Analyse des réponses écophysiologiques et moléculaires lors d'une carence hydrique sévère chez Populus nigra

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Analyse des réponses écophysiologiques et moléculaires lors d’une carence hydrique sévère chez Populus nigra

Pierrick Benoit

To cite this version:

Pierrick Benoit. Analyse des réponses écophysiologiques et moléculaires lors d’une carence hydrique sévère chez Populus nigra. 2014, 14 p. �hal-01268731�

Rapport de stage Master 1 : Biologie et Environnement

Spécialité Génomique Ecophysiologie et Production Végétales Université Blaise Pascal Clermont II, UFR Sciences et Technologies

Analyse des réponses écophysiologiques et

moléculaires lors d’une carence hydrique sévère chez Populus nigra

Présenté par : BENOIT Pierrick

Membres du Jury : DECOURTEIX Mélanie, JULIEN Jean-Louis et LEGUE Valérie

Soutenu le 3 Septembre 2014

Rapport de stage Master 1 : Biologie et Environnement Spécialité Génomique Ecophysiologie et Production Végétales Université Blaise Pascal Clermont II, UFR Sciences et Technologies

Laboratoire d’accueil : laboratoire Physique et Physiologie Intégratives de l’Arbre Fruitier et Forestier (PIAF)

Stagiaire : BENOIT Pierrick

Responsables de stage : GARAVILLON Marie et LABEL Philipe

Stage effectué du 02 Juin 2014 au 18 Juillet 2014

Remerciements

Tout d’abord je tiens à remercier Jean-Louis Julien pour m’avoir accueilli au sein du laboratoire PIAF dans le quel l’ambiance était toujours au beau fixe.

Je remercie grandement Philippe Label et Marie Garavillon pour m’avoir encadré durant ces 8 semaines de stage qui m’ont permis d’approfondir mes connaissances dans le domaine de l’écophysiologie végétale et de la biologie moléculaire mais surtout de m’avoir initié au monde de la bioinformatique et des statistiques.

Je remercie également Aurélie Gousset, pour l’attention portée à l’avancé de mon stage, ainsi que Boris Fumanal et Jean Stéphane Venisse pour leurs coups de main à tous les 3 durant les manips parfois exténuantes et leur bonne humeur toujours au rendez-vous.

Merci aux techniciens et aux ingénieurs du PIAF pour leur aide dans l’installation du matériel et leur savoir faire technique qu’ils ont su transmettre, je pense notamment à Nicole Brunel dans le domaine de la cytologie et Pierre Conchon et Romain Souchal pour le calibrage des LVDT et des balances.

Merci aussi aux deux stagiaires Adrien et Romain avec qui j’ai partagé de nombreux moments

agréables qui nous ont permis de tenir durant ce stage.

Résumé

La feuille est un organe clés de la plante qui, grâce à son architecture complexe, permet la mise en place de nombreux points de contrôle des flux d’eau. Chez des arbres en carence hydrique, il est mis en évidence deux stratégies écologiques basées sur le compromis entre la production de biomasse et la rétention de l’eau foliaire.

Dans ce travail, il est question de comprendre de quelle manière le peuplier noir, une espèce hygrophile, répond à un stress hydrique sévère au travers de ces feuilles sur les plans écophysiologique et transcriptionnel. Pour cela, 6 génotypes de Populus nigra sont soumis à un stress hydrique sévère fixé par le potentiel de base (Ψbase) de -20 bars et une perte de masse du sol de 25%. Il semblerait que la plasticité intra-génotypique soit plus forte chez SPM- 12 pour atteindre l’intensité du stress escompté que chez SPM-28. Les feuilles de SPM-28 se déshydratent plus que celles de SPM-12 (Relative Water Content faible et Conductance stomatique plus forte) alors que SPM-28 maintient son métabolisme primaire (Water Use Efficiency intrinsic stable). Le profil de transcription des aquaporines PIP2, intervenant dans la régulation des flux d’eau transcellulaires du mésophylle, semble être génotype spécifique : les PIP2;4, PIP2;7 et PIP2;10 sont sous-exprimés chez SPM-12 alors que ce n’est le cas que pour PIP2;7 chez SPM-28. SPM-12 régulerait principalement son flux d’eau foliaire la diminution de ces canaux au niveau du plasmalemme ce qui n’est pas le cas de SPM-28. Les profils isohydrique de SPM-12 et anisohydrique de SPM-28 se retrouvent chez d’autres génotypes mais avec des variantes de réponses. Une étude approfondie du transcriptome permettrait de comprendre cette plasticité de réponses intra- et inter-génotypiques.

Mots clés : stratégie écologique, Populus nigra, plans écophysiologique et transcriptionnel, plasticité de réponses intra- et inter-génotypiques

Abstract

Leaf is a key organ of the plant which, thanks to its complex architecture, allows the implementation of many checkpoints water flux. In trees in water stress, it is revealed two ecological strategies based on compromise between biomass production and leaf water retention. In this work, we want understand how the black poplar, an hygrophile specie, responds to severe water stress by their leaves on the eco-physiological and transcriptional levels. For this, six genotypes of Populus nigra are under severe water stress determined by the potential (Ψbase) - 20 bars and a decrease of soil moisture by 25%. It seems that the intra-genotypic plasticity is higher among SPM- 12 to achieve the desired intensity than SPM-28. The leaves of SPM-28 become dehydrated more than SPM-12 (Relative Water Content low and Stomatal conductance higher), although SPM-28 maintains its primary metabolism (Water Use Efficiency intrinsic stable). The transcription profile of aquaporins PIP2, involved in the regulation of mesophyll transcellular water flow, appears to be genotype specific: the PIP2;4, PIP2;7 and PIP2;10 are under-expressed in SPM-12 when it is only the case for PIP2;7 in SPM-28. SPM-12 mainly would regulate the leaf water flow by reducing these channels in the plasma membrane which is different for SPM-28. The profiles isohydric SPM-12 and anisohydric SPM-28 profils are found in other genotypes, but with variations of responses.

A depth study of the transcriptome would understand this plasticity of intra-and inter- genotype responses.

Keywords : ecological strategy, Populus nigra, ecophysiological and transcriptional plans, plasticity of intra-and inter- genotype responses

Table des sigles et des abréviations

A : photosynthèse

ABA : Acide Abscicique

ADN(c) : Acide Désoxyribo Nucléique (complémentaire) ARN(t) : Acide Ribo Nucléique (totaux)

CO

: molécule de Dioxyde de carbone DW : masse sèche

EA : Environnement et Agronomie

EFPA : Ecologie des Forêts, Prairies et milieux Aquatiques gs : conductance stomatique

H

O : molécule d’eau HR : Humidité Relative

HYDRO : Hydraulique et résistance à la sécheresse des arbres INRA : Institut National de Recherche Agronomique

K : conductance

MEA : Micro-Environnement et Arbre

MECA : Contraintes Mécaniques et Activité des zones en croissance MIP : Major membrane Intrinsic Protein

NIP : Nodulin-26-like Intrinsic Protein NPA : N : asparagine, P : proline et A : alanine PAR : Photosynthetically Active Radiation

PIAF : Physique et Physiologie Intégratives de l’Arbre Fruitier et Forestier PIP : Plasma membrane Intrinsic Protein

P.nigra : Populus nigra (peuplier noir) PP2C : Protein Phosphatase -2C

Ψ(

: Potentiel hydrique (de la feuille / de base / minimum) R : resistance

RWC : Relative Water Content

SIP : Small basic membrane Intrinsic Protein TIP : Tonoplast membrane Intrinsic Protein TW : Turgescent Weight

UBP : Université Blaise Pascal UMR : Unité Mixte de Recherche W : Weight

WUE(i) : Water Use Efficiency intrinsic

XIP : X (pour non reconnue) Intrinsic Protein

Table des figures et des tableaux

 Figures :

Numéro Titre Page

Figure 1 les différentes voies de transport de l’eau dans le mésophylle 2

Figure 2

2

Figure 3

3

Figure 4 structure d’une aquaporine végétale 4

Figure 5 plan de la parcelle expérimentale 5

Figure 6 détermination du potentiel hydrique foliaire grâce à une chambre à pression

