. thoenii - P. acidipropionici

Soil Fodder

Silage

Rumen

Milk Cheese

GUT Sewage plants

Propionibactéries, une écologie particulière

 Ferment d’affinage

 Bio contrôle

 Vitamines B9, B12

Propionibacterium freudenreichii

 Probiotiques

Les propionibactéries, des couteaux suisses?

COOH COOH COOH COOH

AGCC

Effets connus sur l’apoptose

O’Flaherty, 2011, Gut Microbes

Citrate

Fumarate Oxaloacetate

Succinate Malate Pyruvate

Isocitrate

α-ketoglutarate Succinyl-CoA

S-Methyl malonyl-CoA

WOOD WERKMAN

Propionyl -CoA

Propionate

R-Methyl malonyl-CoA

Succinate semi aldehyde Succinyl-CoA acetyl-CoA

Acetate CO₂

Serine Alanine

Lactate

P-enolpyruvate Glucose and many sugars

KREBS Embden-Meyerhof Glycerol

Glucose-6P

Gluconeogenesis

Glycogen Trehalose

Les propionibactéries

Propionibactéries, une fermentation particulière

1 S-layer

0 S-layer

Plusieurs S-layers

1 couche de mucus

Propionibactéries, une surface variable !

Les propionibactéries et le cancer …

Citrate

Fumarate Oxaloacetate

Succinate Malate Pyruvate

Isocitrate

α-ketoglutarate Succinyl-CoA

S-Methyl malonyl-CoA

WOOD WERKMAN

Propionyl -CoA

Propionate

R-Methyl malonyl-CoA

Succinate semi aldehyde Succinyl-CoA acetyl-CoA

Acetate CO2

Serine Alanine

Lactate

P-enolpyruvate Glucose and many sugars

KREBS Embden-Meyerhof Glycerol

Glucose-6P

Gluconeogenesis Glycogen Trehalose

Tue les cellules cancéreuses en culture

Par apoptose

 Caco2

Co-culture

Cytochrome c

DNA Bax FDA/PI

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Time of treatment (h)

Percent of control Intracellular ATP level

ROS production (superoxide anion) Mitochondrial depolarisation (Δψm)

Cell cycle

Mitochondria Plasma membrane

Nucleus

Caspase 9

Caspase 3 / 7

DNA Condensation &

Fragmentation Cell cycle arrest

O₂

Δψm

Cytochrome c O2-

.

H2O2

Reactive Oxygen Species

SCFA

OK, mais avec un produit laitier?

Tue les cellules cancéreuses en culture

Par apoptose

Un nouveau lait fermenté

Effet sur cellules cancéreuses

P. freudenreichii

Lait fermenté

UF de lait fermenté Cellules HGT-1

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100

0 24 48 72

0 20 40 60 80

100 Lait

Lait fermenté Camptothecin

AGCC Acetate / Propionate

Time (h)

HGT-1 viability(%)

Cytochrome c

Hsc 70

0 h 24 h 48 h 72 h

Fuite du Cytochrome c

Western Blot /cytoplasm 0 h

Cytochrome cMitochondriaDNAOverlay

24 h

Control-JC1 UF fermenté ½ (24 h)

Dépolarisation des mitochondries

Un nouveau lait fermenté

Effet sur cellules cancéreuses

Activation des caspases

Un nouveau lait fermenté

Effet sur cellules cancéreuses : caspases

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

HGT-1 killing(%)

22

19

40

Un effet additif

Camptothecin Fermented mlk Camptothecin + fermented milk

 Effets similaires sur HT-29

OK, mais les propionibactéries arrivent-elles au colon

vivantes?

Un nouveau lait fermenté

Effet sur cellules cancéreuses : synergie avec chimiothérapie

Promeut l’activité métabolique in vivo

P. freudenreichii

Lyophilisé

Lait fermenté

†

D-1 J+7 D+14

Daily Gavage

J-1 J+7 J+14

Fecalpopulation (ufc/g)

10⁷ 10⁸

10⁶

10⁵

10⁴

 Cela dépend du vecteur d’apport alimentaire

0 100 200 300 400 500 600

Acétate Propioniate Butyrate Valérate

ColicSCFA (mmol/g dry matter) *

**

Un nouveau lait fermenté

Avec un impact sur la physiologie in vivo

Plasma Haptoglobin Colon explants cytokines

Lait

Lait fermenté

0 2 4 6 8 10 12

TNF (ng/mg …

0 0,5 1 1,5

Plasma …

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

IL-8 (ng/mg mucosa)

*

Effets sur la physiologie digestive

OK, mais quel est l’impact des métabolites propionibactériens

sur la carcinogenèse in vivo?