(A) et une observation du pétiole (B) 6

Figure 7 perte de masse des pots de P.nigra de conditions hydriques variables 8

Figure 8 potentiel hydrique foliaire de base Ψ

lors de l’arrêt du stress en fonction

des génotypes de P.nigra 9

Figure 9 durée de la carence hydrique des P.nigra en fonction des génotypes 9

Figure 10 Relative Water Content (RWC) lors de l’arrêt du stress hydrique en fonction

des génotypes de P.nigra 10

Figure 11 taux de fermeture des stomates après un stress hydrique en fonction des

génotypes de P.nigra 10

Figure 12 opposé du potentiel hydrique foliaire minimum Ψ

lors de l’arrêt du stress

en fonction des génotypes de P.nigra 10

Figure 13

Water Use Efficiency intrinsèque (WUEi) lors de l’arrêt du stress hydrique en

fonction des génotypes de P.nigra 10

Figure 14

expression relative des transcrits codant les aquaporines PIP2;4, PIP2;7 et PIP2;10 de limbe de feuille pour les 6 génotypes de P.nigra en condition de stress

11

 Tableaux :

Numéro Titre Page

Tableau I liste des génotypes de Populus nigra utilisés en fonction de leur provenance 5

Tableau II composition du mix final pour les qPCR 8

Tableau III liste des amorces des gènes utilisés pour les RTqPCR 8

SOMMAIRE

1. Introduction ... 1

1.1.Présentation du laboratoire d’accueil ... 1

1.2.Etat de l’art ... 1

1.2.1. Contexte de l’étude ... 1

1.2.2. Le mouvement de l’eau dans la plante ... 2

1.2.3. La gestion de l’eau par la plante ... 3

1.2.4. Les aquaporines ... 4

1.3.Objectif du stage ... 4

2. Matériels et méthodes ... 5

2.1.Matériel biologique ... 5

2.2.Carence hydrique contrôlée ... 5

2.3.Méthodes ... 5

2.3.1. Mesures écophysiologiques ... 5

2.3.1.1.Potentiel hydrique ... 5

2.3.1.2.Relative Water Content (RWC) ... 6

2.3.1.3.Variation de masse hydrique ... 6

2.3.1.4.Physiologie de la feuille ... 6

2.3.1.5.Water Use Efficiency intrinsic (WUEi) ... 7

2.3.2. Analyse des réponses moléculaires ... 7

2.3.2.1.Extraction des ARN totaux ... 7

2.3.2.2.Synthèse d’ADN complémentaire par RT-PCR ... 7

2.3.2.3.PCR Quantitative relative avec SybrGreen ... 7

2.3.3. Analyses statistiques ... 8

3. Résultats et discussion ... 8

3.1.Résultats ... 8

3.1.1. Carence hydrique contrôlée et évaluation du niveau de stress ... 8

3.1.2. Etat hydrique foliaire ... 9

3.1.3. Etat physiologique ... 10

3.1.4. Importance de la voie transcellulaire du mésophylle ... 11

3.2. Discussion ... 12

4. Conclusion et Perspectives ... 13

4.1.Apports personnels ... 14

Bibliographie

1. Introduction

1.1.Présentation du laboratoire d’accueil

Le Laboratoire PIAF (Physique et Physiologie Intégratives de l’Arbre Fruitier et Forestier) est une UMR (Unité Mixte de Recherche) entre l’UBP (Université Blaise Pascal) et l’INRA (Institut National de Recherche Agronomique). L’UMR PIAF fait partie de deux départements de l’INRA, Environnement et Agronomie (EA) et Ecologie des Forets, Prairies et milieux Aquatiques (EFPA). Les recherches du laboratoire sont inscrites dans le champ thématique n°2 du département EA : « Ecophysiologie végétale » et visent à répondre à son Enjeu Structurant n°1 « L’adaptation des cultures aux nouveaux contextes agricoles ». Les travaux effectuées au sein de cette structure sont axées sur les caractéristiques écophysiologiques et moléculaires ainsi que les déterminants génétiques des arbres en réponses à leur environnement. Le PIAF se compose de 3 équipes pluridisciplinaires et bien spécifiques à un domaine d’étude :

- l’équipe HYDRO (Hydraulique et résistance à la sécheresse des arbres) travaille sur les aspects physiologiques et génétiques régulant le fonctionnement hydraulique des arbres et leurs capacités d’adaptation face aux carences hydriques, en unissant écophysiologie, hydromécanique et biologie moléculaire.

- l’équipe MEA (Micro-Environnement et Arbre) consacrée à l’étude du fonctionnement de l’arbre en relation avec le microclimat existant au niveau du feuillage et à la gestion des ressources minérales (carbone/azote) liée aux mécanismes de résistances aux contraintes environnementales telles que le gel ou les bioagresseurs.

- l’équipe MECA (Contraintes Mécaniques et Activité des zones en croissance) couplant les compétences de biomécaniciens et de physiologistes moléculaires est en charge d’appréhender les phénomènes de mécanoperception régulant la croissance et le développement du végétal.

Un des objectifs de l’unité est de proposer d’une part des génotypes et écotypes d’arbres plus résistants aux événements climatiques extrêmes à venir. Et d’autre part, des modes de conduites culturales afin de limiter le développement des bioagresseurs et la quantité de produits phytosanitaires utilisés. Ceci améliorant ainsi la durabilité et l’efficacité des réponses des arbres aux facteurs environnementaux abiotiques (hydrique, mécanique, minéral, thermique, lumineux) et biotiques (bioagresseurs).

1.2. Etat de l’art

1.2.1. Contexte de l’étude

Le climat mondial est en constante évolution en raison notamment des activités anthropiques, la tendance générale allant vers un réchauffement global de la planète. En effet, des prévisions récentes montrent une tendance à la hausse des températures et une raréfaction des précipitations en particulier

1

Figure 1 : les différentes voies de transport de l’eau dans le mésophylle (source : http://www.cours- pharmacie.com/biologie-vegetale/). Les molécules d’eau se déplacent entre les cellules par le cytoplasme (voie symplasmique en bleu), par les méats et espaces extracellulaires (voie apoplastique en gris) et par des transporteurs membranaires (voie transcellulaire en rose).

Figure 2 : le continuum sol/plante/atmosphère (source : www.Futura-Sciences). Le sol contient la réserve d’eau qui est puisée, conduite et utilisée par l’arbre des racines aux feuilles selon un gradient de potentiel décroissant (Méga Pascal, MPa). Le flux d’eau continu est généré par la transpiration foliaire à l’interface plante/atmosphère, la chambre sous-stomatique.

dans le sud de l’Europe. (Beniston et al., 2007) lors de la période sèche ; entrainant une augmentation de la durée et une précocité des périodes de sécheresse ainsi qu’une de la fréquence de ces événements. Une modification de l’aire de répartition des arbres est attendue avec notamment un déplacement de certaines populations vers le nord de leur aire de répartition. Ces modulations géographiques des forêts vont avoir des répercutions au niveau de la biodiversité, de l’équilibre des habitats écologiques mais également en termes économiques car des sécheresses répétées diminuent grandement la productivité agronomique (Peng et al., 2011). La disponibilité en eau est un des facteurs abiotiques à prendre en compte lors de l’établissement de pratiques culturales et dans la protection de populations déjà établies, car l’eau est essentielle pour le développement, la croissance et la survie de l’arbre.

1.2.2. Le mouvement de l’eau dans la plante

L’eau est acheminée des racines jusqu’aux feuilles via les tissus conducteurs (le xylème) où elle sera utilisée comme matière première pour la production de biomasse via la photosynthèse. Plusieurs forces rentrent en jeu dans l’acheminement de l’eau jusqu’au sommet de l’arbre : i) la transpiration foliaire est le moteur principal de la montée de la sève brute (contenant 93-99% d’eau, des sels minéraux et des traces d’acides aminés), ii) la poussée racinaire permet à l’eau de pénétrer dans les racines et de progresser à travers les vaisseaux et trachéides sur quelques centimètres , iii) des forces antagonistes qui opposent des résistances à la montée de la sève brute comme la pesanteur (tension gravimétrique) et les forces de frottement dans les tissus conducteurs. Néanmoins ces dernières restent totalement négligeables par rapport à la transpiration, hors mis la pesanteur pour des arbres supérieur à 10 mètres de hauteurs.