Un nouveau lait fermenté

Rats à microbiote humain (HMA)

Avec carcinogenèse induite : Dimethylhydrazine (DMH)

DMH (1,2 DiMéthylHydrazine)

4 lots de 6 rats axéniques

Inoculation du microbiote humain

Gavage quotidien 10⁹/ jour

Semaines

Apoptose : TUNEL

Prolifération : PCNA

PCNA : prolifération

DMH+

25 µm 25

µm

DMH-

P. freudenreichii- P. freudenreichii+

25 µm 25

µm

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Proliferating cells (%)

Pf -

DMH - Pf + DMH -

•Pas d’effet de P. freudenreichii sur la prolifération chez les rats contrôles

• Peu d’effet de P. freudenreichii sur la prolifération chez les rats mutagénisés

Pf -

DMH + Pf + DMH +

*

Rats à microbiote humain (HMA)

TUNEL : apoptose

DMH+

25 µm 25

µm

DMH-

P. freudenreichii- P. freudenreichii+

25 µm 25

µm

•Pas d’effet de P. freudenreichii sur l’apoptose chez les rats contrôles

•P. freudenreichii augmente l’apoptose chez les rats mutagénisés

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Apoptotic cells per crypt

Pf -

DMH - Pf +

DMH - Pf -

DMH + Pf + DMH +

*

Rats à microbiote humain (HMA)

CONCLUSION

 Un produit laitier fermenté par Propionibacterium freudenreichiiinduit l’apoptose in vitro.

 Un produit laitier fermenté par Propionibacterium freudenreichii apporte des propionibactéries vivantes au côlon.

 Propionibacterium freudenreichii , ingéré, favorise l’élimination apoptotique de colonocytes endommagés dans le contexte de la carcinogenèse

 Un aliment fonctionnel pour prévenir les effets carcinogènes des viandes rouges ?

Fabrice Pierre

?

Les propionibactéries et l’inflammation …

 Des souches prometteuses

Propionibactéries anti-inflammatoires?

Selected probiotics

Lille Inflammation Research International Center

In vitro

In vivo

IL-10

IL-12 IFNg

TNFa +

24 h

2,4,6-TriNitroBenzene Sulfonic acid (TNBS) NO2

HSO3S

NO2 NO2

Acute colitis 0 1 2 3 4 5 7/ 8

4 cm

Control TNBS

4 8

0

Macroscopic score (Wallace)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

9 Macroscopic score

(means +/- SEM)

Wallace scores

***

**

** ** **

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

medium Lc. lactis Lc.lactis-2 L. acido L. saliv. E.coli B.longum B.longum-2 CIRM 129 CIRM 122 CIRM 119 CIRM 527 CIRM 456 CIRM 9 CIRM 138 CIRM 136 CIRM 131 CIRM 125 CIRM 514 CIRM 1 CIRM 512 CIRM 123 CIRM 135 CIRM 508 CIRM 139 CIRM 513 CIRM 127 CIRM 118 CIRM 516 CIRM 134 CIRM 121 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

medium Lc. lactis Lc.lactis-2 L. acido L. saliv. E.coli B.longum B.longum-2 CIRM 129 CIRM 122 CIRM 119 CIRM 527 CIRM 456 CIRM 9 CIRM 138 CIRM 136 CIRM 131 CIRM 125 CIRM 514 CIRM 1 CIRM 512 CIRM 123 CIRM 135 CIRM 508 CIRM 139 CIRM 513 CIRM 127 CIRM 118 CIRM 516 CIRM 134 CIRM 121

IL-10

L’ANR SURFING en quelques mots

IL-10 

Inflammation

L’ANR SURFING en quelques mots

O’Flaherty, 2011, Gut Microbes

Lactobacillus delbrueckii Propionibacterium freudenreichii

Bactéries propioniques et lactiques

Let’s make probiotic

cheese!!!

Un fromage par ingénierie réverse

Microfiltr. Milk Powder 100 g/L Cream 150 g/L

Sterilisation

Culture P. freudenreichii 30°C, 72 h

Pre-cheese

UHT Milk Culture L. delbrueckii

42°C, 4 h Fermented Milk Clotting, stirring, cooking,

moulding, pressing, wrapping, ripening

0 2 4 6 8 10

Individual Ameho Score

*

*

Healthy CTL MTX

# Pf

+TNBS

CTL + TNBS Healthy

Milk +Ld+ TNBS Milk + TNBS

100 µm 100 µm

100 µm 100 µm

*

*

*

Le fromage protège

2,4,6-TriNitroBenzene Sulfonic acid (TNBS) NO2

HSO3S

NO2 NO2

Acute colitis 0 1 2 3 4 5 7/ 8

4 cm

Control TNBS

4 8

0

Macroscopic score (Wallace)

D0 D1 D2 D3 75

80 85 90 95 100 105 110

Body weight (% of initial)