L’interface stomates/atmosphère est le lieu du changement d’état de l’eau liquide en eau gazeuse qui est dû à un différentiel important et brusque de la tension hydrique (pression négative). Ceci, couplé à la tension hydrostatique des molécules d’eau, crée un appel d’eau de la chambre sous-stomatique jusqu’aux racines pour maintenir un flux d’eau continu : c’est le continuum sol/plante/atmosphère. L’eau est donc transportée grâce à la différence de potentiel existant entre l’interface racine/sol et l’interface stomate/atmosphère (Cochard and Granier, 1999) (Figure 1). De ce point de vue, la plante est donc une

« pompe » à eau avec un moteur (transpiration au niveau des feuilles) et un réseau de circulation. L’eau peut emprunter plusieurs voies dans ce réseau : sur de longue distance (quelques centimètres à plusieurs mètres) l’eau circule à travers les tissus des xylèmes composés de cellules mortes et vides, formant ce que l’on appelle des vaisseaux et des trachéides. Au niveau cellulaire, l’eau à trois options (Figure 2) :

- L’eau peut circuler uniquement dans les espaces extracellulaires (apoplasme), c’est la voie apoplastique.

- A contrario, l’eau transite de cellule à cellule par les plasmodesmes est reste dans le continuum cellulaire (symplasme), c’est la voie symplastique.

2

Figure 3 : les échanges gazeux à l’interface stomate/atmosphère (source : http//www1.svtaulycee.fr). Les molécules d’eau provenant des vaisseaux de xylèmes traversent la gaine périvasculaire puis empruntent des chemins différents (cellules photosynthétiques et/ou lacunes) jusqu’à la chambre sous-stomatique. A l’ouverture des stomates, le dioxyde de carbone (CO2) de l’atmosphère rentre dans la chambre sous stomatique alors que du dioxygène (O2) et de la vapeur d’eau (H2Ogaz) s’en échappent.

- Pour finir, une molécule d’eau est capable de suivre ces deux voies et effectue donc un trajet transcellulaire

Dans son transit des racines aux feuilles, une molécule d’eau traverse les plasmalemmes et d’autres membranes cellulaires (comme celle de la vacuole, tonoplaste) à l’aide de canaux protéiques nommés aquaporines. Le système hydraulique de la feuille fonctionne comme une résistance et s’oppose au passage de l’eau (Sack and Holbrook, 2006). C’est ce que montre le modèle de Zimmermann en décrivant le système hydraulique d’une une plante comme un système électrique où tous ses composants : organes, tissus et cellules appliquent une résistance.

1.2.3. La gestion de l’eau par la plante

Le débit d’eau perdu par transpiration au niveau des stomates dépend du degré de leur ouverture, de la pression de vapeur saturante hydrique (c’est la pression à laquelle la phase gazeuse d’une substance est en équilibre avec la phase liquide dans un système fermé, si il n’y a pas équilibre, une partie de la phase liquide se transforme en gaz pour « saturer » l’environnement et permettre l’équilibre entre les deux phases) à l’interface stomate/atmosphère et du pouvoir séchant de l’air, c’est ce qu’on appelle la conductance stomatique (gs ; mmol d’eau.m

.s

) L’eau suit donc un gradient de pression des cellules de la feuille vers l’air, à l’inverse du CO

qui passe de l’air vers les cellules chlorophylliennes (Figure 3) . Cette fuite d’eau par les stomates ouverts est inévitable car elle permet le maintien du continuum hydrique et nécessaire pour la photosynthèse (entrée de CO

) et la régulation de l’homéostasie cellulaire.

L’efficience d’utilisation de l’eau intrinsèque (ou Water Use Efficiency : WUE) caractérise cette relation entre la perte d’eau et la fixation de CO

.

Lors d’une carence en eau, deux stratégies majeures sont adoptées par les plantes :

- une stratégie anisohydrique qui permet le maintien de la production de biomasse (via la photosynthèse) en consommant et perdant de l’eau par transpiration au risque d’épuiser les réserves hydrique du sol.

- une stratégie isohydrique réduisant le métabolisme et la croissance au minimum vital au profit de la conservation des réserves hydriques.

Il est donc intéressant de savoir comment et à quel niveau de la feuille la plante module sa conductance hydraulique et donc sa consommation d’eau. Le potentiel hydrique est dépendant de la conductance hydraulique (K) de l’arbre et notamment de la conductance hydraulique de la feuille (K

)(Sack and Holbrook, 2006). Par convention la conductance (K) est l’inverse de la résistance (R) (K=1/R). Ainsi, si la conductance augmente, la résistance imposée au débit d’eau diminue et la quantité d’énergie pour transporter une molécule d’eau des racines à la chambre sous-stomatique est moins importante. Au contraire si les résistances augmentent, l’eau sera retenue dans les tissus et l’énergie déployée pour extraire une molécule d’eau des cellules foliaires devra être plus importante, cette énergie est représentée

3

Figure 4 : structure d’une aquaporine végétale (source : http://www.erudit.org/revue/MS/2005/). Celle-ci est composée de six domaines intramembranaires (1-6) ainsi que cinq boucles d’acide aminé (A-E).

L’ouverture/fermeture du canal central est modulée par des motifs comme le motif NPA très conservés (N : asparagine, P : proline et A : alanine).

par le potentiel hydrique foliaire. L’arbre est capable de moduler sa conductance hydraulique permettant de contrôler sa consommation d’eau via la transpiration. De récents travaux (Cao et al., 2014) étudient les réponses de deux génotypes contrastés de peuplier face à un stress hydrique. Ces réponses sont très spécifiques des génotypes : une modification de la nervation et de l’épaisseur des feuilles ; une augmentation significative des phosphatases (de type PP2C) et des dioxygénases intervenant dans la voie de synthèse de l’ABA (Acide Absissique), avec des répercussions potentielles sur la croissance des organes végétatifs ; et une variation positive et/ou négative du taux de transcrits des aquaporines PIP (Plasma membrane Intrinsic Proteins).

1.2.4. Les aquaporines

Les aquaporines sont des canaux protéiques transmembranaires, appartenant à la famille des MIPs (Major Intrinsic Proteins), présentes dans les cellules végétales comme animales. Ces protéines facilitent le transport de l’eau et d’autres solutés de petite taille (urée, acide silicique…) ou gaz (CO

) (Maurel et al., 2008). Il existe 5 familles d’aquaporines qui se différencient entre autre par leur localisation : les PIPs (Plasma membrane Intrinsic Proteins), les TIPs (Tonoplast Intrinsic Proteins), les NIPs (Nodulin-26-like Intrinsic membrane Proteins), les SIPs (Small basic Intrinsic Proteins) et les XIPs (X (pour non reconnu) Intrinsic Proteins) (Lopez et al., 2013). Cette famille multigénique comporte 35 isoformes d’aquaporines chez Arabidopsis thaliana. Ces tétramères de 23-31 kDa possèdent 6 domaines transmembranaires. La succession d’acides aminés forme cinq boucles (A, B, C, D et E), qui interviennent dans le mouvement au sein du cytoplasme (traffiking) et l’activation/inhibition du transport des molécules. Deux motifs NPA (N : asparagine, P : proline et A : alanine), très conservés, forme un étranglement au niveau du canal appelé le « pore » et permettent la scission des liaisons hydrogènes entre les molécules d’eau et ainsi leur passage individuel à travers la membrane (figure 4). L’activité et la spécificité des aquaporines sont affectées par des transformations biochimiques comme une phosphorylation ou une méthylation et des interactions protéine/protéine. Une hétéromérisation entre PIP1s et PIP2s (2 sous-classes de PIPs) facilite la translocation membranaire des PIP1s (Sack and Holbrook, 2006), ainsi que le transport de l’eau.

L’importance des aquaporines est effective, ainsi elles accélèrent le retour à un état hydrique de base d’une plante suite à un stress hydrique (Siefritz, 2002). Ce phénomène est retrouvé dans de nombreuse études (Cohen et al., 2013), et chez plusieurs espèces notamment chez le tabac (Siefritz, 2002) et Arabidopsis (Martre, 2002), et prend tout son sens quand on prend conscience de la forte affinité pour l’eau de ces protéines et leurs fonctions dans la gestion de l’état hydrique cellulaire (Maurel et al., 2008).

1.3. Objectifs du stage

La thématique au sein de laquelle mon travail s’est insérer est la variabilité de la réponse écophysiologique et moléculaire du peuplier noir face à un stress hydrique.

4

Tableau I : liste des génotypes de Populus nigra utilisés en fonction de leur provenance.

ALL-29-5 STR-16-3 SPM-12-1 RHN-35-20 72-501-14 RHN-38-12 ERS-05-5 SPM-28-5 BDG-3 77-308-5 ALL-29-10 ERS-12-4 ALL-29-2 SPM-28-17 STR-10-14 SPM-12-3 SPM-28-1 SPM-28-14 STR-10-1 SPM-40-1 STR-10-3 ERS-12-14 STR-10-2 ALL-29-15 ALL-29-1 ERS-05-11 SPM-12-2 SPM-40-15 SPM-40-5 ERS-05-2 SPM-12-12 ERS-05-17 POLY-11 SPM-40-13 SPM-28-8 STR-10-16 ALL-29-3 SPM-28-7 STR-10-17 SPM-40-8 ERS-05-9 SPM-12-4 ALL-29-4 SPM-40-9

POLY-2 SPM-12-15 ERS-05-3 SPM-12-14 STR-10-4 SPM-28-16 STR-10-15 SPM-40-16 SPM-40-17 SPM-40-18 STR-10-12 ERS-12-6 ALL-29-18 ERS-05-18 ALL-29-16 SPM-28-3 ERS-05-20 SPM-28-15 SPM-40-6 STR-10-5 ALL-29-17 ERS-12-8

77-308-16 ERS-05-6 SPM-12-17 SPM-12-5 ALL-29-8

BDG-10 SPM-28-4 ERS-05-11 RHN-28-2 72-501-19 RHN-35-3 SPM-12-6 STR-16-4 ERS-10-2 ERS-10-9

Figure 5 : plan de la parcelle expérimentale. Les peupliers noirs (Populus nigra) utilisés pour l’expérimentation (cadre noir) sont arrosés (témoins en bleu) ou non (stressés en orange). Il porte tous un matricule de type :

« GENOTYPE-Numéro de l’individu », par exemple ALL-29(génotype)–2(individu). Les individus non encadrés en périphérie font partis de la barrière biologique destinés à la protection de la parcelle contre les agresseurs biologiques ou les aléas climatiques (vent par exemple).

Codes Longitude Latitude WUE Population Métapopulation

ALL-29 3.19 46.24 22.77 RN Val Allier Val de l’Allier

ERS-05 7.43 48.25 20.5 Erstein Rhin

SPM-12 1.48 47.51 20.93 St Pryvé St Mesmin Saint-Pryvé (Loire)

SPM-28 1.48 47.51 21.89 St Pryvé St Mesmin Saint-Pryvé (Loire)

SPM-40 1.48 47.51 22.74 St Pryvé St Mesmin Saint-Pryvé (Loire)

STR-10 7.49 48.37 20.71 Strasbourg Rhin

L’objectif de ce stage est de déterminer des tendances dans la plasticité des réponses écophysiologiques et moléculaires de différents génotypes de peuplier noir en se basant sur : le suivi de l’état hydrique de la plante représenté par des variables comme le potentiel hydrique et la photosynthèse ; et l’évaluation de taux de transcrits d’aquaporines de type PIPs pour mettre en évidence l’importance de la voie transcellulaire du mésophyle intervenant dans la régulation des flux et réserves d’eau au sein de la feuille.

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériel biologique

48 peupliers noirs, Populus nigra, ont été utilisés pour cette expérience. 6 génotypes de Populus nigra issus de la collection nationale de la pépinière expérimentale de Guéméné-Penfao (Loire atlantique) ont été obtenus grâce à une collaboration avec l’Unité de Recherche 0588 (Amélioration, Génétique et Physiologie Forestières) et l’Unité Expérimentale de Génétique et Biomasse Forestières du Centre INRA d’Orléans-Tours. Ces peupliers ont été choisis sur la base de leur efficience d’utilisation de l’eau et de leur distribution géographique (Tableau I). Les plants sont âgés de 2 ans, ils ont été rempotés au printemps dans un mélange de terreau dans des potes de 25 litres. Les peupliers sont disposés aléatoirement en lignes et colonnes sur une parcelle plane en extérieur (Campus des Cézeaux, Clermont Ferrand) et isolée du sol par bâche. Les arbres sont espacés de 1 mètre en ligne et chaque ligne respecte un intervalle de 2 mètres. Une haie de peupliers en pots protège les 48 sujets de l’expérimentation des rafales de vents et crée une barrière biologique contre les prédateurs et parasites extérieurs. Ces arbres sont divisés en deux lots : un lot « témoin » de 24 arbres et un lot « stressé » également de 24 arbres (Figure 5).

2.2. Carence hydrique contrôlée

L’objectif de cette installation est de disposer les arbres dans des conditions naturelles avec un système d’irrigation contrôlé. Les peupliers reçoivent 2 litres d’eau par jour en 2 arrosages (un à 12h00 l’autre à 18h30) durant toute la durée de l’expérimentation. Le stress hydrique est appliqué par un arrêt d’arrosage (le 02/06/2014) et par un système d’exclusion des précipitations. L’arrêt du stress est spécifique de chaque arbre : les peupliers sont réarrosés lorsque leur potentiel de base atteints -20 bars (voir 2.4.analyse des réponses moléculaire).

2.3. Méthodes

2.3.1. Mesures écophysiologiques 2.3.1.1. Potentiel hydrique

5

Figure 6 : détermination du potentiel hydrique foliaire grâce à une chambre à pression (A) (source : http://www.memoireonline.com) et une observation du pétiole (B) (source personnelle).A/ La chambre hermétique (b) contenant la feuille est remplie de diazote comprimé (a). La pression est contrôlée grâce à un manomètre (d) en attendant que la goutte d’eau apoplastique apparaisse à l’extrémité du pétiole à l’extérieur de la chambre (c). B/ La goutte d’eau apparait lorsque que la pression appliquée à l’intérieur de la chambre est supérieure ou égale à la tension hydrique à l’intérieur de la feuille. Cette pression correspond au potentiel hydrique foliaire (Ψfeuille).

Le potentiel hydrique foliaire est mesuré à l’aide d’une chambre à pression (dite de Scholander, Model 1505D de chez PMS Instrument Company). Une feuille mature et pleinement étalée, de rang 5, est prélevée directement sur l’arbre par coupe franche et la mesure est faite dans la minute qui suit. La feuille est installée pétiole vers l’extérieur de la chambre et une pression est progressivement appliquée à

l’intérieur (Figure 6a). L’eau apoplastique de la feuille est visible à l’extrémité du pétiole sous forme d’une goutte. Lorsque celle-ci est visible (Figure 6b), la pression (en bar) inscrite sur le manomètre correspond à la tension hydrique à l’intérieur de la feuille : c’est le potentiel hydrique de la feuille (Ψ

).

Deux mesures différentes sont réalisées quotidiennement, le potentiel de base (Ψ

) correspondant à l’état d’équilibre hydrique entre le sol, la plante et l’atmosphère est mesuré de nuit (4h-5h du matin).

Celui-ci représente la tension hydrique la plus faible (entre -0,1Mpa et 0Mpa pour les plantes en condition hydrique non limitante) et est représentatif de l’état de stress hydrique de la plante. Et le potentiel

minimum (Ψ

) mesuré durant le midi solaire (12h30-1h30) correspondant à la tension hydrique la plus élevée que la plante subit lors d’une journée. Ce dernier est intimement lié à la transpiration et la

conductance stomatique des feuilles.