Healthy CTL MTX Pf

*

*^#

* *

*^{# +}

TNBS

HealthyCTL MTX Pf 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mice number Live

Dead

+ TNBS

Body weight Survival

Le fromage protège

Blood inflammation markers

Healthy CTL MTX Pf 0

1000 2000 3000 4000

IL-6 (pg/ml)

* *^#

+ TNBS

Healthy CTL MTX Pf 0

10000 20000 30000 40000 50000

SAA (mg/ml)

*

*^#

+ TNBS

Serum Amyloid A Interleukin 6

Le fromage protège

Colonic inflammatory markers

Healthy CTL MTX Pf 0

2 4 6 8 10 12

MPO (AU)

*

*^#

+ TNBS

Healthy CTL MTX Pf 0

250 500 750 1000 1250

Il6 mRNA levels (2^-DDCt)

* *^#

+ TNBS

Healthy CTL MTX Pf 0

50 100 150 200

Il1b mRNA levels (2^-DDCt)

*

(*⁾#

+ TNBS

Colonic oxidative stress markers

Healthy CTL MTX Pf 0

10 20 30 40 50

Cox2 mRNA levels (2^-DDCt)

* *^(#)

Healthy CTL MTX Pf 0

20 40 60 80

Nos2 mRNA levels (2^-DDCt)

*

*^(#)

Healthy CTL MTX Pf 0

10 20 30 40 50

Hmox mRNA levels (2^-DDCt)

*

*^#

Le fromage protège

Colonic epithelial cell markers

Healthy CTL MTX Pf 0.0

0.5 1.0 1.5

Zo1 mRNA levels (2^-DDCt) *^#*

+ TNBS

Nagaoka, Nature Communications, 2012

* p<0.05: vs CTL

# p<0.05: vs MTX

Healthy CTL MTX Pf 0.0

0.5 1.0 1.5

Pparg mRNA levels (2^-DDCt)

*^#

+ TNBS

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) regulate T-cell cytokine production.

The zona occludens proteins (ZO-1, ZO-2 and ZO-3) : tight junction proteins that function as cross-linkers

Le fromage protège

Mais c’est toujours un fromage de labo

Selected probiotics Selected starters

Immunomodulation Digestion Intestinal pain

Texture Aroma Acidification

2-en-1 bacteria

Propionibacterium freudenreichii Streptococcus thermophilus

Lactobacillus delbrueckii

On veut de l’Emmental

PBS control DSS

50 μm Probiotic Emmental Noninflamed control

50 μm

50 μm Continuous gavage, 10 days

Cet Emmental protège (pas tous les fromages)

- GIT Chronic inflammation IBD

Ulcerative Colitis

Mucositis

5-Fluoracil (5-FU)

- Head, neck and colon cancer.

GI Mucositis

Oral mucositis

(Chang et al., 2012; Falveyet al., 2015)

Un lait fermenté pour la mucite (mucositis)

PBS Control YEL media CB 129 WT PBS Control YEL media CB 129 WT 0

5 1 0 1 5

P . f r e u d e n r e i c h i i C B 1 2 9 x M u c o s it is

Histopathological scores

S a lin e 5 -F U

* * *

Inflamed Ileum- 5-FU Healthy Ileum

100µL 100µL

100µL

P. f CB129 5-FU

However, nobody drinks culture media ...

P. freudenreichii ameliorates mucositis in mouse model (5-FU)

PBS + 5-FU

LDF + 138 + 5-FU LDFWPI + 138 + 5-FU Representative images from mucosal histopathology (H&E)

P. freudenreichii ameliorates mucositis in mouse model (5-FU)

Fermented Milk by P.

freudenreichii 138 supplemented with Whey

Protein Isolate (WPI).

Healthy Ileum

PBS + 5FU

LDF + 138 + 5FU LDFWPI + 138 + 5FU Representative images of stained goblet cells (PAS)

Goblet cells counts

PBS Skim Milk + WPI Skim Milk + WPI + 138 Skim Milk + 138 PBS Skim Milk + WPI Skim Milk + 138 Skim Milk + WPI + 138

0 2 0 4 0 6 0 8 0

Goblet cells (number of cells per high-power field)

* * * *

* *

*

S a lin e 5 - F U

P. freudenreichii ameliorate mucositis in mouse model (5-FU)

Healthy Ileum

Conclusion:

√ Aliments fermentés : une source de bactéries probiotiques, mais pas que …

√ Des souches, des molécules et des mécanismes en cours d’étude

Perspectives :

√ Etudes précliniques et cliniques sur des produits fermentés

√ Produits fermentés pour populations cibles

Fermented foods : 30% of our diet A major source of bacteria : 10¹⁰per day!

A huge variety of bacteria

Houem Rabah

Fillipe Carmo

Song Huang