2.3.1.2. Relative Water Contenance (RWC)

La quantité d’eau relative contenue dans la feuille est calculée à l’aide d’un rapport de différence entre masse fraiche (W) et masse sèche (DW) sur masse turgescente (TW) et masse sèche (DW). La masse fraiche est mesurée immédiatement après prélèvement de la feuille. La feuille est réhydratée durant 24h et repesée pour obtenir le TW. Puis elle est placée à l’étuve à 60°C pendant 4 jours pour éliminer toute trace d’eau et ainsi obtenir le DW. Cette valeur permet d’apprécier la turgescence de la feuille à un temps donner par rapport a une turgescence maximal.

RWC (%) = (W-DW)/(TW-DW)

2.3.1.3.Variations de masse hydrique

20 arbres sont positionnés sur une plateforme de pesée automatique. Le reste des arbres (28) est pesé manuellement tous les matins à 7h00 à l’aide d’une balance appropriée.

2.3.1.4.Physiologies de la feuille

La conductance stomatique (g

), la photosynthèse de la feuille (A), la luminosité (Quantum en µmol de photon.m

.s

) et l’humidité relative (HR) de l’environnement sont mesurées à l’aide de 3 appareils : un Poromètre (Model SC-1 de Decagon Devires), un Li-cor 1600 et un Li-cor 6400. Les mesures sont faites sur une seule feuille, pour chaque individu, de rang 5, mature, pleinement étalée et non abimée durant toute l’expérimentation quotidiennement. La mesure de photosynthèse est réalisée uniquement à partir du Li-cor 6400, l’appareil est calibré au préalable puis les conditions imposées à la feuille sont les

6

Tableau II : composition du mix final pour les qPCR. Trois répétitions techniques (triplicat) sont réalisées pour chaque couple d’amorce. Le volume final est de 15µL.

Tableau III : liste des amorces des gènes utilisés pour les RTqPCR. Le programme de base de qPCR est le suivant : 1 cycle 3 min à 95°C, 40 cycles (10 sec à 95°C, 15 sec à Temperature d'annealing °C, 15 sec à 72°C), 1 cycle 2 min à 72°C.

Composants Quantité (µL)

MasterMix 2X Plus for SYBR Green 1. Eurogentec

(ref : RT-SN2X-03+NRFL) 7,5

Eau DEPC 4,9

Amorce sens (200 nM) 0,3

Amorce anti-sens (200 nM) 0,3

ADNc 2,0

Espèce Gènes Amorce sens Amorce anti-sens Température

d’annealing (°C)

Populus nigra

PIP2 ;4 CCAACGGTTTTAAATCTCG GTTC

ACCGAAAGGGATAATAAAG

GG 54,0

PIP2 ;7 ATGACCATTGGCTCTTCTG

G GGCTTTAAGCATTGCTCCTG 54,0

PIP2 ;10 CACAGTCGTGGTCAAGATG TC

ACTAGTTGATTATGAGATAG

GGAG 54,0

TIP41-like TAGTGATAGTGCAAATCCT GTCA

CTTACAAGTTACTGTGGACC

AC 58,8

Actine 1 GAAGTGCTTCTAAGTTCTA CAAG

CTCAATAAATTCTCCATATC

AACC 58,0

suivantes : quantité de CO

de l’air à 350µmol.m

.s

La température de feuille appliquée est de 25°C.

L’humidité doit être stabilisée entre 35-45%. La lumière émise à 1000µmol de photon.m

.s

couvrent toute les longueurs d’onde du PAR (photosynthetically active radiation). Une stabilisation de 5minutes des fluctuations des valeurs est nécessaire. Ensuite 3 mesures sont faites à 3 secondes d’intervalle et la moyenne est calculée pour obtenir la photosynthèse instantanée et réelle de la feuille.

2.3.1.5. Water Use Efficiency intrinsic (WUEi)

L’efficience intrinsèque ou instantanée d’utilisation de l’eau (Water Use Efficiency intrinsic or instantaneous, WUEi) est définie comme le rapport entre la quantité de carbone assimilé grâce à la photosynthèse et la quantité d’eau consommée via la transpiration pour le fixer. Cela reviens donc à faire le calcul suivant : photosynthèse (A) que divisé la conductance stomatique (gs) : WUEi = A/gs (en µmol de CO

/µmol d’H

O).

2.3.2. Analyse des réponses moléculaires

Toutes les manipulations de l’ADN ou ARN sont faites dans la glace à 4°C sauf contre-indications techniques. La conservation est également faite à -80°C pour échantillons frais, broyats et ARN et -20°C pour l’ADN. L’étude des réponses moléculaires se fait sur des feuilles néoformées, pleinement étalées, durant le stress hydrique prélevées le dernier jour du stress.

2.3.2.1. Extraction des ARN totaux

L’extraction d’ARN totaux est effectuée à partir de limbes broyés (environ 200mg) à l’azote liquide et suivant la méthode de Chang et al., (1993) méthode CTAB. La pureté et la concentration en ARN des échantillons sont vérifiées au Nanodrop (ND-1000 NanoDrop production, Wilmington-DE-USA).

L’échantillon est considéré comme suffisamment pur si le rapport DO 260/280 est compris entre 1,80 et 2,00 (rapport du taux d’ARN sur le taux de protéines). De plus, la quantité d’ARN doit excéder 200ng/µl pour être ensuite utilisable pour une RT-qPCR. La quantité d’ARN par échantillons n’était pas toujours suffisante pour la réalisation de gel de contrôle d’intégrité.

2.3.2.2. Synthèse d’ADN complémentaire par RT-PCR

La synthèse des ADN complémentaire (ADNc) a été réalisée à partir du kit Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogène) sur des aliquotes de 2µl contenant 1µg d’ARN.

2.3.2.3.PCR Quantitative relative avec SybrGreen

Afin de mettre en évidence l'abondance de certains transcrits dans les échantillons foliaires, des q- PCR sont réalisées à partir des ADNc dilués au 1/40

. Le mélange pour la qPCR est compose de

7

Figure 7 : perte de masse des pots de P.nigra de conditions hydriques variables. Les individus irrigués (témoin, n=18, bleu) ou non (stressé, n=10, blanc) ont été pesés quotidiennement. La différence de masse entre le premier et le dernier jour de stress est représentée par une boîte à moustaches. Un test T (Student) a été réalisé pour conclure sur l’effet du traitement hydrique (α=0.05, p-value= 0.0005174, ***p< 0.001 ; **0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

Figure 8 : potentiel hydrique foliaire de base Ψbase lors de l’arrêt du stress en fonction des génotypes de P.nigra.

Des mesures quotidiennes ont été réalisées en chambre à pression de Schölander. La valeur du dernier jour du stress est ici représentée pour chaque génotype (ALL-29, ERS-05, SMP-12, SPM-28, SPM-40 et STR-10) dans les conditions « témoin » (bleu) et « stressé » (blanc) par une boîte à moustaches (n=4 répétitions biologiques).

L’analyse de données est réalisée par une ANOVA à 2 facteurs (α=0.05, p-value= 2.0x10^-16, ***p< 0.001 ;

**0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

Mastermix 2X (MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBRAssay w/ fluorescein (Eurogentec)), d'amorces sens et anti-sens et d'ADNc au 1/40

pour un volume final de 15 μL (Tableau II). Les gènes dont l’expression a été suivies sont PIP 2;4 ; PIP 2;7 et PIP 2;10. Leur expression a été évaluée par la méthode du 2ΔΔCt (Pfaffl, 2001) en la rapportant à l’expression de gènes de références ACT1 et TIP41.

ACT1 (ACTINE1) est un des nombreux gènes codant pour des protéines d’actine importantes pour l’architecture et les mouvements cellulaires, il est souvent utilisé en biologie moléculaire comme gène de référence pour son niveau d’expression constant quelques soit le stade de développement et les conditions de vie de l’individu et chez plusieurs espèces végétale notamment Arabidopsi.sp et Populus.sp (Li et al., 2012). L’autre gène de référence utilisé pour cette expérience est le gène TIP41(Tonoplat Intrinsic Protein 41), les travaux de (Fan et al., 2013) montrent que le schéma d’expression du gène TIP41 est comparable à celui du gène ACT1 chez le bambou. D’autres recherches ont été effectuées en se basant sur l’expression de TIP41 chez la tomate (Expósito-Rodríguez et al., 2008). Les amorces ont été au préalable dessinées au laboratoire PIAF (Lopez et al., 2013)(Tableau III). L’amplification est réalisée par thermocycler Bio-Rad iQ5.

2.3.3. Analyse statistiques

La comparaison des résultats écophysiologiques et transcriptionnels entre les conditions « témoin » et

« stressé » pour chaque génotype et la comparaison des génotypes entre eux sont réalisées grâce à une ANOVA à 2 facteurs. La comparaison de perte de masse entre les 2 conditions a été faite grâce à un test T de Student. Les calcules et analyses statistiques sont effectués sous logiciel « R ». et « Rcommander ».

3. Résultats et discussion

3.1. Résultats

Avant de réaliser les analyses de variances (ANOVA), il a été vérifié que les réponses des répétitions biologiques étaient semblables.

3.1.1. Carence hydrique contrôlée et évaluation du niveau de stress :

Le facteur contrôlé durant cette expérimentation est l’irrigation des peupliers. Les individus témoins bénéficient d’un arrosage quotidien, tandis que les individus stressés subissent une déshydratation par un arrêt d’arrosage. Il est possible d’évaluer la perte en eau de chaque pot en calculant la différence de masse entre le début et la fin du stress. La variation de masse mesurée est le fruit de l’évapotranspiration, c’est- à-dire le changement d’état de l’eau liquide en gaz par la transpiration foliaire et l’évaporation provenant du sol. La masse que procurerait la synthèse de matière végétale est négligeable du fait que l’expérimentation s’inscrit dans une très courte période de croissance (une dizaine de jour). La figure 7

8

Figure 9 : durée de la carence hydrique des P.nigra en fonction des génotypes. Le stress a débuté le 02-juin pour les 24 arbres en condition « stressé » et est stoppé lorsque le potentiel hydrique de base de l’individu atteint -20 bars.

La durée du stress pour chaque génotype (ALL-29, ERS-05, SMP-12, SPM28, SPM-40 et STR-10) est ici représentée par une boîte à moustaches (n=4 répétitions biologiques). Une ANOVA à 1 facteur est réalisée (α=0.05, Pr=0.755, F-value= 0.526, Pr>F-value, ***p< 0.001 ; **0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

Figure 10: Relative Water Content (RWC) lors de l’arrêt du stress hydrique en fonction des génotypes de P.nigra.

Le Relative Water Content (RWC), montrant l’état d’hydratation de la feuille grâce à des mesures de masses foliaires des arbres témoins (bleu) et stressés (blanc), (cf :3.3.1 Mesures écophysiologiques). Les résultats sont représentés sous forme de boîte à moustaches (n=4 répétitions biologiques). Une ANOVA à 2 facteurs est réalisée (α=0.05, p-value= 0.00527, ***p< 0.001 ; **0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

indique que les individus témoins possèdent une réserve en eau du sol relativement constante. A noter toute de même une légère perte en eau de 2.5% représentant 1L d’eau qui est probablement due à la forte évaporation du sol non suffisamment compensée par l’arrosage, lors des jours de fort ensoleillement et de forte température. Les individus stressés présentent un déficit hydrique de l’ordre de 25% équivalent à 7L d’eau. Le traitement hydrique appliqué est alors suffisant pour générer une condition stressée significativement différente de la condition témoin.

La perte en eau du sol est ressentie par l’arbre. L’effet de cette carence hydrique peut être quantifié par l’évolution du potentiel hydrique foliaire de base. Cette variable a été mesurée le dernier jour de stress en fonction des différents génotypes et conditions (figure 8). L’analyse des données par une ANOVA 2 démontre une différence significat ive entre les deux traitements. En effet, le Ψ

des individus témoins est proche de 0 bar ce qui correspond à une bonne hydratation des tissus foliaires. En revanche, les individus stressés présentent un Ψ

avoisinant les -20 bars, correspondant à un niveau de stress hydrique sévère. De plus, l’analyse statistique prouve l’inexistence d’un effet génotype sur les valeurs de Ψ

. Ceci est logique puisqu’il avait été question de stopper le stress hydrique lorsque le Ψ

approchait -20 Bars Le stress hydrique appliqué a donc été identique entre les individus et les génotypes ce qui rend possible les comparaisons de réponses phénotypiques et transcriptionnelles.

Tous les individus n’ont pas franchi cette valeur seuil simultanément. La figure 9 représente la durée du stress en jour pour chaque génotype. L’ANOVA 1 facteur réalisée met en évidence une absence de différence significative de durée du stress entre les génotypes. Ceci peut être expliqué par la forte variabilité intragénotypique qui pourrait masquer une différence entre les génotypes lors du test statistique. Pour y remédier, il faudrait augmenter l’effectif de chaque génotype afin de diminuer les variances et ainsi faire apparaitre une différence intergénotypique. Il semblerait que la variabilité de certains génotypes pour atteindre le niveau de stress escompté soit plus faible chez STR-10 et SPM-28 que chez ERS-05 ou SPM-12. Or ces génotypes proviennent des rives de la Loire ou du Rhin. Donc leur origine géographique ne semble pas pouvoir expliquer cette différence de plasticité de réponse.

3.1.2. Etat hydrique foliaire :

Le contenu en eau des feuilles par rapport à un état de turgescence maximale (RWC) est mesuré en fin de stress pour chaque génotype (figure 10). L’analyse statistique (test ANOVA à 2 facteurs) montre une différence significative entre les individus témoins et stressés du même génotype. Mais une fois de plus, aucune différence intergénotypique n’est observée. Cela signifie qu’une carence hydrique diminue la quantité d’eau présente dans une feuille pleinement étalée. La diminution de RWC semble faible en passant de 95% chez les arbres témoins à 85% chez les individus stressés, notamment chez SPM-28.

Cependant, ceci a des répercussions phénotypiques avec l’observation d’un début de jaunissement et de flétrissement foliaires.

9

Figure 11 : taux de fermeture des stomates après un stress hydrique en fonction des génotypes de P.nigra. Le taux de fermeture des stomates est calculé à partir de la conductance stomatique du premier et du dernier jour de stress pour les individus témoins (bleu) et stressés (orange) de chaque génotype (ALL-29, ERS-05 SPM-12, SPM-28, SPM-40, et STR-10). L’analyse des données est faite par un test ANOVA à 2 facteurs (α=0.05, p-valu

e= 2x10

***p< 0.001 ; **0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

Figure 12 : opposé du potentiel hydrique foliaire minimum Ψmin lors de l’arrêt du stress en fonction des génotypes de P.nigra. Des mesures quotidiennes ont été réalisées en chambre à pression de Schölander. La valeur du dernier jour du stress est ici représentée pour chaque génotype (ALL-29, ERS-05, SMP-12, SPM-28, SPM-40 et STR-10) dans les conditions « témoin » (bleu) et « stressé » (blanc) par une boîte à moustaches (n=4 répétitions biologiques). L’analyse de données est réalisée par une ANOVA à 2 facteurs (α=0.05, p-value= 2.88x10^-05, ***p<

0.001 ; **0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

Cette altération d’état hydrique de la feuille s’accompagne également d’une fermeture presque totale des stomates. En effet, la figure 11 (ci-contre) montre une fermeture des stomates de l’ordre de 95% pour les individus subissant une carence hydrique, tandis que le comportement des stomates des individus témoins est hétérogène. Le taux de fermeture pour les témoins ne semble pas dépasser 40% sauf pour 3 individus de génotypes ALL-29, SPM-12 et SPM-40 qui atteint 60%. Ces trois résultats restent anecdotiques d’autant plus que ces 3 génotypes ne partagent pas la même origine (Val d’Allier et Loire respectivement). Néanmoins, la tendance pour les témoins reste une faible fermeture des stomates d’environ 20% et parfois même une ouverture des stomates (valeurs négatives), notamment pour les génotypes SPM-28 et SPM-40 originaires des rives de la Loire. La fermeture quasi-complète des stomates des arbres stressés est une réponse physiologique de défense face à la carence hydrique : cela a pour conséquence de diminuer significativement la conductance stomatique et ainsi réduire au minimum la fuite d’eau par la transpiration. Dans le cas d’une ouverture des stomates, cela permet aux peupliers d’accroitre le flux de matières premières (H

O et CO

) pour la synthèse de biomasse (photosynthèse).

Le potentiel hydrique foliaire minimum souligne également l’état de stress sévère ressentis par les individus dépourvus d’arrosage. La figure 12 représente l e Ψ

en fonction des conditions par génotypes. Le Ψ

pour les témoins est homogène avec peu de variabilité intergénotypique : il reste aux alentours de -15 bars avec un minimum de -12 bars pour SPM-40. La variabilité intragénotypique est également faible, cela souligne un comportement similaire entre les individus de même génotype. Une diminution du Ψ

est observée pour les individus stressés quelque soit le génotype. Néanmoins, ici la variabilité intragénotypique est très marquée. En effet, des extrêmes apparaissent comme un individu de génotype STR-10 ayant un Ψ

de -13 bars et un autre de génotype SPM-28 présentant une tension hydrique de plus de 35 bars. Cela signifie que les peupliers, malgré une soumission à une carence hydrique, continuent de puiser les ressources en eau du sol pour alimenter la transpiration foliaire et la photosynthèse. La transpiration étant donc toujours un minimum présente crée un appel d’eau formant de forte tension au sein des tissus foliaires. Néanmoins, certain génotype sont moins « gourmants » que d’autres, comme STR-10 qui limite le Ψ

à -20 bars donc probablement une consommation en eau plus faible, alors que des individus SPM-28 subissent de très forte tension dues à une forte transpiration. Ψ

étant une variable intégrative, l’interprétation des résultats reste délicate car englobe des processus différents.

3.1.3. Etat physiologique :

Les mesures de conductance stomatiques (gs) et d’assimilation carbonée (le niveau de photosynthèse, A) ont permit d’évaluer la capacité de fixation de carbone pour une quantité d’eau perdue. Les données d’efficacité d’utilisation de l’eau intrinsèque (WUEi, figure 13 ci-contre) sont analysées par une ANOVA à 2 facteurs. Elle a montré une différence significative entre les deux traitements pour tous les génotypes.

10

Figure 13 : Water Use Efficiency intrinsèque (WUEi) lors de l’arrêt du stress hydrique en fonction des génotypes de P.nigra. La WUEi met en évidence l’efficacité de fixation de carbone par molécule d’eau perdue (photosynthèse/conductance stomatique) chez les arbres témoins (bleu) et stressés (blanc). Les résultats sont représentés par une boîte à moustaches (n=2 répétitions biologiques). L’analyse statistique est réalisée avec une ANOVA 2 (α=0.05, p-value= 0.00527, ***p< 0.001 ; **0.001<p<0.01 ; *0.01<p<0.05).

Cela met en évidence que le métabolisme primaire est affecté par ce stress hydrique et se traduit par une diminution de fixation de carbone via la photosynthèse, excepté pour SPM-28. En effet, il faut distinguer deux groupes : dans le premier groupe, les génotypes stressés ALL-29, ERS-05, SPM-12, SPM-40 et STR-10, admettent une diminution de la WUEi. La variabilité de cette diminution est importante : par exemple la WUEi du génotype STR-10 subit une diminution d’environ 20% alors que celle du génotype SPM-12 avoisine les 95%. Cela signifie que certain génotypes tentent de conserver une intensité de production correcte tandis que d’autre diminue au minimum vital cette production, malgré un déficit hydrique foliaire (RWC, figure 10). Dans le deuxième groupe, le génotype SPM-28 présente des individus stressés avec une WUEi plus élevée de 20% par rapport aux témoins. Il semblerait que dans ce cas isolé, les individus SPM-28 privilégient la formation de biomasse et l’accentuerai même face à une carence hydrique. Ceci met en évidence que SPM-28, malgré les pertes en eau foliaire (RWC), maintient le niveau de production de matière végétale. Ce génotype pourrait être donc qualifié d’anisohydrique.

Cette hypothèse est soutenue par le fait que le Ψ

atteint des valeurs très négatives pour ce génotype : la tension hydrique est maximale dans la plante. Au contraire, SPM-12 semble stopper son métabolisme primaire (faible WUEi) pour adopter une stratégie de conservation de son eau. Ceci est typique d’un génotype isohydrique. Ici aussi le Ψ

appuie cette idée, pour ce génotype la tension hydrique minimale reste confinée au alentour des 20 bars, ce qui, néanmoins, représente un stress hydrique mais contrôlé et non un cruel manque de ressources hydrique comme l’on peut observer pour SPM-28 (RWC faible).

L’absence de différences significatives de cette variable entre les différents génotypes peut être due à un faible effectif observé : seulement 2 arbres par génotypes et par conditions ont pu être suivis pour la mesure de photosynthèse.

3.1.4. Importance de la voie transcellulaire du mésophylle :

La figure 14 (ci-contre) représente l’expression relative des aquaporines de type PIP2;4, PIP2;7 et PIP2;10 par génotype. L’accumulation des transcrits est significative chez les individus ERS-05 pour les PIP2;4 et PIP2;7 ainsi que chez le génotype SPM-40 pour les PIP2;10. Dans le cas du génotype STR-10, l’accumulation des transcrits pour les 3 types d’aquaporines semble seulement tendancielle puisque l’analyse statistique ne permet pas de conclure. Au contraire, le taux de transcrit diminue pour les individus du génotype SPM-12 notamment pour les transcrits des PIP2;7. Enfin, pour les génotypes ALL- 29 et SPM-28 les réponses sont plus hétérogènes. Dans le cas du génotype ALL-29, les transcrits des PIP2;4 diminuent, ceux des PIP2;7 semblent augmenter mais sans certitude, alors que l’expression des PIP2;10 ne semble pas affectée. Pour le génotype SPM-28, ce sont les transcrits des PIP2;7 qui diminuent significativement, alors que les transcrits des PIP2;10 semblent augmenter ; le taux de transcrits des PIP2;4 ne semble pas être modifié. La variation de quantité des transcrits viendrait en complément du processus de trafficking voire de régulations post-traductionnelles pour influencer la

11

Figure 14 : expression relative des transcrits codant les aquaporines PIP2;4, PIP2;7 et PIP2;10 de limbe de feuille pour les 6 génotypes de P.nigra en condition de stress. L’expression des PIP est calculée en suivant la méthode du 2ΔΔCt. L’abscisse représente la moyenne des quantités relatives de transcrits des témoins. Les barres au-dessus montrent une augmentation de transcription chez les individus stressés et inversement pour les barres en-dessous de l’abscisse (α=0.05, p-value de gauche à droite pour chaque génotype = (ALL-29 : 0.000246 ; 0.0747 ; 0,883) (ERS- 05 : 4.42x10^-05 ; 0.0231 ; 0.472) (SPM-12 : 0.0144 ; 3.55x10^-06 ; 0.035) (SPM-28 : 0.378 ; 5.53x10^-06 ; 0.0804) (SPM-40 : 0.549 ; 0.174 ; 0.0166) (STR-10 : 0.373 ; 0.0797 ; 0.699) ***p< 0.001 ; **0.001<p<0.01 ;

*0.01<p<0.05).

-2 ***

-101234

PIP2;4 PIP2;7 PIP2;10

Log 2 (Quantité Relative)

ALL-29

*** *

-1 0 1 2

PIP2;4 PIP2;7 PIP2;10

log2 (Quantité Relative)

ERS-05

*

***

* -3

-2 -1 0 1

PIP2;4 PIP2;7 PIP2;10

log2 (Quantité Relative)

SPM-12

-3 ***

-2-101234

PIP2;4 PIP2;7 PIP2;10

Log 2 (Quantité Relative)

SPM-28

* 0

1 2 3 4

PIP2;4 PIP2;7 PIP2;10

log 2 (Quantité Relative)

SPM-40

0 1 2 3 4

PIP2;4 PIP2;7 PIP2;10

log2 (Quantité Relative)

STR-10

quantité et la fonctionnalité des aquaporines présentent sur le plasmalemme. Ainsi plus le nombre de transporteurs d’eau sera important plus la quantité d’eau transitant par les cellules, alimentant la transpiration, sera important : c’est par exemple le cas du génotype SPM-12. Un autre schéma de réponse est l’accumulation de certains transcrits d’aquaporine qui aura au contraire l’effet d’accroitre les flux d’eaux de cellules à cellules permettant peut être à la plante de puiser plus efficacement les réserves d’eau du sol est ainsi maintenir son métabolisme.

L’étude moléculaire révèle une grande disparité entre les génotypes, alors qu’aucune différence n’est significative pour les réponses et comportements écophysiologiques. Cela peut être interpréter par le fait que chaque génotype et chacun des individus répondent différemment au niveau moléculaire pour un même niveau de stress.

3.2. Discussion

L’étude des caractéristiques écophysiologiques et des réponses moléculaires chez P.nigra, durant une carence hydrique, ont permit de déterminer deux comportements spécifiques de cette espèce représentés par les génotypes SMP-12 et SPM-28.

SPM-12 peut être qualifié de génotype isohydrique. Le temps mis par ce génotype pour rentrer en stress hydrique sévère semble être plus important que pour d’autres génotypes ce qui suggère ainsi une consommation d’eau relativement plus faible. En effet, le RWC de ce génotype n’est que peu modifié par la carence hydrique, alors que sa WUEi diminue grandement. Cela signifie que l’eau persiste dans la plante et notamment dans les feuilles. En contre partie, la transpiration étant minimale, le flux d’eau n’est pas suffisant (Ψ peu faible) pour alimenter la production de biomasse (photosynthèse faible). Ce ralentissement du flux d’eau pourrait être en partie expliqué par la diminution de transcription des gènes PIPs. En effet, cela induirait donc une réduction de la quantité de ces canaux au niveau du plasmalemme grâce au processus de trafficking : dans ce cas là, les PIPs agencées en tétramères au niveau de la membrane plasmique seraient décrochées de leur support pour être emprisonnées dans des vésicules cellulaires. Leur activité cessant, les molécules d’eau seraient retenues dans le cytosol pour réduire au maximum les pertes d’eau par transpiration. Chez SPM-12, la stratégie de conservation des ressources en eau foliaires passerait en partie par la régulation de la voie transcellulaire du mésophylle via le contrôle de la transcription des gènes PIPs.

A l’opposé, SPM-28 présente une stratégie anisohydrique. L’eau foliaire ne semble pas retenue chez ce génotype (RWC faible) ce qui est confirmé par une conductance stomatique plus forte que chez les autres génotypes : la transpiration foliaire entretient donc une légère perte d’eau. Malgré tout, le niveau de production de biomasse est maintenu, (photosynthèse et WUEi élevées).Il n’y aurait donc pas de stratégie de limitation de consommation en eau chez ce génotype en carence hydrique. Il serait intéressant de soumettre ce génotype en particulier à un stress hydrique supérieure au seuil de Ψ

=-20 bars pour

12

déterminer le moment de rupture de production de biomasse. L’antagonisme entre SPM-12 et SPM-28 n’est pas seulement au niveau physiologique mais également moléculaire. En effet, alors que SPM-12 présente une diminution homogène des transcrits de PIPs, SPM-28 lui observe une diminution uniquement pour les PIP2;7 mais une tendance à l’accumulation des transcrits de PIP2;4 et PIP2;10.

Ainsi, SPM-28 pourrait posséder d’autres moyens de parvenir à maintenir une hydratation foliaire suffisante pour conserver son métabolisme primaire en passant par exemple par l’accumulation de molécules protectrices augmentant l’osmolarité de la cellule (glycine betaïne ou proline par exemple).

Ainsi, la régulation de la transcription des aquaporines PIP constituerait une solution de dernier recourt.

Le génotype ALL-29 pourrait être qualifié de génotype à comportement intermédiaire. Il présente des caractéristiques similaires à celle du génotype SPM-28 (temps mis pour atteindre Ψ

=-20 bars et Ψ

sauf pour les valeurs de WUEi et de RWC qui sont intercalées entre les valeurs des génotypes SPM-12 et SPM-28. Il présente donc un équilibre entre consommation d’eau et production de biomasse sans tomber dans les schémas de réponses extrêmes. Son profil d’expression est aussi mitigé, seules les transcrits PIP2;4 sont moins exprimés. Cela semble modifier légèrement les flux d’eau in planta. Cette plasticité de réponses ne peut pas être expliquée uniquement par la régulation de la voie transcellulaire du mésophylle.

Il faut donc garder en mémoire l’existence d’autres acteurs régulant les flux d’eau foliaire. Il est important de noter que leur comportement respectif ne semble pas dépendre de l’origine des génotypes : en effet SPM-12 et SPM-28 présentent des réponses antagonistes malgré leurs origines géographiques communes (Loire). Pour les autres génotypes, il est difficile de tirer des conclusions en raison de la plasticité des réponses écophysiologiques et transcriptionnelles.

4. Conclusion et perspectives

Etant donné l’évolution rapide du climat vers un réchauffement global et une raréfaction des précipitations, les cultures et autres plantations seront soumises plus fréquemment à des périodes de carence hydrique. Il est nécessaire dans un premier temps de comprendre le fonctionnement hydrique d’une plante pour appréhender ses réponses face au stress hydrique et ainsi adapter les méthodes culturales au mieux pour limiter les pertes de production (biomasse des cultures). Et dans un deuxième temps, sélectionner des génotypes particuliers avec un schéma de réponse phénotypique dit «tolérant » à la sécheresse pour diminuer le taux de mortalité des plants et diminuer au maximum l’apport d’intrants (eau et produits phytosanitaires). L’expérience réalisée ici sur Populus nigra n’est que les prémices d’une plus grande étude de la variabilité de réponse de cette espèce face à une carence hydrique. Des bases ont été ainsi données et ont fait apparaitre de nouvelles pistes. Nous appréhendons maintenant mieux les caractéristiques de l’état hydrique des génotypes au comportement hydrique spécifique face à une carence hydrique. Nous pouvons y joindre une raison moléculaire qui est une modification des profils de

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transcription des aquaporines de type PIPs. Il a été déduis de cette expérience deux génotypes possédant tout deux un comportement et un profil d’expression bien spécifiques : SPM-12 et SPM-28.

Les pistes soulevées ne restent que hypothétiques, en effet les résultats ne font ressortir, malheureusement, que des tendances. Pour préciser les conclusions des analyses, il est indispensable d’augmenter l’effectif pour diminuer la variation intragénotypique qui pourrait fausser les analyses statistiques (notamment pour les mesures de photosynthèse). De plus, les données étudiées sont composées de variables intégratives c’est-à-dire qui regroupes plusieurs variables, ainsi il est difficile d’imaginer ce que ce type de variable signifie biologiquement au sein de la plante. Il serait peut être judicieux de réaliser des tests statistiques de type ACP (Analyse en Composante Principale), permettant de définir des variables qui mériterait d’être approfondies et suivies plus minutieusement. D’autres acteurs que les aquaporines sont à soupçonner dans la régulation des flux d’eau dans la feuille, par exemple une étude de l’architecture foliaire apporterai des réponses sur l’adaptation morphologique au stress hydrique. Il peut s’envisager une visualisation 3D du réseau de nervation foliaire grâce à la technologie tomographique.

4.1.Apports personnels

La réalisation de ce stage de 8 semaines dans le domaine de l’écophysiologie m’a permit d’acquérir de nouveaux savoir-faire et d’améliorer des connaissances déjà acquises l’an passé. En effet, ayant déjà réalisé une expérience dans ce domaine l’été dernier, accompagné par Jean-Stéphane Venisse et Beatriz Muries-Bosch, ce stage de Master 1 m’a permit d’approfondir mon savoir et de me rendre conte du labeur à fournir pour mener à bien une expérimentation dans son intégralité. J’ai appris qu’il est nécessaire de fournir des efforts pour accomplir un travail de qualité, aussi bien de paillasse qu’intellectuel, sans oublier que ce stage a mis à l’épreuve mon habilité à prendre des décisions, discuter et exposer mes idées à mon équipe et prendre des initiatives pour le bon déroulement des manipulations. La motivation est une qualité première pour être chercheur, il faut être prêt à faire des sacrifices pour l’avancer de ses recherches et l’obtention de résultats.

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